Summary
हमारे प्रोटोकॉल के लिए स्वच्छ और आसानी से चूहों के गुर्दे कैप्सूल के तहत islets या कक्षों देने के लिए विकसित किया गया था. कक्ष अंतिम गुर्दे कैप्सूल के तहत कोशिकाओं के प्रत्यारोपण के लिए इस्तेमाल किया टयूबिंग में छर्रों में केंद्रित कर रहे हैं. इस तकनीक का आसानी कोशिकाओं और माउस के लिए तनाव को कम कर देता है.
Protocol
Islets के प्रत्यारोपण के लिए तैयार (TX)
- एक औंधा माइक्रोस्कोप के तहत, हाथ लेने P200 pipetman और एक 100mm थाली में सुसंस्कृत islets से सीधे pipet टिप का उपयोग islets.
- गणना समय और प्रत्येक microcentrifuge ट्यूब (~ 500 islets / ट्यूब / माउस) में हस्तांतरण पर 100 islets.
- Islets microcentrifuge ट्यूबों के नीचे करने के लिए व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दें.
- एक P200 (130ul पर सेट) pipetman एक सीधे pipet पतली दीवार के टिप का उपयोग में एक छोटा सा व्दीप गोली ड्रा.
- सिरिंज नोक पर एक सिलिकॉन ट्यूब एडाप्टर रखें. सिलिकॉन adapter में PE50 टयूबिंग की लंबाई डालें.
- डाकू और टेप PE50 हुड दीवार के लिए टयूबिंग टिप में islets से अधिक के पक्ष में pipetman रुको. यह islets पिपेट की नोक में ही व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देगा.
- PE50 टयूबिंग में धीरे pipetman डायलन और PE50 टयूबिंग में islets चलती है, सावधान किया जा रहा अंत से islets निष्कासित नहीं से islets का स्थानांतरण.
- PE50 टयूबिंग beveled अंत में एक गांठ बनाओ. जबकि गुत्थी को बनाए रखने, pipetman से सिलिकॉन एडाप्टर टयूबिंग डिस्कनेक्ट और सिलिकॉन अनुकूलक के साथ गुत्थी सुरक्षित.
- Islets के प्लेस, टयूबिंग PE50, kinked सिलिकॉन एडाप्टर टयूबिंग नीचे की ओर में एक कट 5 एमएल pipet और टेप 5 एमएल pipet के पक्ष पर PE50 टयूबिंग जबकि centrifuging PE50 टयूबिंग के कर्लिंग को रोकने के साथ एक 15 एमएल शंक्वाकार में.
- 1000 rpm के लिए PE50/15mL conicals अपकेंद्रित्र और बंद अपकेंद्रित्र बारी. (कभी एक समय में 10 से अधिक आइलेट तैयारी तैयार).
- बर्फ पर रखें ट्यूब.
माउस के प्रत्यारोपण के लिए तैयार
- Isofluorane के साथ या / Ketamine Xylexene (देखें तैयारी प्रोटोकॉल) के साथ चूहों anesthetize.
- बाद संवेदनाहारी को प्रभावित करने के लिए ले लिया है, तो माउस के बायीं ओर दाढ़ी.
- झाड़ू से साफ़ करना त्वचा माउस के केंद्र से बाहर, और Povidone आयोडीन की झाड़ू के साथ तो एक ETOH झाड़ू के साथ बंद पोंछ.
- बाएँ गुर्दे (तिल्ली के सिर्फ सही) का पता लगाएँ. त्वचा में एक छोटा सा चीरा, peritoneum उजागर.
- गुर्दे उजागर peritoneum में एक छोटा सा चीरा बनाओ. चीरा छोटे रखते हुए गुर्दे उठाया और उजागर रखने में मदद मिलेगी.
- चीरा के दोनों पक्षों के लिए एक मामूली दबाव लागू करें, बढ़ाने, या गुर्दे माउस के बाहर पॉप.
- एक कपास के साथ सामान्य नमक लागू करने के द्वारा गुर्दे नम रखें झाड़ू इत्तला दे दी.
- एक 23 सिरिंज या 25 गेज सुई का प्रयोग, गुर्दे की सही दिशा पर एक छोटी सी खरोंच बनाने के लिए, गुर्दे कैप्सूल में एक निक बनाने, गहरी या नहीं भी बहुत बड़ा है.
Islets की ट्रांसप्लांटेशन
नोट: जबकि माउस टीएक्स के लिए तैयार किया जा रहा है, दूसरा व्यक्ति हैमिल्टन पेंच ड्राइव आइलेट प्रत्यारोपण सिरिंज तैयार करना चाहिए.
- धीरे धीरे PE50 टयूबिंग से सिलिकॉन एडाप्टर टयूबिंग निकालने जबकि टयूबिंग में गुत्थी रखने.
- सिलिकॉन एडाप्टर टयूबिंग और जगह "स्क्रू ड्राइव" कांच हैमिल्टन सिरिंज से जुड़ी विंदुक टिप पर सिलिकॉन एडाप्टर टयूबिंग में PE50 टयूबिंग के विपरीत अंत प्लेस. धीरे धीरे PE50 टयूबिंग में गुत्थी जारी, यकीन है कि पेरिस से बाहर लीक नहीं बना.
- Islets धीरे PE50 "स्क्रू" तंत्र का उपयोग टयूबिंग की टिप करने के लिए, एडवांस लेकिन PE50 टयूबिंग में islets के सामने एक छोटा सा हवा बुलबुला रखने.
- में निक गुर्दे में बनाया, ध्यान PE50 टयूबिंग कैप्सूल के तहत स्लाइड, एक छोटी सी जेब बना. बहुत सावधान रहो, या कैप्सूल के माध्यम से गुर्दे और puncturing नहीं गोलची.
- यह सामान्य नमक Gentamycin लथपथ कपास झाड़ू इत्तला दे दी साथ क्षेत्र कैप्सूल और नम रखने में मदद करता है, एक सूखी कैप्सूल आसानी से आंसू जाएगा.
- धीरे सभी दिशाओं में टयूबिंग चाल, प्रतिरोपित islets के लिए आराम करने के लिए एक "जेब" बनाने. अतिरिक्त सामान्य नमक reapply के लिए क्षेत्र नम रखने के लिए याद रखें.
- व्यक्ति जो माउस खोल दिया है और जो गुर्दे कैप्सूल के तहत PE50 टयूबिंग रखा गया है, दूसरे व्यक्ति, जो माउस और हैमिल्टन प्रत्यारोपण सिरिंज तैयार की दिशा के अंतर्गत कैप्सूल के तहत धीरे धीरे islets के अग्रिम जाएगा "जेब" के अंदर, एक छोटे से हवा टयूबिंग PE50 द्वारा वितरित बुलबुला के पीछे, जब तक सभी islets प्रतिरोपित कर रहे हैं.
- धीरे धीरे PE50 टयूबिंग निकालने के लिए, एक सूखी झाड़ू के साथ क्षेत्र सूखे और ध्यान से कम गर्मी के साथ निक दाग़ना.
- एक सूखी कपास का उपयोग झाड़ू इत्तला दे दी, यह सुनिश्चित करें कि सभी खून बह रहा बंद कर दिया गया है. एक बार खून बह रहा बंद कर दिया है, बाँझ खारा के साथ गुर्दे की फिर से गीला करना, और धीरे से peritoneum में सिवनी और त्वचा स्टेपल के साथ माउस को बंद करने के लिए गुर्दे की जगह पहले.
समापन / माउस के रिवाइवल
- एक चल 5-0 रेशम sutures w / एक C-6 19mm सुई का उपयोग कर सिलाई के साथ पेरिटोनियम बंद.
- संदंश का प्रयोग त्वचा चीरा के दोनों ओर एक साथ आकर्षित.
- 2 या 3 स्टेपल के साथ स्टेपल एक साथ त्वचा.
- किसी भी रक्त की माउस की त्वचा को साफ, एक कपास का उपयोग झाड़ू और सलिन इत्तला दे दीई.
- तुरंत Flunixin और buprenorphine के एक चमड़े के नीचे इंजेक्शन के साथ माउस का इलाज.
- है कि एक हीटिंग पैड या नीचे एक हीटिंग दीपक पर रखा है, जब तक माउस को पूरी तरह सक्रिय है एक पिंजरे में माउस रखें.
- 2 सप्ताह में त्वचा स्टेपल निकालें.
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Discussion
इस प्रोटोकॉल सफाई और आसानी से मधुमेह या सामान्य चूहों के गुर्दे कैप्सूल के तहत islets या कक्षों पहुंचाने के लिए एक व्यावहारिक और कुशल विकल्प प्रदान करता है. ध्यान केंद्रित और pelleting गुर्दे कैप्सूल के तहत कोशिकाओं का प्रत्यारोपण किया अंतिम वितरण (PE50) टयूबिंग में islets या कक्षों की तकनीक कोशिकाओं रोपाई जबकि कोशिकाओं को या माउस को किसी भी अनुचित तनाव को कम करने का एक आसान और कारगर तरीका प्रदान करता है.
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Acknowledgments
UCSF मधुमेह केंद्र. NIH UCSF DERC आइलेट कोर. JDRF. LIFESCAN इंक जॉनसन एंड जॉनसन कंपनी.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical gloves | Fisher Scientific | 11-394-95(sz) | |
| Surgical scrub sponges | Moore Medical | 42940AK | |
| Forceps | Miltex Inc. | 6-114 and 6-26 | 2 with teeth, 2 straight |
| Dissecting scissors n=2 | Miltex Inc. | 5-290 | |
| Oster razor (sz. 40 blade) | Fisher Scientific | 01-305-10B | |
| 4x4 Sterile gauze pads | Moore Medical | 08252AK | |
| Povidone Iodine pads | Moore Medical | 08486AK | |
| Alcohol pads | Fisher Scientific | 14-819-2 | |
| Heating pad | Moore Medical | 42508AK | |
| 23G or 25G needles | 1" long | ||
| Cidex solution | Moore Medical | 07535AK | for cleaning/santizing instruments |
| PE50 polyethylene tubing | BD Biosciences | 427411 | PE50, 0.965mm O.D. x 0.58mm I.D. |
| Cidex + 28 day soln | Moore Medical | 35625AK | |
| Silicone tubing | Spectrum Chromat. | 123732 | 5/32”OD x 1/32” ID |
| Instrument sterilizing container | Moore Medical | 39074AK | |
| Straight Pipet Tips | USA Scientific, Inc. | 1111-0810 | sterile |
| Glass syringe w/screw-drive | Hamilton Co | 1001 | |
| Cauterizing tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS230 | |
| Needle Holder | Moore Medical | 41-067 | |
| 5-0 silk | LOOK Surgical | 754B | for suture (6-C) |
| Cotton tipped swab | Moore Medical | ||
| 9mm autoclip stapler | BD Biosciences | 7630 | |
| 9mm staples | BD Biosciences | 7631 | |
| 9mm staple remover | BD Biosciences | 7637 |
References
- Tang, Q., Henriksen, K. J., Bi, M., Finger, E. B., Szot, G., Ye, J., Masteller, E. L., McDevitt, H., Bonyhadi, M., Bluestone, J. A. In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes. J Exp Med. 199, 1455-1465 (2004).
- Rulifson, I. C., Szot, G. L., Palmer, E., Bluestone, J. A. Inability to induce tolerance through direct antigen presentation. Am J Transplant. 2, 510-519 (2002).
- Lenschow, D. J., Zeng, Y., Hathcock, K. S., Zuckerman, L. A., Freeman, G., Thistlethwaite, J. R., Gray, G. S., Hodes, R. J., Bluestone, J. A. Inhibition of transplant rejection following treatment with anti-B7-2 and anti-B7-1 antibodies. Transplantation. Transplantation. 60, 1171-1178 (1995).
- Lenschow, D. J., Zeng, Y., Thistlethwaite, J. R., Montag, A., Brady, W., Gibson, M. G., Linsley, P. S., Bluestone, J. A. Long-term survival of xenogeneic pancreatic islet grafts induced by CTLA4lg. Science. 257, 789-792 (1992).
