Computed Tomography-guidet Time-domæne Diffus Fluorescens Tomography i små dyr til lokalisering af Cancer Biomarkører

Summary

Diffus fluorescens tomografi giver en relativt lav pris og høj-løbet fremgangsmåde prækliniske

Abstract

Lille dyr fluorescens molekylær billeddannelse (FMI) kan være et effektivt redskab til præklinisk forsknings-og udviklingsprojekter undersøgelser ^1. Imidlertid lysabsorption væv kromoforer (f.eks hæmoglobin, vand, lipider, melanin) typisk begrænser optiske signal udbredes gennem tykkelser større end nogle få millimeter ^2. Sammenlignet med andre synlige bølgelængder, vævsabsorption for rød og nær-infrarøde (nær-IR) lysabsorption dramatisk reducerer ikke-elastisk lysspredning bliver dominerende lys-væv interaktion mekanisme. Den relativt nylige udvikling af fluorescerende stoffer, som absorberer og udsender lys i det nær-IR området (600-1000 nm), har drevet udvikling af billeddannende systemer og lysudbredelsen modeller, som kan opnå hele kroppen tredimensional billeddannelse i små dyr ^3.

På trods af store fremskridt på dette område, stadig dårligt stillet karakter af diffus fluorescens tomografi en betydeligproblem for stabilitet, kontrast nyttiggørelse og rumlig opløsning af billeddata genopbygning teknikker og den bedste tilgang til FMI i små dyr er endnu ikke enige om. Størstedelen af forskergrupper har investeret i charge-coupled device (CCD)-baserede systemer, der giver rigelig vævs-prøvetagning, men suboptimal følsomhed ^4-9, mens vores gruppe og et par andre ^10-13 har forfulgt systemer baseret på meget høj følsomhed detektorer , at på dette tidspunkt give tætte væv prøveudtagning kan kun opnås på bekostning af lave billedbehandling gennemløb. Her har vi demonstrere metoden for anvendelse af enkelt-foton detektionsteknologi i et fluorescens tomografi system til at lokalisere en kræftsvulst hjernen læsion i en musemodel.

Fluorescens tomografi (FT) anvendte system enkelt foton tælling under anvendelse fotomultiplikatorrør (PMT) og information-rige tidsdomæne lysdetektion i en ikke-kontakt konformation ^11. Dette tilvejebringer en samtidig collektion af transmitteret excitation og emission lys, og omfatter automatisk fluorescens excitation eksponeringskontrol ^14, laser henvisninger, og co-registrering med et lille dyr computertomografi (microCT) system ^15. En nøgen musemodel blev anvendt til billeddannelse. Dyret blev inokuleret orthotopisk med en human glioma cellelinie (U251) i venstre cerebrale hemisfære og afbildes 2 uger senere. Tumoren blev fremstillet til at fluorescere ved injektion af et fluorescerende sporstof, IRDye 800CW-EGF (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) er målrettet mod epidermal vækstfaktorreceptor, en cellemembran-protein kendt for at være overudtrykt i U251 tumorlinie og mange andre cancerformer ^18. En anden, ikke-målrettede fluorescerende sporstof, Alexa Fluor 647 (Life Technologies, Grand Island, NY) blev også injiceret med hensyn til ikke-receptor-medierede virkninger på optagelsen af ​​de målrettede sporstoffer for at tilvejebringe et middel til at kvantificere sporstof binding og receptor tilgængelighed / densitet ^27. En CT-guidet, time-domænet algoritme blev anvendt til at rekonstruere placering af både fluorescerende sporstoffer (dvs. placering af tumor) i musehjerne og deres evne til at lokalisere tumoren blev verificeret ved kontrastforstærket magnetisk resonans billeddannelse.

Selvom påvist fluorescensimagografi i en gliom musemodel kan metoden præsenteret i denne video udvides til forskellige tumormodeller i forskellige små dyremodeller potentielt op til størrelsen af en rotte ^17.

Protocol

1. Animal Forberedelse

1. Bedøve nøgen mus (Charles River, Wilmington, MA) med intra-peritoneal injektion af ketamin-xylazin (100 mg / kg: 10 mg / kg ip).
2. Sted mus i stereotaktisk ramme, lave et snit i hovedbunden på venstre side af kraniet og under anvendelse af en 18-gauge nål, skaber en 1 mm diameter hul i kraniet 2 mm fra den centrale linie-og 2 mm bag bregma.
3. Injicere 5 x 10 ⁵ U251 humane neuronale glioblastomceller (venligst tilvejebragt af Dr. Mark Israel Dartmouth College, Hanover, NH) i 5 pi phosphat-buffer-opløsning ind i den venstre cerebrale hemisfære i en dybde på cirka 2 mm under overfladen af hjerne. Anvende en Hamilton mikro-sprøjte ¹⁸ og en stumpendede 27-gauge nål til celleimplantation og spidsen af nålen 3 mm fra den ydre overflade af kraniet og derefter trække 1 mm for at skabe en lomme til cellerne.
4. Sutur snit websted og tillade recovery fra kirurgi.
5. Vent ~ 14 dage for at tillade tumoren at vokse inden billeddannelse.

2. Fluorescens Tomography systemkalibrering

1. På dagen for muse billeddannelse, initiere systemet og tillade lasere og lysdetektorer at varme op til cirka 20 minutter for at undgå driver i systemets følsomhed.
2. Placere en 100 °-by-4 ° manipuleret linie diffusor (Thorlabs, Newton, NJ) ved direkte midten af ​​den billeddannende portalarmen, vinkelret på excitation laser: en picosekund-pulseret 80 MHz multimode 635 nm laser diode (PicoQuant Photonics North America Inc., Westfield, MA). Justere vinklen af ​​diffusoren at maksimere mængden af ​​signal detekteres ved alle fem lyssamling kanaler. En fuldstændig beskrivelse af den billeddannende geometri er givet andetsteds ^11,14,15.
3. Placer OD 2 neutralfiltre (Thorlabs, Newton, NJ) foran alle fluorescenspåvisning fotomultiplikatorrørene (PMT) og OD-1 neutralfiltre (Thorlabs, Newton, N.J.) foran alle transmittans detektion PMT'er. Indsamle 100 tidsmæssige puls spread profiler (TPSF) af laseren, hver med en 1-s integrationstiden.
4. Normalisere hver TPSF af laser reference, korrekt for tidsmæssig drift i laser reference, og gennemsnittet over alle iterationer for hver detektor. Disse gennemsnitsværdier TPSFs er de detektor-specifikke instrument respons funktioner (IRF), der anvendes i det optiske billede genopbygning.

3. Imaging Protokol

1. Bedøve mus med 2% isofluran i oxygen (1 L / min).
2. Injicere en nanomol IRDye 800CW-EGF og 1 nanomol af Alexa Fluor 647 i 100 pi phosphat-pufferopløsning, intraperitonealt, 12 timer før billeddannelse at målrette epidermal vækstfaktor receptor-overekspression i tumor.
3. Placer musen på de glasfiber støtter af imaging sengen, arrangere musen, så dens næse forbliver i en kegle levere isofluran anæstesi.
4. EnKontroller at musen er placeret passende i sengen, dvs, at når lejet er fastgjort i fluorescens tomografi systemet musen er ved det omtrentlige centrum af den billeddannende gantry. Denne positionering kan styres ved at dreje excitation laseren 180 ° om musen, sikre, at omdrejningspunktet for laseren lyser et punkt nogenlunde på midten af ​​musen fra perspektivet af laser ved alle vinkler.
5. Når positioneret, omhyggeligt overføre billedbehandling sengen og musen til microCT (udforske Locus, GE Healthcare, London, ON), scanner og indsamle anatomiske oplysninger med en opløsning på 93-um isotrope for hele hovedet af musen.
6. Visualisere CT billedet stakken og vælge skive (erne), der skal afbildes med fluorescens tomografi systemet.
7. Forsigtigt overføre billedbehandling sengen og mus tilbage til fluorescens tomografi systemet. Vælg antal kildetekst-positioner for at indsamle data om musen for hver billedbehandling SLICe (32), integrationstiden for hver TPSF måling (1 s), antallet af gentagelser for hver kilde position (10), og positionen og antallet af ønskede billeddannelse skiver af CT billedstak fra trin 3.6. Tallene i parentes er typiske værdier for hver scanning parameter opnåelse ~ 5 minutter datafangst pr billeddannelse skive.
8. Anbring tredobbelte kærvfiltre (Chroma Technology Corp Bellows Falls, VT) foran de fluorescenspåvisning PMT'er at begrænse enhver laserlys fra nå fluorescens detektorer, og OD-2 neutralfiltre foran de transmittansdata påvisning PMT'er at undgå mætning disse detektorer.
9. Køre dataopsamlingssoftware, opsamling fluorescens og transmissionen TPSFs ved hver defineret kilden detektor position og for hver excitationsbølgelængde (635 nm og 755 nm til excitering af Alexa Fluor 647 og IRDye 800CW-EGF sporstoffer, henholdsvis). For hvert sæt af TPSFs indsamlet, overvåge og registrere laseren intensitetmed en reference PMT-kanal.

4. Billede Genopbygning

1. Bestemme den ydre overflade af mus og placeringen af ​​de billeddannende bed støttestængerne af CT billeder og skabe masker, som dækker for rammerne af musen, og de billeddannende stænger separat.
2. Anvender musen masken til fremstilling af en finit-element mesh af dyret ved hjælp af NIRFAST softwaren ^19.
3. Lokalisere kilden og detektoren positioner fra den fluorescens tomografi systemet på overfladen af masken baseret på microCT og fluorescens rumlig registrering koordinater ^20.
4. Fjerne optiske datapunkter er forbundet med kilden eller detektor positioner, som interagerer med placeringen af ​​de billeddannende bed støttestængerne.
5. Normalisér indsamlede data ved hver kilde detektor position ved laser reference, korrekte for tidsmæssig drift i laser reference, og korrekt for filter følsomheder, som blev bestemt ved forsøgsprøvning på købstidspunktet ^15.
6. Tage Born forholdet af data (fluorescens divideret med transmittans) for hver kilde-detektor position og gange med en forreste model simulering af transmittans baseret på finite-element dyr mesh ensartede optiske egenskaber. Dette gøres for at mindske fejl i forbindelse med kilde-eller detektor-væv kobling ^21, til at kalibrere de data til modellen ^22, og til at justere data for andre aspekter af model-data mismatch ^23,24.
7. Konstruér en data vektor bestående af den skalerede forskellen mellem de født forhold indsamlede data på begge bølgelængder. Skaleringsfaktoren er valgt til at maksimere EGFR binding kontrast. Udfør tidsdomænet billede rekonstruktion med de kalibrerede forskel data ved hjælp af TPSF for hver detektering kanal som et input, og skabe fluorescens kort over kontrast-forstærkede målrettet sporstof ^15.

5. Repræsentative resultater

"> Et eksempel på en fluorescens rekonstruktion overlejret med en co-registreret CT anatomiske billede fra hovedet af en mus med en U251 ortotopisk gliom tumor er præsenteret i figur 1b. I midten af massen af gliom bestemmes af fluorescerende genopbygning (Figur 1b ) var inden for 1 mm tumoren centrum af massen i modsætning-styrke magnetisk resonans (figur 1a). CT-og MR-billeder blev co-registreret baseret på en gensidig information transformation.

Figur 1. Kontrast-forstærkede (gadolinium) magnetisk resonans-billede af muse hoved (a). Mus blev inokuleret orthotopisk med U251 human glioma cellelinie. Placeringen af ​​tumoren, der absorberer mere kontrastmiddel end den normale hjerne, kan ses i venstre cerebrale hemisfære (til højre i billedet) og angivet ved den hvide pil. Den corresponding computertomografi billede (fra den samme placering på musen hoved) er afbildet i (b) med den epidermale vækstfaktor rettet fluorescens minus den ikke-målrettede fluorescens genopbygning overlejret. Enhederne i fluorescens er omvendt mm og vedrører absorptionskoefficienten af ​​bundet målrettet fluorescens multipliceret med quantum effektivitet og af dens koncentration.

Discussion

Fluorescens tomografi (FT) er en følsom, ioniserende stråling fri molekylær afbildningsmodalitet baseret på synlige og nær-infrarødt lys transporten gennem biologisk væv. Det meste af interesse i FT har været fokuseret på dets potentiale til at fremskynde lægemiddelforskning og-udvikling i små dyre eksperimentelle modeller ¹ og en centralt område af forskning har været studiet af kræft biomarkør udtryk og respons til molekylære behandlinger ^26. På nuværende tidspunkt er der to konkurrerende tilgange til FT system design. Den mest almindelige design er baseret på afkølede charge-coupled device (CCD) kamera til fluorescenspåvisning ^4-9. Denne udformning giver en høj tæthed af målinger for at maksimere væv prøveudtagning, idet hver pixel i CCD-kameraet kan detektere lys, der har udbredt sig en unik sti gennem vævet. Men, CCD-kameraer har et begrænset dynamikområde og udlæsning støj begrænser deres ultimative følsomhed. Den anden konstruktion undgår den potentielle begræns tioner af CCD-kamera detektering ved anvendelse af meget følsomme enkelt-foton optælling teknologi baseret på anvendelsen af sådanne detektorer med fotomultiplikatorrør eller avalanche fotodioder ^10-13. Ulempen ved disse mere følsomme metoder til påvisning, at hver detektor kun kan samle lys ved et enkelt punkt, således at opnå tæt væv sampling, enten mange detektorer skal anvendes (som er meget dyrt), eller mange fremspring skal afbildes med den samme detektor (hvilket kan være tidskrævende). Mens det optimale niveau af væv stikprøver af små dyr, FT ikke er aftalt, og kan variere fra sag til sag, er det aftalt, at single-photon tælling instrumentering er bedre egnet til at udforske følsomhed grænserne for FT i form dens evne til at detektere lave koncentrationer af molekylære markører. I denne undersøgelse tilvejebringer vi en metode til udførelse FT anvendelse af enkelt-foton tælling detektering instrumentering til at lokalisere tumorer i mus.

ent "> Der er fire kritiske trin involverede fremstilling af robuste datasæt med tid korrelerede enkelt-foton tælle FT. Den første er anvendelsen af ​​et egnet og ligetil kalibreringsproceduren. I præsenterede metode, er de respektive følsomhed hver detektionsafsætning kanal tegnede ved indsamling af en basislinie måling af exciterende lys transmitteret gennem en ledning-diffusor udformet til at rette lige store fraktioner af lys til hver detektor ^15. Endvidere er det detekterede lys i et eksperiment kontinuerligt kalibreret til laseren reference, både intensitet og betyder . tid, som kunne svinger over tid, ved drift af en laser henvisning kanal ^11,15 Det andet afgørende skridt er den præcise indsamling og co-registrering af anatomiske billeddannelse til guidede fluorescens rekonstruktioner FT data alene giver ingen anatomiske oplysninger. Derfor, for at skabe en model af lys transport, kan anvendes til at rekonstruere lodelse af fluorescerende kilder i en prøve fra den detekterede fluorescens ved overfladen af ​​prøven skal anatomi af prøven i forhold til FT system kendes nøjagtigt. I vores system, er det anatomiske oplysninger indhentet ved en mikro-computertomografi system med rumlige koordinater, der er blevet rumligt registreret hos dem i FT-system ^15,20. Den tredje afgørende skridt indebærer at sikre, at en optimal eksponering (dvs. total foton afsløring tid til hver laser projektion) er ansat ved hver kilde-detektor position. Dette er vigtigt af to grunde: For det første at sikre, at der er tilstrækkelig signal-støj i hver afsløring position og for det andet for at undgå detektor mætning, hvilket kan beskadige opdagelse enheder. For at opnå optimal eksponering ved hver detektor position, er en automatisk eksponering anvendes, som i det væsentlige triangulates optimal eksponering fra to lav-signal eksponeringer ^14. Den fjerde kritisketrin af metode refererer til de indsamlede fluorescens data til mængden af ​​transmitteret excitationslys. Dette henvisninger kaldes ofte Født forholdet, og giver mange fordele for FT, med det vigtigste er en begrænsning af model-data mismatch fejl ^23,24. De præsenterede Systemet blev designet til at detektere både fluorescens og transmitteres excitationslys samtidigt ved kanalisering af lys i hver detektionsafsætning kanal i 2 separate fotomultiplikatorrør. Ved at gøre dette, undgår vi eventuelle virkninger af bevægelse på nøjagtigheden af ​​Born forholdet.

Med et robust datasæt den side indebærer billede genopbygning af tid-domæne data løse det inverse problem med Finite Element maske med udtrykket:

d = Jx

hvor d er en vektor med n x m elementer til N-kilde-detektor fremspring og m TPSF tid porte, J er en n x m-by-l følsomhed matrix (eller Jacobian) til l knudepunkter i nettet, og x er vektoren af fluorescens optiske egenskaber i hvert knudepunkt, der størrelse l d er de kalibrerede data opsamlet under eksperimentet, og J er simuleret ved hjælp af finite element opløsningen. til tidsdomænet diffusion tilnærmelse af fluorescens transport ^25. Tid-dimension J også foldet med detektoren instrumentspecifikke responsfunktioner. X er en repræsentation af fluorescens kort af interesse og løses for at anvende et Levenberg-Marqardt ikke-negative mindste kvadraters metode med Tikhonov regularisering ^15.

Metoden præsenteret her, som beskriver en fremgangsmåde i stand til at lokalisere fluorescensmærkede tumorer i mus under anvendelse af stærkt følsomme foton tælle fluorescenspåvisning, har potentialet til at skubbe grænserne for FT. I en tidligere undersøgelse under anvendelse af potentialettilgang i større-end-mus dyr modeller, såsom rotter, samt forbedret følsomhed i forhold til eksisterende system design i muse-størrelse prøver, blev påvist ^17. Den umiddelbare anvendelse af denne fremgangsmåde ville være for overvågning af biomarkør udtryk in vivo i små dyretumormodeller at vurdere lægemidlet effekt i en high-throughput midler. Evnen af ​​systemet til at excitere og detektere fluorescens ved flere bølgelængder muliggør samtidig påvisning af multiple fluorescerende markører. Yderligere fluorescerende markører tilvejebringe et middel til udspørgende flere aspekter af en patologi, samtidig eller kan anvendes, som i denne undersøgelse, at anvende mere kvantitative billeddannende fremgangsmåder såsom dobbelt reporter metoder til måling af in vivo binding potentiale, en markør for receptoren densitet ^26,27.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
IRDye 800CW-EGF	LI-COR Biosciences	926-08446
Alexa Fluor 647, succinimidyl ester	Life Technologies	A20106	Reacted with water to minimize non-specific binding