Summary
פרוטוקול שלנו פותחה כדי נקייה בקלות לספק איים או תאים תחת הקפסולה הכליה של עכברים. תאים מרוכזים לתוך כדורי בצינור הסופי משמש השתלת התאים תחת הקפסולה כליות. הקלות של טכניקה זו מפחיתה את הלחץ על התאים ואת העכבר.
Abstract
פרוטוקול שלנו פותחה כדי נקייה בקלות לספק איים או תאים תחת הקפסולה של הכליה בעכברים סוכרתיים או רגיל. מצאנו כי זה היה קל יותר לרכז את איים או תאים לתוך כדורי בצינור האספקה הסופי (PE50) המשמש השתלת התאים תחת הקפסולה כליות. טכניקה זו מספקת הן מהירות וקלות תוך צמצום כל לחץ חזק על התאים או העכבר.
טוען: התיישבו, הרים יד, איים או תאים pelleted הם aspirated בזהירות את החלק התחתון של צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל באמצעות pipetteman p200 ו ישר, קיר דק קצה פיפטה. אורכו של צינור PE50 מחוברת בקצה פיפטה בעזרת צינור קטן מתאם סיליקון. תאים מותר להתיישב, בקצה, ולאחר מכן מועברים על ידי צינורות PE50 לאט חיוג pipetteman. לאחר התאים לקראת סוף צינורות PE50, שריטה נעשית ואת צינורות מתאם סיליקון מושם על שריטה. צינורות PE50 מועבר 15 מ"ל חרוטי המכיל pipet 5 מ"ל לחתוך, ואת צינורות PE50 הוא מודבק על הצד של pipet 5 מ"ל כדי למנוע מסתלסל במהלך centrifuging. תאים מותר להגיע 1,000 סל"ד ועצר.
השתלה: עכברים מקבל מורדמים, מגולח, וניקה. חתך קטן עשה על האגף השמאלי של העכבר את הכליה חשוף. , כליה שומן, רקמת נשמרים עם ספוגית לחה מלח רגיל. סוף דיסטלי של PE50 מצורף מזרק כונן בורג המילטון, המכיל קצה פיפטה, באמצעות צינורות מתאם סיליקון. ניק קטן עשוי בצד האגף הימני של הכליה, לא גדול מדי ולא עמוק מדי. הסוף של צינורות משופעים PE50, הקרוב התאים, ממוקמת היטב תחת הקפסולה, צינורות הוא נע סביב בעדינות כדי לפנות מקום בעוד בשטיפת מלוחים נורמלי; כמוסת יבש יכול לקרוע בקלות. בועות אוויר קטנות מועבר תחת הקפסולה על ידי חיוג לאט את הכונן בורג מזרק. איי הם אז נמסר לאט מאחורי בועת אוויר. הומאוסטזיס כליה לאחר איים הועברו נשמרת קישוטים הוא צרוב עם חום נמוך. הכליה ממוקמת בחזרה לחלל הצפק ואת העור הם sutured בסיכות. עכברים מטופלים מיד עם Flunixin ואת עצירות מ"ר והניח בתוך כלוב על כרית חימום.
Protocol
הכנת איי להשתלה (Tx)
- תחת מיקרוסקופ הפוכה, בחר ידנית איים באמצעות pipetman P200 ו טיפ pipet ישר מן איים בתרבית בצלחת 100mm.
- הרוזן איים 100 בכל פעם, להעביר לתוך הצינור כל microcentrifuge (~ 500 איים / צינור / עכבר).
- אפשר ליישב איים אל החלק התחתון של הצינורות microcentrifuge.
- לצייר את אחד איון גלולה לתוך pipetman P200 (נקבע על 130ul) באמצעות קצה ישר קיר דק pipet.
- הנח צינורית סיליקון מתאם על קצה המזרק. הכנס אורך צינורות PE50 לתוך מתאם סיליקון.
- תלו את pipetman לצד מכסה המנוע הקלטת צינורות PE50 אל הקיר מכסה המנוע גבוה יותר איים בקצה. זה יאפשר איים להתיישב רק קצה פיפטה.
- מעבירים את האיונים לתוך צינורות PE50 על ידי לאט חיוג pipetman והזזת איים לתוך צינורות PE50, נזהר לא לגרש את האיונים מסוף.
- הפוך שריטה סוף משופעים של צינורות PE50. תוך שמירה על שריטה, נתק את צינור מתאם סיליקון מ pipetman ולאבטח את שריטה עם מתאם סיליקון.
- מניחים את האיונים, ב PE50, צינורות סיליקון צינורות מכופף בצד מתאם למטה, לתוך 15 מ"ל קונית עם pipet 5 מ"ל לחתוך הקלטת צינורות PE50 על הצד של pipet 5 מ"ל כדי למנוע מסתלסל של צינורות PE50 תוך centrifuging.
- צנטריפוגה conicals PE50/15mL עד 1000 סל"ד ו לכבות צנטריפוגות. (לא להכין יותר מ -10 תכשירים איון בבת אחת).
- הנח צינורית על הקרח.
הכנת עכבר להשתלה
- להרדים את העכברים עם isofluorane או עם קטמין / Xylexene (ראה פרוטוקול הכנה).
- לאחר הרדמה נקטה להשפיע, לגלח את האגף השמאלי של העכבר.
- ספוגית העור של העכבר, מרכז החוצה, עם ספוגית יוד Povidone ולאחר מכן לנגב עם מטלית ETOH.
- אתר את הכליה השמאלית (בדיוק של הטחול). לעשות חתך קטן בעור, לחשוף את הצפק.
- ביצוע חתך קטן הצפק חשיפת בכליות. שמירה על החתך קטן יסייע בשמירה על הכליות גדל חשוף.
- החל לחץ קל על שני הצדדים של החתך, להעלות או פופ הכליה מתוך העכבר.
- שמרו על לחות כליה על ידי יישום מלוחים נורמליים עם כותנה היטה ספוגית.
- בעזרת מזרק 23 או 25 מחט מד, לעשות שריטה קטנה באגף הימני של הכליה, יצירת nick ב הקפסולה כליות, לא עמוק מדי או גדול מדי.
השתלה של איי
הערה: בעוד העכבר שמכינים Tx, האדם השני צריך להכין את הבורג כונן השתלת המילטון מזרק איון.
- לאט לאט להסיר את צינורות מתאם סיליקון מ צינורות PE50 תוך שמירה על שריטה בצינור.
- מניחים את הקצה השני של צינור PE50 לתוך צינורות סיליקון מתאם במקום מתאם סיליקון צינורות על קצה פיפטה מחוברת "בורג כונן" מזרק זכוכית המילטון. לאט לאט לשחרר את שריטה צינורות PE50, וודא כי האיים אינם לדלוף החוצה.
- לקדם את האיונים לאט אל קצה צינור PE50 באמצעות מנגנון "בורג", אבל לשמור על בועת אוויר קטן בחלק הקדמי של איים בצינור PE50.
- Into ניק עשה בכליות, בזהירות להחליק את צינורות PE50 תחת הקפסולה, מה שהופך כיס קטן. היזהרו מאוד לא לנקר את הכליה או ניקוב באמצעות הקפסולה.
- זה עוזר לשמור את האזור לח הקפסולה עם כותנה מלוחים Gentamycin נורמלי ספוג ספוגית שקצהו: כמוסת יבש יקרע בקלות.
- בעדינות להעביר את צינורות לכל הכיוונים, תוך יצירת "כיס" עבור איים המושתלים לנוח. זכור להחיל מחדש מלוחים נורמלי נוסף כדי לשמור על האזור לח.
- בניהולו של מי פתחה את העכבר מי הניח את צינורות PE50 תחת הקפסולה כליות, האדם השני, שהכין את העכבר מזרק המילטון השתלה, יהיה לאט להתקדם איים תחת הקפסולה, בתוך "כיס", מאחורי בועת אוויר קטנה מועברים על ידי צינורות PE50, עד כל האיונים הם מושתלים.
- לאט לאט להסיר את צינורות PE50, לייבש את האזור עם ספוגית יבשה בזהירות לצרוב ברגע האחרון עם חום נמוך.
- בעזרת צמר גפן יבש היטה ספוגית, ודא דימום כל הפסיקה. לאחר הדימום הפסיק, מחדש ללחלח את הכליה עם מי מלח סטריליים, בעדינות להחליף את הכליה לתוך הצפק לפני הסגירה את העכבר עם תפר ו סיכות העור.
סגירת / התחייה של עכבר
- סגור את הצפק עם תפר שפועל באמצעות 5-0 תפרים משי w / מחט C-6 19mm.
- באמצעות מלקחיים לצייר הן בצד של החתך בעור יחד.
- העור סיכות יחד עם 2 או 3 סיכות.
- נקו את העור של העכבר דם כל, באמצעות ספוגית כותנה היטה ו סליןה
- מיד לטפל בעכבר עם הזרקה תת עורית של Flunixin ואת עצירות.
- מניחים את העכבר בכלוב, הממוקם על כרית חימום או מתחת מנורת חימום, עד העכבר אינו פעיל באופן מלא.
- הסר את סיכות העור 2 שבועות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מספק אפשרות מעשית ויעילה עבור נקייה בקלות ומספק איים או תאים תחת הקפסולה של הכליה בעכברים סוכרתיים או רגיל. הטכניקה של ריכוז pelleting איים או תאים לתוך צינורות האספקה הסופי (PE50) המשמש השתלת התאים תחת הקפסולה כליות מציעה שיטה קלה ויעילה של השתלת תאים תוך צמצום כל לחץ חזק על התאים או העכבר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
מרכז קליפורניה בסן פרנסיסקו סוכרת. NIH קליפורניה בסן פרנסיסקו DERC Core איילט. JDRF. LIfeScan חברת ג'ונסון אנד ג'ונסון החברה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical gloves | Fisher Scientific | 11-394-95(sz) | |
| Surgical scrub sponges | Moore Medical | 42940AK | |
| Forceps | Miltex Inc. | 6-114 and 6-26 | 2 with teeth, 2 straight |
| Dissecting scissors n=2 | Miltex Inc. | 5-290 | |
| Oster razor (sz. 40 blade) | Fisher Scientific | 01-305-10B | |
| 4x4 Sterile gauze pads | Moore Medical | 08252AK | |
| Povidone Iodine pads | Moore Medical | 08486AK | |
| Alcohol pads | Fisher Scientific | 14-819-2 | |
| Heating pad | Moore Medical | 42508AK | |
| 23G or 25G needles | 1" long | ||
| Cidex solution | Moore Medical | 07535AK | for cleaning/santizing instruments |
| PE50 polyethylene tubing | BD Biosciences | 427411 | PE50, 0.965mm O.D. x 0.58mm I.D. |
| Cidex + 28 day soln | Moore Medical | 35625AK | |
| Silicone tubing | Spectrum Chromat. | 123732 | 5/32”OD x 1/32” ID |
| Instrument sterilizing container | Moore Medical | 39074AK | |
| Straight Pipet Tips | USA Scientific, Inc. | 1111-0810 | sterile |
| Glass syringe w/screw-drive | Hamilton Co | 1001 | |
| Cauterizing tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS230 | |
| Needle Holder | Moore Medical | 41-067 | |
| 5-0 silk | LOOK Surgical | 754B | for suture (6-C) |
| Cotton tipped swab | Moore Medical | ||
| 9mm autoclip stapler | BD Biosciences | 7630 | |
| 9mm staples | BD Biosciences | 7631 | |
| 9mm staple remover | BD Biosciences | 7637 |
References
- Tang, Q., Henriksen, K. J., Bi, M., Finger, E. B., Szot, G., Ye, J., Masteller, E. L., McDevitt, H., Bonyhadi, M., Bluestone, J. A. In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes. J Exp Med. 199, 1455-1465 (2004).
- Rulifson, I. C., Szot, G. L., Palmer, E., Bluestone, J. A. Inability to induce tolerance through direct antigen presentation. Am J Transplant. 2, 510-519 (2002).
- Lenschow, D. J., Zeng, Y., Hathcock, K. S., Zuckerman, L. A., Freeman, G., Thistlethwaite, J. R., Gray, G. S., Hodes, R. J., Bluestone, J. A. Inhibition of transplant rejection following treatment with anti-B7-2 and anti-B7-1 antibodies. Transplantation. Transplantation. 60, 1171-1178 (1995).
- Lenschow, D. J., Zeng, Y., Thistlethwaite, J. R., Montag, A., Brady, W., Gibson, M. G., Linsley, P. S., Bluestone, J. A. Long-term survival of xenogeneic pancreatic islet grafts induced by CTLA4lg. Science. 257, 789-792 (1992).
