Datatomografiscanning-veiledet Time-domene Diffuse Fluorescence Tomography i Smådyr for lokalisering av kreft Biomarkører

Summary

Diffuse fluorescens tomografi tilbyr en relativt lav pris og potensielt høy gjennom tilnærming til preklinisk

Abstract

Liten dyr fluorescens molekylær imaging (FMI) kan være et kraftig verktøy for preklinisk medisiner og utviklingsstudier ^1. Men begrenser lys absorpsjon av vev chromophores (f.eks hemoglobin, vann, lipider, melanin) typisk optisk signal forplantning gjennom tykkelser større enn noen få millimeter ^2. Sammenlignet med andre synlige bølgelengder, vev absorpsjon for rødt og nær-infrarødt (nær-IR) lys absorpsjon dramatisk reduserer og ikke-elastisk spredning blir dominerende lys-vev interaksjon mekanisme. Den relativt ny utvikling av fluorescerende stoffer som absorberer og avgir lys i nær-IR rekkevidde (600-1000 nm), har drevet utvikling av imaging-systemer og lette forplantning modeller som kan oppnå hele kroppen tre-dimensjonal avbildning i små dyr ^3.

Til tross for store fremskritt i dette området forblir dårlig stilt natur diffus fluorescens tomografi en betydeligproblem for stabiliteten, kontrast utvinning og romlig oppløsning på bildet gjenoppbygging teknikker og den optimale tilnærming til FMI i små dyr er ennå ikke avtalt. Flertallet av forskningsmiljøer har investert i charge-coupled device (CCD)-baserte systemer som gir rikelig vev-sampling men suboptimal følsomhet ^4-9, mens vår gruppe og noen få andre ^10-13 har fulgt systemer basert på svært høy følsomhet detektorer , at på dette tidspunktet tillater tett vev prøvetaking for å bare oppnås på bekostning av lav bildebehandling gjennomstrømning. Her kan vi demonstrere metodikk for å søke ett foton oppdagelsen teknologien i en fluorescens tomografi system for å lokalisere en cancerous hjerne lesjon i en mus modell.

Fluorescens tomografi (FT) system ansatt enkelt foton telle med photomultiplier rør (PMT) og informasjons-rik tid-domene Light Detection i en ikke-kontakt konformasjon ^11. Dette gir en simultan collection for overført eksitasjon og utslipp lys, og inkluderer automatisk fluorescens eksitasjon eksponeringskontroll ^14, laser referering, og co-registrering med et lite dyr computertomografi (microCT) system ^15. En naken mus modell ble brukt for bildebehandling. Dyret ble inokulert orthotopically med et menneskelig glioma cellelinje (U251) i venstre cerebrale hemisfære og avbildes 2 uker senere. Svulsten ble laget for å fluoresce ved å injisere et fluorescerende sporstoff, IRDye 800CW-EGF (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) rettet mot epidermal vekstfaktorreseptor, en cellemembran protein kjent for å være overexpressed i U251 tumor linje og mange andre kreftformer ^18. En annen, vilkårlige fluorescerende sporstoff, Alexa Fluor 647 (Life Technologies, Grand Island, NY) ble også injisert å ta hensyn til ikke-reseptor medierte effekter på opptaket av de målrettede sporstoff for å gi et middel for å kvantifisere tracer bindende og reseptor tilgjengelighet / tetthet ^27. En CT-veiledet, tIME-domene algoritme ble brukt til å rekonstruere plasseringen av både fluorescerende sporstoff (dvs. plasseringen av svulsten) i mus hjernen og deres evne til å lokalisere svulsten ble bekreftet av Kontrastforsterket magnetisk resonans imaging.

Selv demonstrert for fluorescens bildebehandling i en glioma mus modell, kan metodikken presenteres i denne videoen bli utvidet til forskjellige tumormodeller i diverse små dyremodeller potensielt opp til størrelsen av en rotte ^17.

Protocol

1. Animal Forberedelse

1. Anesthetize naken mus (Charles River, Wilmington, MA) med intra-peritoneal injeksjon av ketamin-xylazin (100 mg / kg: 10 mg / kg ip).
2. Plasser musen i stereotactic ramme, lage et snitt i hodebunnen på venstre side av hodeskallen og ved hjelp av en 18-gauge nål, opprette en 1 mm diameter hull i skallen 2 mm fra den sentrale linjen og 2 mm bak bregma.
3. Injiser 5 × 10 ⁵ U251 humane nevrale glioblastom celler (vennlig levert av Dr. Mark Israel ved Dartmouth College, Hanover, NH) i 5 mL av fosfat buffer løsning i den venstre cerebral halvkule i en dybde på ca 2 mm under overflaten av hjerne. Bruk en Hamilton mikro-sprøyte ¹⁸ og en stump endte 27-gauge kanyle for celle implantasjon og stikk spissen av nålen 3 mm fra den ytre overflaten av hodeskallen og deretter trekke 1 mm for å skape en lomme for cellene.
4. Sutur innsnitt området og la recovery fra kirurgi.
5. Vent ~~~HEAD=NNS 14 dager slik at svulsten å vokse før bildebehandling.

2. Fluorescens Tomography System Calibration

1. På dagen for mus bildebehandling, initiere system og la lasere og detektorer lette å varme opp i ca 20 minutter for å unngå fonner i system følsomhet.
2. Plasser en 100 °-by-4 ° konstruert linje diffusor (Thorlabs, Newton, NJ) ved direkte midten av bildebehandling gantry, normal til eksitasjon laser: en picosecond-pulset 80-MHz multimode 635 nm laser diode (PicoQuant Photonics Nord America Inc., Westfield, Massachusetts). Juster vinkelen på diffusor for å maksimere mengden signal oppdaget av alle fem lys samling kanaler. En fullstendig beskrivelse av bildediagnostikk geometri er gitt andre steder ^11,14,15.
3. Plasser OD 2 nøytral tetthet filter (Thorlabs, Newton, NJ) foran alle fluorescens deteksjon photomultiplier rør (PMT) og OD 1 nøytral tetthet filter (Thorlabs, Newton, NJ) foran alle, U deteksjons PMTs. Samle 100 timelige puls spredning profiler (TPSF) av laser, hver med en 1-s integrasjon tid.
4. Normaliser hver TPSF av laser referanse, riktig for temporal drift i laseren referanse, og gjennomsnittet over alle gjentakelser for hver detektor. Disse gjennomsnittlig TPSFs er detektor-spesifikke instrument respons funksjoner (IRF) som brukes i optisk bilde gjenoppbygging.

3. Imaging Protokoll

1. Anesthetize musen med 2% isofluran i oksygen (1 L / min).
2. Injisere en nanomole av IRDye 800CW-EGF og en nanomole av Alexa Fluor 647 i 100 mL av fosfat buffer løsning, intraperitonealt, 12 timer før fotografering for å målrette epidermal vekstfaktorreseptor overexpression i svulsten.
3. Plasser musen over på glassfiber støtter av bildebehandling sengen, arrangering musen slik at nesen fortsatt i en kjegle levere isofluran anestesi.
4. Ensikker på at musen er plassert riktig på sengen: dvs. at når sengen er sikret i fluorescens tomografi systemet musen er på omtrentlig midt på bildebehandling gantry. Dette posisjonering kan bli veiledet av roterende eksitasjon laseren 180 ° om musen, slik at det sentrale punktet i laser lyser et punkt omtrent på midten av musen fra perspektivet av laser ved alle vinkler.
5. Når posisjonert, forsiktig overføre bildebehandling sengen og mus til microCT (utforske Locus, GE Healthcare, London, ON) skanner og samle anatomisk informasjon på en oppløsning på 93-mikrometer isotrop for hele hodet av musen.
6. Visualisere CT bildestakk og velg stykket (e) som skal avbildes med fluorescens tomografi systemet.
7. Forsiktig overføre bildebehandling sengen og musen tilbake til fluorescens tomografi systemet. Velg antall kilde stillinger for å samle inn data om musa for hver avbildning SLICe (32), integrering tid for hver TPSF måling (1 s), antall gjentakelser for hver kilde stilling (10), og den posisjon og antall ønskede bildebehandlingsprogrammer skiver fra CT bildestakk fra trinn 3.6. Tallene i parentes er typiske verdier for hver avbildning parameter som gir ~ 5 minutter datainnsamling per bildebehandling skive.
8. Plasser trippel notch filter (Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT) foran de fluorescens deteksjon PMTs, for å begrense eventuelle laserlys fra å nå fluorescens detektorer, og OD-2 nøytral tetthet filter foran de, U deteksjons PMTs å unngå metning av disse detektorer.
9. Kjør datainnsamlingen programvare, innsamling fluorescens og transmittans TPSFs på hver definert kilde detektor posisjon og for hver eksitasjon bølgelengde (635 nm og 755 nm til opphisse Alexa Fluor 647 og IRDye 800CW-EGF sporstoff, henholdsvis). For hvert sett av TPSFs samlet, overvåke og registrere laser intensitetmed en referanse PMT kanal.

4. Bilde Reconstruction

1. Bestem ytre overflaten av musen og plasseringen av imaging bed støtte stenger fra CT-bilder og lage masker som dekker rammen av musen og bildebehandling stenger separat.
2. Bruk musen maske for å produsere en endelig-element mesh av dyret ved hjelp av NIRFAST programvaren ^19.
3. Lokalisere kilde og detektor stillinger fra fluorescens tomografi system på overflaten av mesh basert på microCT og fluorescens romlig registrering koordinater ^20.
4. Fjern optiske datapunktene forbundet med kilde eller detektor stillinger som samhandler med plasseringen av imaging bed støtte stenger.
5. Normaliser data innsamlet ved hver kilde detektor posisjon av laser referanse, rette for timelige drift i laseren referanse, og riktig for filter sensitiviteter, som ble fastsatt av eksperimentell testing på kjøpstidspunktet ^15.
6. Ta Født Ratio av dataene (fluorescens delt på transmisjon) for hver kilde-detektor posisjon og multiplisere med en fremskutt modellsimulering overforingsmedium basert på finite-element dyr mesh for ensartede optiske egenskaper. Dette gjøres for å redusere feilene ved kilde-eller detektor-vev kopling ^21, for å kalibrere dataene til modellen ^22, og til å justere data for andre aspekter av modell-data mismatch ^23,24.
7. Konstruer en data vektor bestående av den skalerte forskjellen på født ratio data innsamlet ved begge bølgelengder. Den skaleringsfaktoren er valgt for å maksimere EGFR bindende kontrast. Utfør tid-domene bilde gjenoppbygging med de kalibrerte forskjellen data ved hjelp av TPSF for hver påvisning kanal som en inngang, og skape fluorescens kart over Kontrastforsterket målrettet tracer ^15.

5. Representative Resultater

"> Et eksempel på en fluorescens rekonstruksjon kledde med en co-registrert CT anatomisk bilde fra hodet av en mus med en U251 orthotopic glioma svulst er presentert i Figur 1b. Sentrum av massen av glioma bestemt av fluorescerende rekonstruksjon (Figur 1b ) var innen 1 mm fra tumor sentrum av masse bestemmes av kontrast-forbedre magnetisk resonans imaging (Figur 1a). CT og MR bilder ble gitt samtidig registrert basert på en gjensidig informasjon transformasjon.

Figur 1. Kontrastforsterket (Gadolinium) magnetisk resonans bilde av mus hode (a). Musen ble inokulert orthotopically med en U251 menneskelig glioma cellelinje. Plasseringen av svulsten, som absorberer mer kontrast agent enn den normale hjernen, kan ses i venstre cerebral halvkule (til høyre i bildet) og indikert med hvit pil. Den corresponding computertomografi bilde (fra samme sted på musen hodet) er avbildet i (b) med epidermal vekstfaktor målrettet fluorescens minus vilkårlige fluorescens gjenoppbygging overlappet. De enheter av fluorescens er i omvendt mm og forholder seg til absorpsjonskoeffisienten av bundne målrettet fluorescens multiplisert med Quantum effektiviteten og ved konsentrasjon sin.

Discussion

Fluorescens tomografi (FT) er en følsom, ioniserende stråling gratis molekylær imaging modalitet basert på synlig og nær-infrarødt lys transport gjennom biologisk vev. Mesteparten av interessen i FT har vært fokusert på dens potensial til å fremskynde medisiner og utvikling i små dyr eksperimentelle modeller ¹ og en sentralt område av forskningen har vært å studere kreft biomarkør uttrykk og respons på molekylære terapier ^26. I dag er det to konkurrerende tilnærminger til FT system design. Den vanligste design er basert på avkjølte charge-coupled enhet (CCD) kamera for fluorescens deteksjon ^4-9. Denne designen gir en høy tetthet av målinger, maksimere vev prøvetaking siden hver piksel i CCD kameraet kan oppdage lyset som har reist en unik bane gjennom vevet. Men CCD-kameraer har et begrenset dynamisk område og lese-out støygrenser deres ultimate følsomhet. Den andre unngår potensielle begrensninger sjoner av CCD-kamera deteksjon ved å benytte svært følsom single-foton telling teknologi basert på bruk av slike detektorer som photomultiplier rør eller rasfarlige fotodioder ^10-13. Ulempen med disse mer sensitive deteksjonsmetoder er at hver detektor kan bare samle lys på ett punkt, og derfor for å oppnå tett vev prøvetaking, enten mange detektorer må brukes (som er veldig dyrt), eller mange anslag må avbildes med samme detektor (som kan være tidkrevende). Mens optimalt nivå av vev prøvetaking for små dyr FT ikke er avtalt, og kan variere fra sak til sak, er det avtalt at single-foton telling instrumenteringen er bedre egnet til å utforske følsomheten grensene for FT i form av sin evne til å oppdage lave konsentrasjoner av molekylære markører. I denne studien, gir vi en metodikk for gjennomføring av FT bruker single-foton telling deteksjon instrumentering å lokalisere svulster i mus.

ent "> Det er fire viktige trinn er involvert for å produsere robuste datasett med tid-korrelerte singel-foton telle FT. Den første er bruken av en egnet og grei kalibreringsprosedyren. I presenterte metodikken, er de respektive sensitiviteten for hver deteksjon kanal utgjorde for ved å samle en baseline måling av eksitasjon lys sendes gjennom en linje-diffusor utformet for å lede like fraksjoner av lys til hver detektor ^15. Videre er oppdaget lyset under et eksperiment kontinuerlig kalibrert til laser referanse, både når det gjelder intensitet og betyr . gang, noe som kan variere over tid, ved drift av en laser referanse kanal ^11,15 Den andre kritiske trinnet er nøyaktig innsamling og co-registrering av anatomiske bildebehandling for guidede fluorescens rekonstruksjoner FT data alene gir ingen anatomisk informasjon.; Derfor, for å lage en modell av lys transport som kan brukes til å rekonstruere losering av fluorescerende kilder i et eksemplar fra den oppdaget fluorescens på overflaten av prøven, må anatomi av prøven i forhold til FT systemet nøyaktig kjent. I vårt system er anatomisk informasjon ervervet ved en mikro-computertomografi system med romlige koordinater som er romlig registrert med de av FT system ^15,20. Den tredje kritiske trinnet innebærer at en optimal eksponering (dvs. total foton deteksjon tid for hver laser projeksjon) er ansatt ved hver kilde-detektoren er plassert. Dette er viktig av to grunner: for det første å sikre at det er tilstrekkelig signal-til-støy ved hver detektering posisjon og andre for å unngå detektor metning, som kan skade de deteksjons enhetene. For å oppnå optimal eksponering ved hver detektor posisjon, er en automatisk eksponeringskontroll ansatt som triangulates hovedsak den optimal eksponering fra to, lav-signal eksponeringer ^14. Den fjerde kritisketrinn i metodikken refererer til de innsamlede fluorescens data til mengden av overførte eksitasjon lys. Dette referering kalles ofte Født forholdet, og gir mange fordeler for FT, med det viktigste man være en reduksjon av modell-data mismatch feil ^23,24. Den presenterte systemet ble utviklet for å oppdage både fluorescens og sendt eksitasjon lys samtidig ved å kanalisere lyset i hvert deteksjon kanal inn i 2 separate photomultiplier rør. Ved å gjøre dette unngår vi eventuelle effekter av bevegelse på nøyaktigheten av Born forholdet.

Med en robust datasett det hånd, innebærer bilde rekonstruksjon av tid-domene data løse den inverse problemet med elementmetoden mesh ha uttrykket:

d = Jx

der d er en vektor med n x m elementer for n kilde-detektor anslag og m TPSF tid porter, J er en n x m-by-l følsomhet matrise (eller Jacobian), for l noder i mesh, og x er vektor av fluorescens optiske egenskapene i hver node, har størrelse L d er de kalibrerte data samlet inn under eksperimentet og J er simulert ved hjelp av elementmetoden løsningen. til tidspunktet domenet spredning tilnærming av fluorescens transport ^25. Den tid-dimensjonen J er også convolved med detektoren spesifikke instrument respons funksjoner. X er en representasjon av fluorescens kartet av renter og løses for å bruke en Levenberg-Marqardt ikke-negativ minste kvadraters metode med Tikhonov regularisering ^15.

Metodikken som presenteres her, som beskriver en prosedyre i stand til å lokalisere fluorescensmerkede svulster i mus ved hjelp av svært sensitive foton telle fluorescens deteksjon, har potensial til å presse grensene for FT. I en tidligere studie, potensialet for å ansette dennetilnærmingen i større-enn-mus dyr modeller, for eksempel rotter, samt økt følsomhet over eksisterende system design i mus-sized prøvene, ble demonstrert ^17. Den umiddelbare anvendelsen av denne tilnærmingen ville være for overvåking av biomarkør uttrykk in vivo i små dyr tumormodeller å vurdere legemidlets effekt i en high-throughput midler. Muligheten av systemet for å opphisse og oppdage fluorescens på flere bølgelengder gir samtidig påvisning av flere fluorescerende markører. Ytterligere fluorescerende markører gi et middel for å forhøre flere aspekter av en patologi, samtidig, eller kan brukes, som i denne studien, for å ansette flere kvantitative tenkelig tilnærminger som dual-reporter metoder for å måle in vivo bindende potensial, en markør av reseptor tetthet ^26,27.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
IRDye 800CW-EGF	LI-COR Biosciences	926-08446
Alexa Fluor 647, succinimidyl ester	Life Technologies	A20106	Reacted with water to minimize non-specific binding