Summary
Mutagenesis bisulfite הוא תקן הזהב לניתוח מתילציה בדנ"א. פרוטוקול שונה שלנו מאפשרת ניתוח מתילציה דנ"א ברמת מתחיל מתא בודד ותוכנן במיוחד עבור ביציות נפרדות. זה יכול לשמש גם המחשוף בשלב עוברי.
Abstract
אפיגנטיקה מקיפה את כל תורשתי ושינויים הפיך כדי הכרומטין כי הנגישות אלתר הגן, וכך הם המנגנונים העיקריים בוויסות שעתוק הגנים 1. מתילציה DNA הוא שינוי epigenetic שפועל בעיקר כסימן הדיכוי. באמצעות תוספת קוולנטי של קבוצת מתיל על cytosines ב dinucleotides CPG, הוא יכול לגייס חלבונים דיכוי נוספים ושינויים היסטון ליזום תהליכים המעורבים עיבוי הכרומטין השתקת גנים 2. מתילציה דנ"א חיוני להתפתחות נורמלית כפי שהיא משחקת תפקיד קריטי תכנות התפתחותי, התמיינות תאים, הדיכוי של אלמנטים retroviral, כרומוזום ה-X איון ו החתמה גנומית.
אחת השיטות החזקות ביותר לניתוח מתילציה בדנ"א הוא mutagenesis bisulfite. Bisulfite נתרן הוא mutagen דנ"א deaminates cytosines אל uracils. בעקבות הגברה seque PCR ו ncing, אירועים אלה המרה מזוהים כמו thymines. Cytosines מפוגל מוגנים מפני deamination ובכך להישאר cytosines, המאפשר זיהוי של מתילציה בדנ"א ברמת נוקלאוטיד יחיד 3. פיתוח assay mutagenesis bisulfite התקדמה מאלה דווח במקור 4-6 כלפי אלה הרגישים יותר לשחזור 7. אחד היה המפתח להתקדמות הטמעת כמויות קטנות יותר של דנ"א חרוז agarose, ובכך להגן על ה-DNA מטיפול bisulfite הקשה 8. ניתוח זה מתילציה מופעל להתבצע על בריכות של ביציות ו בשלב הבלסטוציסט ועוברים 9. Mutagenesis המתוחכמת ביותר bisulfite פרוטוקול עד כה היא בשלב הבלסטוציסט עוברים בודדים 10. עם זאת, מאז blastocysts יש על 64 תאים הממוצע (המכיל 120-720 PG של הדנ"א הגנומי), שיטה זו אינה יעילה ללימודי מתילציה על ביציות בודדים או מחשוף בשלב עוברים.
אוהל "> לוקח רמזים מן הטבעה agarose כמויות הדנ"א דקות כולל 11 ביציות, כאן אנו מציגים שיטה לפיה ביציות מוטבעים ישירות agarose ו תמוגה פתרון חרוז אחזור מיד לאחר והסרה של pellucida Zona מן הביצית. זה מאפשר לנו לעקוף את שני האתגרים העיקריים של mutagenesis ביצית אחת: bisulfite. המגנים על כמות זעירה של דנ"א, השפלה ואובדן הבאים במהלך השלבים פרוטוקול רבים חשוב לציין, כאשר הנתונים מתקבלים ביציות בודדות, סוגיית ההטיה PCR בתוך בריכות מסולק יתר על כן. , זיהום מכוונת התא תלולית ניתן לזהות על ידי שיטה זו שכן כל המדגם עם דגם אחד או יותר של מתילציה ניתן נכללו בניתוח 12. פרוטוקול זה מספק שיטה משופרת עבור ניתוחים מוצלחים לשעתקו של מתילציה בדנ"א ברמת מתחיל מתא בודד והוא אידיאלי עבור ביציות נפרדות, כמו גם מחשוף בשלב עוברים.Protocol
יום 1
הכן את הפתרונות הבאים טריים ביום של איסוף הביצית עם מים, סטרילי כמו מים מזוקקים GIBCO. כדי להקטין את הסיכוי לזיהום ה-DNA, לשנות לעיתים קרובות ולהשתמש בכפפות טיפים הסינון. לשמור על צינורות בזווית משם, כאשר פתח את לסכם את כל צינורות כאשר אינו בשימוש. אנו ממליצים פתרונות מורכבים כמו N +1.
3% LMP agarose
30 מ"ג נקודת התכה נמוכה (LMP) agarose
עד 1 מ"ל GIBCO H 2 O
לפזר @ 70 ° C
תמוגה פתרון
8 תמוגה μl חיץ
1 μl proteinase K
1 IGEPAL 10% μl
מקום על הקרח עד מוכן לשימוש
02:01 agarose: פתרון תמוגה (10 μl לכל ביצית יחיד, הסכום הוא עבור 3 ביציות)
20 μl 3% LMP agarose
10 תמוגה μl פתרון
לערבב @ 70 ° C
SDS קונגאחותי מאגר (501 μl לכל ביצית יחיד)
| 1x TE-pH 7.5 | 450 μl |
| 10% SDS | 50 μl |
| Proteinase K | 1 μl |
| 501 μl |
1. הביצית אוסף
- מניחים את העכבר oviducts גזור בתקשורת M2, ולקרוע ampullae כדי לחלץ את מורכבות התא תלולית.
- הפרד את ביציות מתסביך תלולית התא באמצעות 0.3 מ"ג / מ"ל פתרון hyaluronidase בטיפת μl 30 של מדיה מסוג M2. לשמור על ביציות בתמיסה רק כל עוד מה שנדרש כדי להסיר את התאים קומולוס, כמו חשיפה ממושכת עלולה לפגוע בהם. לשטוף את פי 3 ביציות לירידה של 30 μl מדיה מסוג M2, הסרת תאים קומולוס מעת לעת.
- הסר את pellucida Zona באמצעות הפתרון של tyrode חומצי. מניחים את ביציות בטיפת 30 1 μl של הפתרון הראשון, ולאחר מכן להעביר למקום אחר 30ירידה μl, כמו כל מדיה שבוצעו לאורך יהיה לדלל את החומצה ולהפחית את יעילות השיטה. לשמור על ביציות בתמיסה רק כל עוד זה לוקח להסיר Zona, כמו חשיפה ממושכת עלולה לפגוע בהם. הערה: ריכוז מוגבר של פתרון חומצי של tyrode או pronase יכול לשמש דגימות האדם, כמו האדם Zona pellucida הוא עמיד יותר לטיפול עם פתרון חומצי של tyrode מאשר העכבר.
- לשטוף את הביציות פעם נוספת ירידה של 30 μl התקשורת M2.
2. Agarose הטבעת ואת תמוגה
- כדי לבצע הטבעה agarose, הצב את הפתרון תמוגה על 70 מעלות צלזיוס heatblock. הוסף שחומם מראש LMP agarose לפתרון תמוגה, ייצור 02:01 agarose: פתרון תמוגה.
- מניחים הביצית אחת לשקופית כוס נקייה בתקשורת מסוג M2 מינימלית. קח את 10 μl של agarose: פתרון תמוגה אל קצה פיפטה, ו (תחת מיקרוסקופ) לגרש בעדינות כמות קטנה (~ 1 μl או פחות) על גבי שקופית זכוכית, המאפשר לה לערבב עם המיניםאל התקשורת. בעדינות להרים את הביצית אל קצה פיפטה ולשים את כל μl 10 לתוך צינור Eppendorf עם שמן מינרלי 300 μl כך חרוז יוצרת כדור.
הערה: תהליך זה חייב להיעשות די מהר כמו agarose יקשיח אם הטמפרטורה יורדת מעט ככל 5 מעלות צלזיוס מתחת 70 ° C. - דגירה צינור על קרח במשך 10 דקות. כדי לבצע תמוגה, להסיר את שמן מינרלי 300 μl ולהוסיף 500 μl של למאגר תמוגה SDS. דגירה לילה אמבט מים 50 מעלות צלזיוס.
הערה: פתרון תמוגה (טבלה 1) עשוי לשמש גם למטרה זו.
יום 2
הכן את הפתרונות הבאים טריים ביום mutagenesis bisulfite. כדי להפחית את הסיכוי של זיהום ה-DNA, לשנות לעיתים קרובות ולהשתמש בכפפות טיפים הסינון. לשמור על צינורות בזווית משם, כאשר פתח את לסכם את כל צינורות כאשר אינו בשימוש. אנו ממליצים פתרונות מורכבים כמו N +1.
| 3 מ 'NaOH | <td> 2.4 גרם NaOH ב 20 מ"ל autoclaved DDH 2 O|
| 0.1 מ 'NaOH | 0.5 מ"ל של 3M ב 14.5 מ"ל autoclaved DDH 2 O |
| 0.3 מ 'NaOH | 1.5 מ"ל של 3M ב 13.5 מ"ל autoclaved DDH 2 O |
2.5 מ 'פתרון bisulfite
- 3.8 גרם נתרן bisulfite
5.5 מ"ל GIBCO מזוקקים H 2 O
1 מ"ל 3 M NaOH
לפזר @ בטמפרטורת החדר - 110 מ"ג הידרוקינון
1 מ"ל GIBCO מזוקקים H 2 O
לפזר @ 90 ° C (רק כל עוד הוא לוקח לפרק, לערבב באופן קבוע)
כאשר נמס לגמרי, מערבבים פתרון (א) ו - (ב)
* הרחק * אור
3. Bisulfite mutagenesis
- להסיר באופן מלא 500 μl חיץ SDS תמוגה ולהוסיף שמן מינרלי 300 μl (~ 20 שעות). כל המאגר תמוגה שנותר מדללים הדואר agarose כאשר הוא מחומם חרוז יהיו רגישים יותר המסת בשלבים הבאים. להמשיך mutagenesis bisulfite באופן מיידי, או בחנות ב -20 ° C עד 5 ימים.
- אם ישים, הסר ביציות מהמקפיא ולתת ההפשרה (רק עד agarose חרוז הוא שקוף יחסית). דגירה של 2.5 דקות על גוש חום 90 מעלות צלזיוס, שבעקבותיה דגירה על קרח במשך 10 דקות.
הערה: אין לערבב או לבחוש, להאריך יותר מ -2.5 דקות, או תנודות הטמפרטורה. - כדי לבצע denaturation, להסיר את שמן מינרלי ולהוסיף 1 מ"ל NaOH 0.1M כדי קפיצי כל הצינור, וכן להפוך 5-6 פעמים.
- דגירה במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס waterbath, היפוך כל 3-4 דקות. חרוז צריך לצוף NaOH.
- כדי לבצע טיפול bisulfite, לסובב את הצינור בעדינות, ולאחר מכן להסיר את NaOH ומוסיפים שמן מינרלי μl 300 ו 500 הפתרון bisulfite μl. דגירה צינור עבור 3.5 שעות ב 50 ° C waterbath. * הרחק * אור הערה: משך הדגירה ייתכן שיהיה צורך לקבוע באופן אמפירי על הגן של עניין.
- כדי לבצע desulfonation, דגירה על קרח במשך 3 דקות, ולאחר מכן להסיר את שמן מינרלי והפתרון bisulfite, לסובב בעדינות, ולהוסיף 1 מ"ל NaOH 0.3 מ '. פליק והפוך 5-6 פעמים.
- דגירה במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס waterbath, היפוך כל 3-4 דקות. חרוז צריך לצוף NaOH.
- לשטוף את הדגימות, על ידי 1 מסתובב בעדינות, ולאחר מכן להסיר את NaOH ולהוסיף 1 מ"ל 1x TE pH 7.5. ללחוץ למשך 5-10 דקות בטמפ 'החדר (על שייקר). לסובב בעדינות שוב, ואז להסיר את TE 1x. חזור על תהליך הכביסה פעמיים.
- הוסף 1 מ"ל autoclaved DDH 2 א ' ללחוץ למשך 5-10 דקות בטמפ 'החדר (על שייקר). לסובב בעדינות, ולאחר מכן להסיר את H 2 O. חזור על DDH 2 O לשטוף פעמיים.
- בדוק את ה-pH של supernatant, זה צריך להיות 5.0 pH. אם עדיין בסיסי מדי, לכבס שוב עם H 2 O. הסר את כל supernatant, ומשאיר רק agarose להיותהמודעה.
4. 1 ו 2 nd הגברה עגול PCR
- הכן -1 עגולים ה-PCR ** לערבב תוך כדי שטיפת **
| 10 מיקרומטר החיצונית קדימה פריימר | 0.5 μl |
| פריימר 10 מיקרומטר החיצונית הפוך | 0.5 μl |
| 240 ng / ml tRNA | 1 μl |
| H 2 O | 13 μl |
הוסף Illustra Ready-To-Go חם חרוזים התחל ה-PCR
בזהירות החלק המוצק agarose חרוז לתוך הצינור PCR (~ 10 μl)
חום עד 70 מעלות צלזיוס ומערבבים
הוסף 25 μl שמן מינרלי
סך הכל: 50 μl
- להגביר
הערה: בדוגמה של תנאים אופניים העכבר Snrpn הוא denaturation למשך 2 דקות ב 94 מעלות צלזיוס, ואחריו 40 מחזורים של 30 שניות על 94 מעלות צלזיוס, 1 דקות ב 50 מעלות צלזיוס, ו 1דקות ב 68 מעלות צלזיוס, ואת התארכות השלב האחרון 10 דקות ב 68 ° C. חישול בטמפרטורה של 1 st סבב ה-PCR על העכבר H19 ו Peg3 היא 50 ° C. - להכין 2 nd בסיבוב PCR תמהיל
| 10 מיקרומטר פנימי קדימה פריימר | 0.5 μl |
| פריימר 10 מיקרומטר הפנימי הפוך | 0.5 μl |
| H 2 O | 19 μl |
הוסף Illustra Ready-To-Go חם חרוזים התחל ה-PCR
הוסף 5 1 μl רחוב עגול המוצר כתבנית. מחממים את המוצר סיבוב 1 st עד 70 ° C למשך דקה 1 לרכך את agarose. הקפד פיפטה מתחת לשכבה של שמן מינרלי.
הוסף 25 μl שמן מינרלי
סך הכל: 50 μl
הערה: רצפים פריימר מקוננות עבור Snrpn, H19 ו Peg3 ניתן למצוא בשוק Velker ואח' 10,12.
- להגביר
הערה: תנאי רכיבה על העכבר Snrpn הוא denaturation למשך 2 דקות ב 94 מעלות צלזיוס, ואחריו 40 מחזורים של 30 שניות על 94 מעלות צלזיוס, 1 דקות ב 50 מעלות צלזיוס, ו 1 דקות ב 68 מעלות צלזיוס, ואת התארכות 10 דקות הסופי צעד אחר צעד 68 ° C 10. עכבר H19 ו Peg3 דורשים 50 ° C חישול בטמפרטורה של 2 nd סבב ה-PCR. - כמבחן דיאגנוסטי, דגימות הסיבוב השני ניתן לחתוך עם אנזימי הגבלה, כי הוא מתילציה או זן ספציפי.
| 2 nd המוצר עגול | 4 μl |
| אנזים הגבלה | 1 μl |
| חיץ | 1 μl |
| H 2 O | 4 μl |
- Electrophorese המוצרים העיכול על ג'ל acrylamide 8%. כל להקות הטרוגניות מייצגים יותר מ 1 sequeNCE.
5. ת"א שיבוט המושבה PCR
- לשבט 2 nd המוצר עגול, חום 1 עד 70 ° C למשך דקה 1 לרכך את agarose, ולקשור מכן לתוך וקטור באמצעות pGEM-T Promega וקטור המערכת (פישר סיינטיפיק חתול # A1360).
| 2 nd עגול PCR | 1 μl |
| pGEMT-EASY וקטור | 1 μl |
| Ligase | 1 μl |
| H 2 O | 2 μl |
| קשירת 2x מאגר | 5 μl |
דגירה לילה @ 4 ° C במכונת ה-PCR.
- להפשיר המוסמכות בתאי E.coli על קרח למשך 15 דקות (Zymo מחקר חתול קורפ # T3009). הוסף תגובה 3 קשירת μl עד 8 μl E.coli ו קשירת דגירה על קרח במשך 15 דקות.
- חום הלם במשך 40 שניות ב 42 מעלות צלזיוס waterbath,ו דגירה על קרח במשך 2 דקות. הוסף 60 μl בינוני SOC ו דגירה על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 (ב שייקר).
- מניחים את כל תערובת התגובה על צלחת LB / אגר / IPTG / Xgal / מגבר ואת לוחית דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- להכין תערובת PCR המושבה
| M13 20 מיקרומטר קדימה פריימר | 0.7 μl |
| M13 20 מיקרומטר הפוך פריימר | 0.7 μl |
| 5X הירוק Go Taq מאגר | 7.0 μl |
| 10 mM dNTP | 0.7 μl |
| Taq פולימראז ה-DNA | 0.28 μl |
| H 2 O | 25.62 μl |
| סה"כ 35 μl |
הוסף 35 μl המושבה PCR מיקס מאסטר לתוך צינור ה-PCR. בחר המושבה חיידקי לבן צלחת עם קצה פיפטה, ו מערבולת אותה התגובה PCR.
- להגביר עם denaturation במשך 10 דקות ב 94 מעלות צלזיוס, ואחריו 30 מחזורים של 45 שניות על 94 ° C, 30 שניות על 57 ° C, ו 1 דקות ב 72 מעלות צלזיוס, ואת התארכות השלב האחרון 10 דקות ב 72 ° C. Electrophorese 4 μl על 1.5% agarose ג'ל. שלח ~ 30 μl של מוצר ה-PCR עבור סידור.
הערה: ביציות, 5 המושבה מוצרי ה-PCR הם רצף. - לאחר רצף תוצאות מתקבלים, תבניות מתילציה ניתן לקרוא. CG כל המקורי נשאר כמו CG היה מפוגל, וכל CG המקורית עכשיו TG היה unmethylated.
6. נציג תוצאות
בעבודתנו, אנו assay טבוע מתילציה של ביציות ועוברים בודדים (איור 1). בעקבות הגברה PCR מקונן באמצעות primers bisulfite המרה, ניתן לאשר המרה מוצלחת של הדמיה גודל שבר נכונה על ג'ל agarose (איור 2). הביצית הפרטמייצג את אחד ההורים אלל, ולהלכה, יש אחד דפוס מתילציה מוטבע. לפיכך, סיבוב שני מוצרים PCR יכול להיבדק על זיהום מכוון. אנזים הגבלה רגיש מתילציה דנ"א (כגון HinfI או DpnII) ניתן להשתמש כדי לעכל את המוצר השני בסיבוב PCR להעריך אם הוא מכיל אלל מפוגל או unmethylated (איור 3). C מפוגל בתוך רצף ההכרה האנזים הוא ביקע בעוד C unmethylated כי מומר T מוכרת כבר על ידי האנזים והוא לא חתוך. מדגם כל הביצית MII המכיל גם מפוגל ו אללים unmethylated אמור להיות מושלך, כפי שהוא מעיד על זיהום תלולית תאים (איור 3). בעקבות קשירת ושינוי, מצליח הגברה PCR המושבה ניתן דמיינו על ג'ל agarose על מנת להבטיח דגימות עם גודל המוצר הנכון נשלחים על רצף (איור 4). לבסוף, רצף של CL 5 הפרטאלה של הביצית MII צריך לייצר חמישה דפוסי מתילציה זהים זהים המרה nonCpG שיעורי (5 א 'איור). דגימות כל המכילים יותר מ 1 דפוס אמור להיות מושלך (5 ב 'איור). מאז הביוץ ביציות MII יש שני עותקים כרומוזום או גוף קוטבי המצורפת, קיימת אפשרות לקבלת שני דפוסי רצף דומה (איור 5 ג). אנו ממליצים נתונים משליכים מ ביציות בעלי דפוסי מתילציה שאינם דומים ביותר מאז התא זיהום תלולית לא ניתן לשלול.
באיור 1. סכמטי של assay הביצית יחיד bisulfite mutagenesis.
באיור 2. נציג תוצאות הגברה 2 nd עגול Snrpn מ סינגLe MII הביצית על ג'ל agarose 1.5%. מסלולים 1-4 ארבעה ביציות בודדות MII וליין 5 הוא פקד שלילית (ללא הביצית). גודל amplicon הצפוי Snrpn הוא 420 נקודות בסיס. , L הסולם.
באיור 3. נציג תוצאות סיבוב 2 nd העיכול הגבלת מתילציה ספציפי עבור Snrpn מן הביצית MII יחיד על ג'ל acrylamide 8%. העיכול HinfI הגבלת אבחון מראה DNA unmethylated בחובה T זה מבטל את האתר ההגבלה (420bp, ליין 1) או דנ"א החומר מתיל המכיל C בתוך אתר ההכרה (חתך, 262, 103, ו - 54 נקודות בסיס, מסלול 2). עיכול מראה גם מפוגל ו unmethylated אנזים ההגבלה אתרים (להקות לחתוך & Uncut, ליין 3) מעידים על זיהום התא תלולית. , L הסולם.
באיור 4. Snrpn מן הביצית MII יחיד על 1.5% agarose ג'ל. גודל amplicon צפויה בעקבות קשירת Snrpn לתוך וקטור pGEM-T קל ושימוש M13 קדימה primers הפוכה הוא 656 נקודות בסיס. ליין 1-8, 1-8 amplicons של שיבוטים. Clone 5 יש גודל amplicon שגוי ולא יש לשלוח על רצף.
איור 5. נציג רצף התוצאות עבור Snrpn מן הביצית MII אחד. Snrpn הוא מפוגל ב ביציות. עיגולים שחורים מצביעים CpGs מפוגל. עיגולים לבנים מצביעים CpGs unmethylated. מספר מיקום CPG והוא נציג של העכבר נקבה B6 מתח. א) צפוי רצף התוצאות עבור Snrpn מן הביצית MII אחת. רק גדיל בודד של DNA צריך להגביר בכל חמישה שיבוטים. ביציות עם דפוס מתילציה אחת להג זהה ללא המרה CPGn יש לכלול בניתוח (אחוז ההמרה of-CpGs שאינם הצביעו ימינה חושב כמו מספר לא CPG cytosines המרה תימין כאחוז הלא CPG cytosines הכולל של הפורום). ב) רצף התוצאות עבור Snrpn מן הביצית MII אחת עם זיהום התא תלולית. הערה שוני בין מדינות מתילציה ודפוסי המרה המצביעים על הגברה גדיל נפוצה. ג) סידור תוצאות Snrpn מן הביצית MII יחיד עם שני עותקים כרומוזום או ההכללה הגוף הקוטב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
זה assay ביצית אחת מכיל שלבים רבים עם מספר כי הם קריטיים ודורשים טיפול מיוחד. הראשונה היא שטיפת הביצית. זה חשוב במיוחד כדי לשטוף כל הביצית מספר פעמים בינוני טרי טיפות לאחר הטיפול hyaluronidase כדי להסיר תאים קומולוס רבים ככל האפשר. יתר על כן, בעת העברת ביציות לפתרון חומצי של tyrode להסרת pellucida Zona לוודא סביב המדיום ברור של תאים קומולוס. הביצית דביק מאוד לאחר הסרת Zona, ואת כל התאים הסמוכים קומולוס יכול בקלות להיות דבוק הביצית. קשה מאוד להסיר תא תלולית כי הוא דבק הביצית Zona חינם. בעוד פרוטוקול זה מאפשר זיהוי של זיהום התא תלולית בנקודות זמן מה לאחר מכן, לא בונה, ולא כלכלית, לעבור את הפרוטוקול המלא על ביציות כי צפויה להיות מושלך.
שלב קריטי השני הוא הטמעת הביצית. כאשר הטבעה הביצית ב agarose ו ליסהפתרון, חשוב לציין כי נקודת התכה נמוכה (LMP) agarose יקשיח בטמפרטורות קטנה כמו 5 מעלות צלזיוס מתחת 70 ° C. לפיכך, מומלץ לערבב agarose פתרון תמוגה על 70 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן הצבת הביצית הפרט בשקופית זכוכית בינוני מינימלית. ברגע מוכן, פיפטה פתרון agarose / תמוגה ולהטביע הביצית לתוך צינור Eppendorf מוכן תחת שמן מינרלי, באופן זהיר עדיין בזמן.
זה קריטי, כי איון החום של K proteinase להתבצע על 90 מעלות צלזיוס במשך 2.5 דקות. סטייה זו אינה מומלצת. טמפרטורות גבוהות או שעות ארוכות יותר עלול לגרום נזק DNA, ואילו טמפרטורות נמוכות או שעות קצרות יותר לא יכול להשבית ק proteinase
להזכירך, bisulfite נתרן הידרוקינון הם רגישים לאור. הפתרונות צריכים להיות מוכנים ואז עטוף בנייר כסף, כתום צינורות ו / או להציב במגירה חשוכה עד לשימוש. לאחר פתרון bisulfite נוספה tהוא הצינור, הצינור צריך להיות מכוסה בנייר כסף או שקית מכוסה כהה כאשר דוגרים על 50 ° C. אנו משתמשים בשקיות ריקות לסכל מ GE Healthcare שבמקור הכיל את חום התחלה חרוזים ה-PCR.
בסופו של דבר, כמו עם רוב PCRs, מומלץ להכין בכל סיבוב מבעוד מועד. עיכובים מוגזמות, במיוחד לאחר ערבוב ב 70 ° C, תפחית את שיעור ההצלחה של הגברה.
בשלב הנוכחי, מגבלה אחת של הפרוטוקול הוא כי שיעור ההצלחה של הגברה המרה מ-DNA bisulfite ביציות נפרדות נע בין 40% עד 65% בהתאם שבר את הגן מוגבר. בעוד נוסף בעיות הירי עלול להגביר את אחוז, אין תחלופה בין טיפול ההמרה bisulfite להיות ארוך מדי או קשה לא מספיק שיש שיעורי ההמרה (> 85-90%). המגבלה השנייה היא כיום mutagenesis bisulfite אינו יכול להבחין בין הדיכוי 5-methylcytosine ו demethylation ביניים 5-Hydroxymethylcytosine 13.
מספר שינויים עשויים להידרש על בסיס גנטי או באזור של עניין. זמן ההמרה bisulfite עשויים לדרוש אופטימיזציה של אחוז ההמרה הגבוה ביותר עם נזק DNA הנמוך ביותר. אנו מציעים מגוון של 2.5 עד 4 שעות (במרווחים של שעה וחצי) לטיפול bisulfite. אופטימיזציה נוספת יכולה לכלול עיצוב PCR פריימר על רצפים המרה של עניין (לדוגמה http://www.urogene.org/methprimer/ ), כמו גם אופטימיזציה של תוכניות ה-PCR על בסיס אורך קטע ותוכן CG (ראו Patterson et al. עבור נוספים mutagenesis bisulfite אפשרויות מיטוב 7). השינוי האחרון הוא כי מיצוי ג'ל של המוצר 2 nd PCR עגול עשוי להידרש אם יש שפע למוצרי פריימר הדימרים או שאינם ספציפיים amplicons כי ישתלב וקטור כאשר משובטים.
הראינו בעבר כיפרוטוקול זה יחול על יחידים ביציות MII 12. בדקנו גם את יעילותה על ביציות גידול בטווח של הביצית בקטרים שונים, עם שיעור זהה של הגברה מוצלחת של ה-DNA המרה. חשוב לציין, לעומת אחרים mutagenesis נהלים bisulfite, שהם לא יעיל ללימודי מתילציה על תא יחיד, פרוטוקול זה מאפשר ניתוח של מתילציה בדנ"א של ביציות ועוברים בודדים המוקדמות. זה חיוני ללימודי ביולוגיה הרבייה התפתחותי, במיוחד בכל הקשור המניפולציות של בתאי הנבט ועוברים המוקדמות. יישומים עתידיים עשויים לכלול ניתוח של דפוסי מתילציה DNA בתאים בודדים ממקור כלשהו, כולל בתאי vivo הנגזרות ותרבותיים. בנוסף, פיתחנו assay הבלסטוציסט הפרט משחזרת DNA ו-RNA של העובר אותו, המאפשר ביטוי הן ונתונים מתילציה שיופק. יישום עתידי יכלול שינוי singlהביצית assay דואר להתאושש RNA עבור ניתוחים ביטוי, כמו גם ה-DNA של מבחני מתילציה. אופטימיזציה נוספת תהיה לבצע מבחני דופלקס הביצית אותו, בדומה אל חאג' ואח' 14, שיאפשרו זיהוי מתילציה של גנים מפוגל גופנית הביצית, עובר, unmethyated, ובכך מתיר גילוי של זיהום התא תלולית.
מתילציה ניתוח ה-DNA יכול לנוע בין הגנום כולו אל מוקד ספציפי. הגנום כולו שיטות כגון immunoprecipitation DNA מפוגל (MeDIP) בשיתוף עם microarrays או רצף בדרך כלל דורשים כמויות שפע של חומר. לוקוס ספציפיים שיטות הכוללות בשילוב הגבלה bisulfite ניתוח (COBRA) באמצעות מתילציה ספציפיים אנזימי הגבלה, או ערכת MethylDetector (מוטיב פעיל), הם פחות אופטימלית עבור ניתוחים הבלסטוציסט בודדות, וכתוצאה מכך התאוששות מספקת של ה-DNA, PCR הטיה וחוסר שחזור. גישה חלופית כדי הביצית דואר אחתניתוח קארלי מתילציה העובר ניצלו את ערכת EZ-DNA מתילציה (Zymo מחקר) עם bisulfite דילול מוגבל pyrosequencing טכניקה 14, אם כי שיעורי ההצלחה המדווחים של הגברה המרה bisulfite DNA היה נמוך יותר מאשר השיטה המתוארת כאן.
Mutagenesis bisulfite הוא תקן הזהב לניתוח מתילציה דנ"א, וזה ברור כי ניתוח של תאים בודדים היא צעד חשוב קדימה. הטבעה agarose מאפשר גודל מדגם קטן כדי להיות מנותח עם טיפול bisulfite, כמו agarose מגן מפני השפלה DNA ומונע אובדן DNA במהלך השלבים פרוטוקול רבים. עם זאת, בהשוואה הבלסטוציסט, ביצית אחת יש כ 3-6 PG-DNA הגנומי. פרוטוקול שונה שלנו, מטביע ביציות בודדות במאגר תמוגה agarose המכיל, מונע אובדן תחילת ה-DNA בשלב הראשוני תמוגה מתונים טיפול bisulfite קשה. לסיכום, היתרון של ניתוח ביצית אחת הוא שהיא מאפשרתזיהוי של זיהום תלולית מכוונת התא, כמו גם חשיפת אירועים נדירים ביטול כל הטיות PCR ב אספו דגימות. בסך הכל, זה פרוטוקול שונה מספק מידע איכותי על מצב מתילציה של ביציות ועוברים בודדים המוקדמות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים אין לי מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי אוניברסיטת מערב אונטריו, החוג למיילדות וגינקולוגיה, ומענק ER06-02-188 מהמחקר Ministryof וחדשנות, פרס חוקר הקדומה. אכפת נתמך על ידי תוכנית אימון CIHR ב שכפול, בהתפתחות המוקדמת ואת ההשפעה על מלגה (REDIH) בוגר הבריאות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oocyte Collection | |||
| Hyaluronidase | Sigma | H4272 | |
| Acidic Tyrode | Sigma | T1788 | |
| Proteinase K | Sigma | P5568 | |
| 10% IGEPAL | Bioshop | NON999.500 | |
| Lysis Solution | |||
| Tris pH 7.5 | Bioshop | TRS001.5 | |
| LiCl | Sigma | L9650 | |
| EDTA pH 8.0 | Sigma | E5134 | |
| LiDS | Bioshop | LDS701.10 | |
| DTT | Invitrogen | P2325 | |
| SDS Lysis Buffer | |||
| TE pH 7.5 | Bioshop(Tris)Sigma (EDTA) | TRS001.5 E5134 | |
| 10% SDS | Bioshop | SDS001.500 | |
| Bisulfite Conversion | |||
| Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | |
| Sodium Hydrogensulfite (Sodium Bisulfite) | Sigma | 243973 | |
| Hydroquinone | Sigma | H9003 | |
| Low Melting Point (LMP) Agarose | Sigma | A9414 | |
| Mineral Oil | Sigma | M8410 | |
| M2 Medium | Sigma | M7167 | |
| GIBCO Distilled water | Invitrogen | 15230-196 | |
| Autoclaved double distilled (dd) water | |||
| PCR | |||
| Illustra Hot Start Mix RTG | GE Healthcare | 28-9006-54 | |
| 240 ng/ml yeast tRNA | Invitrogen | 15401-011 | |
| Inner and outer nested primers | Sigma | ||
| Ligation | |||
| Promega pGEM-T Easy Vector | Fisher Scientific | A1360 | |
| TA Cloning | |||
| Competent E.coli cells | Zymo Research Corp. | T3009 | |
| Equipment | |||
| Dissecting Microscope | |||
| 70 °C and 90 °C Heat Blocks | |||
| 37 °C and 50 °C Waterbaths (42 °C for transformations) | |||
| Rocker | |||
| PCR machine |
References
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat. Genet. 33, 245-254 (2003).
- Rodenhiser, D., Mann, M. Epigenetics and human disease: translating basic biology into clinical applications. CMAJ. 174, 341-348 (2006).
- Frommer, M. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 1827-1831 (1992).
- Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. High sensitivity mapping of methylated cytosines. Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).
- Feil, R., Charlton, J., Bird, A. P., Walter, J., Reik, W. Methylation analysis on individual chromosomes: improved protocol for bisulphite genomic sequencing. Nucleic Acids Res. 22, 695-696 (1994).
- Raizis, A. M., Schmitt, F., Jost, J. P. A bisulfite method of 5-methylcytosine mapping that minimizes template degradation. Anal. Biochem. 226, 161-166 (1995).
- Patterson, K., Molloy, L., Qu, W., Clark, S. DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis. J. Vis. Exp. (56), e3170 (2011).
- Olek, A., Oswald, J., Walter, J. A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 24, 5064-5066 (1996).
- Mann, M. R. Selective loss of imprinting in the placenta following preimplantation development in culture. Development. 131, 3727-3735 (2004).
- Market-Velker, B. A., Zhang, L., Magri, L. S., Bonvissuto, A. C., Mann, M. R. Dual effects of superovulation: loss of maternal and paternal imprinted methylation in a dose-dependent manner. Hum. Mol. Genet. 19, 36-51 (2010).
- Meng, L. H., Xiao, S. Q., Huang, X. F., Zhou, Y., Xu, B. S. A study on bisulfite sequencing method for methylation status of imprinted genes in single human oocytes. Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi. 25, 289-292 (2008).
- Denomme, M. M., Zhang, L., Mann, M. R. Embryonic imprinting perturbations do not originate from superovulation-induced defects in DNA methylation acquisition. Fertil. Steril. 96, 734-738 (2011).
- Tahiliani, M. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, 930-935 (2009).
- Hajj, N. E. l Limiting dilution bisulfite (pyro)sequencing reveals parent-specific methylation patterns in single early mouse embryos and bovine oocytes. Epigenetics. 6, 1176-1188 (2011).
