Summary
Наш протокол был разработан для чисто и легко доставить островков или клеток под капсулу почки мышей. Клетки сосредоточены в гранулы в финале трубы используются для пересадки клеток под почечную капсулу. Простота этой техники уменьшает стресс на клетки и мыши.
Abstract
Наш протокол был разработан для чисто и легко доставить островков или клеток под почечную капсулу с диабетом или нормальных мышей. Мы обнаружили, что легче было сосредоточиться островков или клеток в гранулы в финале трубы доставки (PE50), используемых для трансплантации клеток под почечную капсулу. Эта технология обеспечивает скорость и легкость при одновременном снижении каких-либо необоснованных стресса клеток или мыши.
Загрузка: Установившаяся, собирается вручную, островков или гранулированные клетки тщательно атмосферный со дна 1,5 мл микроцентрифужных трубки использованием P200 pipetteman и прямо, тонкостенных пипетки. Длина трубы PE50 прилагается к пипетки с помощью небольшого адаптера трубки силикона. Клетки разрешено поселиться в наконечнике, а затем передаются на PE50 трубки медленным набора pipetteman. Как только клетки ближе к концу PE50 труб, излом сделано и силиконовые трубки адаптера находится над изломом. PE50 трубка передается 15 мл коническую содержащие сократить 5 мл пипетки и PE50 трубы выявляется через борт 5 мл пипетки для предотвращения скручивания во время центрифугирования. Клетки позволило достичь 1000 оборотов в минуту и остановился.
Пересадка: Получатель мышей под наркозом, побрился, и чистить. Небольшой надрез на левом фланге мыши и почки подвергаются. Почек, жир и ткани влажной с физиологическим раствором тампоном. Дистального конца PE50 прилагается на диске шприц винтом Гамильтон, содержащие кончика пипетки, с помощью трубки силиконовые адаптера. Небольшой ник делается на правую сторону фланга почек, не слишком большим, ни слишком глубоко. Скошенный конец PE50 труб, ближайшей клетки, осторожно помещают под капсулой, труба двигался осторожно, чтобы освободить место в то время как моечные физиологического раствора, сухих капсула может порваться легко. Небольшой пузырек воздуха поставляется под капсулу медленно набора дисков шприц винт. Островки затем медленно доставляются за воздушный пузырь. Как только островки были доставлены почек гомеостаз поддерживается и безделушки является обезболивающий укол с малым тепловыделением. Почка помещается обратно в полости и брюшину и кожа зашивается и сшиваются. Мыши сразу получавших Flunixin и бупренорфин кв и помещен в клетку на грелку.
Protocol
Подготовка островков для трансплантации (Tx)
- Под инвертированного микроскопа, самостоятельно выбрать островков использованием P200 pipetman и прямой наконечник пипетки из культурных островков в 100 мм пластины.
- Граф островков 100 по времени и передаче в каждую микроцентрифужных трубки (~ 500 островков / трубку / мышь).
- Разрешить островков осели на дно микроцентрифужных труб.
- Нарисуйте один островок гранул в P200 pipetman (устанавливается на 130ul) с использованием прямой тонкостенной пипетки чаевые.
- Место адаптер силиконовые трубки на шприц наконечник. Вставьте длина PE50 трубку в силиконовых адаптеров.
- Повесьте pipetman в сторону капота и ленты PE50 трубки к капоту стену выше, чем островки в наконечник. Это позволит островков урегулировать только на кончике пипетки.
- Передача островков в PE50 трубки медленным набора pipetman и движущихся островков в PE50 трубку, стараясь не высылать островки с конца.
- Сделать излом скошенными конце PE50 труб. Сохраняя излом, отсоединить трубки силиконовые адаптер от pipetman и безопасной излом с силиконовой адаптера.
- Место островков, в PE50 труб, изломами силиконовых адаптеров трубы вниз, в 15 мл коническую с разрезом 5 мл пипетки и ленты PE50 трубку за борт 5 мл пипетки для предотвращения свертывания PE50 трубы в то время как центрифугирования.
- Центрифуга PE50/15mL conicals до 1000 оборотов в минуту и выключить центрифуги. (Никогда не готовиться более 10 препаратов островок в одно время).
- Место трубки на льду.
Подготовка мыши для трансплантации
- Обезболить мышей с isofluorane или кетамин / Xylexene (см. подготовке протокола).
- После анестезии принял аффекта, бриться левый фланг мыши.
- Тампон кожи мыши, центр-выход, с повидон йод тампоном, а затем протрите тампоном этанола.
- Найдите левой почки (так же, право селезенки). Сделайте небольшой надрез в коже, выставляя брюшины.
- Сделайте небольшой надрез в брюшной полости подвергая почки. Хранение небольшого разреза поможет в сохранении почек поднял и экспозиции.
- Применить небольшое давление на обе стороны разреза, поднять или поп почек из мыши.
- Держите почек влажной путем применения физиологического раствора ватным тампоном наконечником.
- Использование шприц 23 или 25 иглу, сделайте небольшую царапину на правом фланге почки, создавая ник в почечную капсулу, не слишком глубоко или слишком большим.
Трансплантация островков
Примечание: Во время мыши готовится к Tx, второй человек должен подготовить Гамильтон винтовой привод островок трансплантации шприц.
- Медленно снимите трубку силиконовые адаптер от PE50 трубки, сохраняя при этом излом труб.
- Место противоположном конце PE50 трубку в трубку силиконовых адаптеров и положите трубку силиконовых адаптеров на кончике пипетки при "винт-диск" стеклянный шприц Гамильтон. Медленно отпустите излом PE50 труб, убедившись, что острова не просочиться.
- Advance островков медленно, чтобы кончик трубки PE50 использовании "винт" механизм, но имейте небольшой пузырек воздуха в передней части островков в PE50 труб.
- Into ник, сделанные в почках, аккуратно вставьте PE50 трубы под капсулой, сделав небольшой карман. Будьте очень осторожны, чтобы не обманывать почек или прокалывание через капсулу.
- Это помогает держать области и капсулу влажный с физиологическим раствором, гентамицин пропитанной хлопка наконечником тампоном; сухие капсулы порвется легко.
- Аккуратно переместите трубы во всех направлениях, создавая "карман" для пересаженных островков для отдыха. Не забудьте повторно дополнительные физиологического раствора, чтобы сохранить область влажной.
- Под руководством человека, который открыл мыши и кто разместил PE50 трубы под почечную капсулу, второй человек, который подготовил мыши и Гамильтон пересадки шприц, будет медленно продвигаться островков под капсулу, внутри «карман», за небольшой пузырек воздуха выступил PE50 трубы, пока все островки пересаживают.
- Медленно снимите трубку PE50, сухой области с сухим тампоном и тщательно прижигать ника с малым тепловыделением.
- Использование сухих хлопка наконечником тампон, убедитесь, что все остановки кровотечения. Как только кровотечение остановилось, снова смочите почек стерильным физиологическим раствором и аккуратно заменить почки в брюшной полости до закрытия мышь с швом и кожи скоб.
Закрытие / Возрождение мышь
- Закрыть брюшины с использованием работы стежка 5-0 швов шелка W / C-6 19-мм иглой.
- Использование щипцов привлечь обе стороны от разреза кожи вместе.
- Сшивания кожи вместе с 2 или 3 скобы.
- Очистите кожу мыши любой крови, с помощью ватного тампона и наконечником Салинe.
- Сразу же лечить мышь с подкожного введения Flunixin и бупренорфин.
- Место мыши в клетке, который помещен на грелку или ниже нагрева лампы, пока мышь полностью активны.
- Снимите кожу скобы через 2 недели.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол обеспечивает практичный и эффективный вариант для чисто и легко доставки островков или клеток под почечную капсулу с диабетом или нормальных мышей. Техника концентрации и гранулирования островков или клеток в окончательном трубы доставки (PE50), используемых для трансплантации клеток под почечную капсулу предлагает простой и эффективный метод пересадки клеток при уменьшении любого излишнего напряжения на клетки или мыши.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
UCSF Центра Диабета. NIH UCSF DERC Островок Core. JDRF. LifeScan ООО Джонсон & Джонсон компании.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical gloves | Fisher Scientific | 11-394-95(sz) | |
| Surgical scrub sponges | Moore Medical | 42940AK | |
| Forceps | Miltex Inc. | 6-114 and 6-26 | 2 with teeth, 2 straight |
| Dissecting scissors n=2 | Miltex Inc. | 5-290 | |
| Oster razor (sz. 40 blade) | Fisher Scientific | 01-305-10B | |
| 4x4 Sterile gauze pads | Moore Medical | 08252AK | |
| Povidone Iodine pads | Moore Medical | 08486AK | |
| Alcohol pads | Fisher Scientific | 14-819-2 | |
| Heating pad | Moore Medical | 42508AK | |
| 23G or 25G needles | 1" long | ||
| Cidex solution | Moore Medical | 07535AK | for cleaning/santizing instruments |
| PE50 polyethylene tubing | BD Biosciences | 427411 | PE50, 0.965mm O.D. x 0.58mm I.D. |
| Cidex + 28 day soln | Moore Medical | 35625AK | |
| Silicone tubing | Spectrum Chromat. | 123732 | 5/32”OD x 1/32” ID |
| Instrument sterilizing container | Moore Medical | 39074AK | |
| Straight Pipet Tips | USA Scientific, Inc. | 1111-0810 | sterile |
| Glass syringe w/screw-drive | Hamilton Co | 1001 | |
| Cauterizing tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS230 | |
| Needle Holder | Moore Medical | 41-067 | |
| 5-0 silk | LOOK Surgical | 754B | for suture (6-C) |
| Cotton tipped swab | Moore Medical | ||
| 9mm autoclip stapler | BD Biosciences | 7630 | |
| 9mm staples | BD Biosciences | 7631 | |
| 9mm staple remover | BD Biosciences | 7637 |
References
- Tang, Q., Henriksen, K. J., Bi, M., Finger, E. B., Szot, G., Ye, J., Masteller, E. L., McDevitt, H., Bonyhadi, M., Bluestone, J. A. In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes. J Exp Med. 199, 1455-1465 (2004).
- Rulifson, I. C., Szot, G. L., Palmer, E., Bluestone, J. A. Inability to induce tolerance through direct antigen presentation. Am J Transplant. 2, 510-519 (2002).
- Lenschow, D. J., Zeng, Y., Hathcock, K. S., Zuckerman, L. A., Freeman, G., Thistlethwaite, J. R., Gray, G. S., Hodes, R. J., Bluestone, J. A. Inhibition of transplant rejection following treatment with anti-B7-2 and anti-B7-1 antibodies. Transplantation. Transplantation. 60, 1171-1178 (1995).
- Lenschow, D. J., Zeng, Y., Thistlethwaite, J. R., Montag, A., Brady, W., Gibson, M. G., Linsley, P. S., Bluestone, J. A. Long-term survival of xenogeneic pancreatic islet grafts induced by CTLA4lg. Science. 257, 789-792 (1992).
