Datortomografi-guidad Time-domän Diffus fluorescens Tomography i små djur för lokalisering av cancer biomarkörer

Summary

Diffus fluorescens tomografi erbjuder en relativt låg kostnad och potentiellt hög hela inställning till preklinisk

Abstract

Small Animal fluorescens molekylär avbildning (FMI) kan vara ett kraftfullt verktyg för preklinisk läkemedelsutveckling och studier utveckling ^1. Begränsar dock ljusabsorption av vävnadsinrättningar kromoforer (t.ex. hemoglobin, vatten, lipider, melanin) vanligtvis optisk signal utbredning genom tjocklekar större än några millimeter ^2. Jämfört med andra synliga våglängder, vävnad absorptions för rött och infrarött (nära-IR) Ijusabsorption dramatiskt minskar och icke-elastisk spridning blir den dominanta ljus-vävnad interaktion mekanism. Den relativt sena utvecklingen av fluorescerande medel som absorberar och avger ljus i det nära IR-området (600-1000 nm) har drivit utvecklingen av bildsystem och lätta modeller förökning som kan uppnå hela kroppen tredimensionell avbildning i små djur ^3.

Trots stora framsteg på detta område förblir illa ställt natur diffus fluorescens tomografi en betydandeproblem för stabiliteten, kontrast återhämtning och rumsliga upplösningen av tekniker bildrekonstruktion och optimala lösningen för FMI i små djur har ännu inte kommit överens om. Majoriteten av forskargrupper har investerat i charge-coupled device (CCD)-baserade system som ger rikligt vävnads-sampling, men suboptimal sensitivitet ^4-9, medan vår grupp och några andra ^10-13 har drivit system baserade på mycket hög känslighet detektorer att vid denna tidpunkt att tät vävnad provtagning kan endast uppnås på bekostnad av låg avbildning genomströmning. Här visar vi en metod för att tillämpa en-foton-detekteringsteknik i en fluorescens tomografi system för att lokalisera en cancerartad hjärnskada i en musmodell.

Fluorescensen tomografi (FT) system som används enstaka fotonräknande med fotomultiplikatorrör (PMT) och informationsrik time-domain detektering av ljus i en icke-kontakt konformation ^11. Detta ger en samtidig colling av överförd excitation och emission ljus, och inkluderar automatisk fluorescenskontroll excitation exponering ^14, laser referenser, och co-registrering ett litet djur datortomografi (microCT) system ^15. En naken musmodell användes för avbildning. Djuret ympades ortotopiskt med en mänsklig gliom cellinje (U251) i vänster hjärnhalva och avbildas 2 veckor senare. Tumören har gjorts för att fluorescera genom insprutning av en fluorescerande spårämne, IRDye 800CW-EGF (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) riktade mot receptorn för epidermal tillväxtfaktor, en cellmembranprotein känt att vara överuttryckt i U251 tumörlinje och många andra cancerformer ^18. En andra, oriktade fluorescerande spårämne, Alexa Fluor 647 (Life Technologies, Grand Island, NY) injicerades också att ta hänsyn för icke-receptormedierade effekter på upptaget av de riktade spårämnen för att ge ett medel för att kvantifiera spårämne bindning och receptor tillgänglighet / täthet ^27. En CT-guidad, tIME-domänen algoritm användes för att rekonstruera den plats både fluorescerande spårämnen (dvs. placeringen av tumören) i mushjärna och deras förmåga att lokalisera tumören bekräftades genom kontrastförstärkt magnetisk resonanstomografi.

Även visat för fluorescens avbildning i en gliom musmodell, kan den metod som presenteras i denna video utökas till olika tumörmodeller i olika små djurmodeller eventuellt upp till storleken av en råtta ^17.

Protocol

1. Djur Framställning

1. Bedöva nakenmus (Charles River, Wilmington, MA) med intraperitoneal injektion av ketamin-xylazin (100 mg / kg: 10 mg / kg ip).
2. Placera musen i stereotaktisk ram, gör ett snitt i hårbotten på vänstra sidan av skallen och med hjälp av en 18-nål, skapa en 1 mm diameter hål i skallen 2 mm från den centrala linjen och 2 mm bakom bregma.
3. Injicera 5 x 10 ⁵ U251 humana neuronala glioblastomceller (vänligen tillhandahållen av doktor Mark Israel vid Dartmouth College, Hanover, NH) i 5 | il fosfatbuffert-lösning in i den vänstra cerebrala hemisfären på ett djup av ca 2 mm under ytan av hjärnan. Använda en Hamilton mikrospruta ¹⁸ och en trubbig 27-gauge nål för cellimplantation och in spetsen av nålen 3 mm från den yttre ytan av skallen och sedan dra tillbaka 1 mm för att skapa en ficka för cellerna.
4. Sutur snitt plats och tillåta vidareutnyttjandeåterhämtning från kirurgi.
5. Vänta ca 14 dagar för att låta tumören att växa innan avbildning.

2. Fluorescens Tomografi systemkalibrering

1. På dagen för mus avbildning, initiera systemet och tillåter lasrar och Ijusdetektorer för att värma upp i ca 20 minuter för att undvika avdrift i systemets känslighet.
2. Placera en 100 °-av-4 ° konstruerad linje diffunderaren (Thorlabs, Newton, NJ) vid den direkta centrum av det bildgivande gantryt, vinkelrätt mot exciteringslaserns: en pikosekund-pulsad 80-MHz-multimod 635 nm laserdiod (PicoQuant Photonics North America Inc., Westfield, MA). Justera vinkeln på diffusorn för att maximera mängden av signalen som detekteras av alla fem kanaler ljusuppsamling. En fullständig beskrivning av avbildning geometrin någon annanstans ^11,14,15.
3. Placera OD 2 neutrala täthetsfilter (Thorlabs, Newton, NJ) framför alla fluorescensrör upptäckt fotomultiplikator (PMT) och OD 1 neutrala filter densitet (Thorlabs, Newton, NJ) framför alla PMT transmittans upptäckt. Samla 100 temporala profiler puls spridda (TPSF) hos lasern, vardera med en 1-ar integrationstid.
4. Normalisera varje TPSF av lasern hänvisning korrekt för temporal drift i lasern referens, och i genomsnitt över alla iterationer för varje detektor. Dessa medelvärden TPSFs är detektorn-specifika instrumentets svar funktioner (IRF) som används i den optiska bilden återuppbyggnad.

3. Imaging Protokoll

1. Bedöva musen med 2% isofluran i syre (1 L / min).
2. Injicera 1 nanomol IRDye 800CW-EGF och 1 nanomol av Alexa Fluor 647 i 100 pl fosfatbuffert-lösning, intraperitonealt, 12 h före avbildning för att rikta epidermal tillväxtfaktor överuttryck factor receptor i tumören.
3. Placera musen på glasfibern stöder av avbildningsanordningen bädden, att anordna mus så att dess främre förblir i en kon leverera isoflurananestesi.
4. EnSe till att musen är placerad på lämpligt sätt på sängen, dvs att när sängen är fäst i fluorescensen tomografi systemet musen är i ungefär mitten av avbildning portalen. Denna positionering kan styras genom att rotera exciteringslaserns 180 ° kring den mus, som säkerställer att fokalpunkten för lasern belyser en punkt ungefär på mitten av mus ur lasern vid alla vinklar.
5. När placerade försiktigt överföra avbildning sängen och mus till microCT (utforska Locus, GE Healthcare, London, ON) scanner och samla anatomisk information med en upplösning på 93-m isotropiskt för hela huvudet av musen.
6. Visualisera CT bildstapel och välj slice (er) som skall avbildas med fluorescensen tomografi systemet.
7. Försiktigt överföra avbildning sängen och musen tillbaka till fluorescensen tomografi systemet. Välj antal källkods-lägen för att samla in data om musen för varje avbildning SLICe (32), integrationstiden för varje TPSF mätning (1 s), antalet iterationer för varje källa läge (10), och positionen och antalet önskade avbildande skivorna från CT-bilden stapeln från Steg 3,6. Siffrorna inom parentes är typiska värden för varje avbildning parameter ger ~ 5 minuter datainsamling per avbildning skiva.
8. Placera trippel notch-filter (Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT) framför de fluorescensdetektering PMT att begränsa eventuella laserljus från att nå fluorescens detektorer, och OD 2 neutrala filter densitet i framför PMT transmittansegenskaperna upptäckt att undvika mättnad av dessa detektorer.
9. Köra programmet för datainsamling och samla fluorescensen och TPSFs transmittans vid varje bestämd källa detektor position och för varje excitationsvåglängd (635 nm och 755 nm för att excitera Alexa Fluor 647 och IRDye 800CW-EGF spårämnen, respektive). För varje uppsättning av TPSFs insamlade, övervaka och spela in lasern intensitetenmed en referens PMT kanal.

4. Bildrekonstruktion

1. Bestäm den yttre ytan av musen och placeringen av det stöd imaging sängen stavar från CT bilder och skapa masker som täcker gränserna för musen och stavarna avbildning separat.
2. Använd musen för masken att producera en finita element mesh av djuret med hjälp av NIRFAST programmet ^19.
3. Lokalisera källan och detektorn positioner från fluorescensen tomografisystem på ytan av nätet baserat på microCT och fluorescens spatiala registrering koordinater ^20.
4. Ta bort optiska datapunkter samband med ursprungs-eller detektor positioner som interagerar med platsen för stöd imaging säng stavar.
5. Normalisera data som samlas in varje källa detektor position genom att lasern referens, korrekta för temporal drift i lasern referens, och korrigera för filter känslighet, vilket bestämdes genom experimentella undersökningar vid tidpunkten för köpet ^15.
6. Ta Född Ratio av data (fluorescens dividerat med transmittans) för varje källa-detektor position och multiplicera med en framtida modellen simulering av transmittans baserad på finita element djuret mesh enhetliga optiska egenskaper. Detta görs för att minska fel i samband med source-eller detektor-vävnaden koppling ^21, att kalibrera data till modellen ^22, och att anpassa data för andra aspekter av modell-data mismatch ^23,24.
7. Konstruera en datavektor som består av den skalade skillnaden mellan de födda förhållande uppgifter som samlats in vid båda våglängderna. Skalfaktorn väljs för att maximera EGFR bindande kontrast. Utför tidsdomän bildrekonstruktion med kalibrerade skillnaden data med hjälp av TPSF för varje upptäckt kanal som en ingång, och skapa fluorescens kartor över riktade kontrastförstärkt spårämne ^15.

5. Representativa resultat

"> Ett exempel på en fluorescens rekonstruktion belagd med ett co-registrerat CT anatomiska bilden från huvudet på en mus med en U251 ortotopisk gliom tumören visas i figur 1b. Centrum massa gliom bestäms av fluorescerande återuppbyggnad (Figur 1b ) var inom 1 mm av tumören masscentrum bestäms av kontrastförstärkt öka magnetisk resonanstomografi (Figur 1a). De CT och MR bilderna tillsammans registrerades bygger på ömsesidig-information transformation.

Figur 1. Kontrastförstärkt (gadolinium) magnetisk resonans bild av mus huvud (a). Den mus inokulerades ortotopiskt med en U251 humana gliomcellinjen. Placeringen av tumören, som absorberar mer kontrastmedel än den normala hjärnan, kan ses i den vänstra cerebrala hemisfären (till höger i bilden) och anges med vit pil. Den corresponding datortomografi bild (från samma plats på musen huvudet) visas i (b) med epidermal tillväxtfaktor riktade fluorescens minus oriktade fluorescensen återuppbyggnaden överlagrad. Enheterna av fluorescens är i omvänd mm och avser absorptionskoefficienten bundet riktad fluorescens multiplicerat med DQE och dess koncentration.

Discussion

Fluorescens tomografi (FT) är en känslig, joniserande strålning utan molekylär avbildning modalitet baserade på synliga och nära infraröda ljuset transport genom biologisk vävnad. Det mesta av intresset för FT har fokuserat på dess potential att påskynda läkemedelsutveckling och utveckling i små djurexperimentella modeller ¹ och ett mycket viktigt område för forskningen har varit att studera cancer biomarkör uttryck och reaktion på molekylära behandlingar ^26. För närvarande finns det två konkurrerande metoder för FT-system design. Den vanligaste konstruktionen är baserad på kylda charge-coupled device (CCD) kameror för fluorescensdetektion ^4-9. Denna utformning ger en hög täthet av mätningar, vilket maximerar vävnadsprovtagning eftersom varje pixel i CCD-kameran kan detektera ljus som har färdats en unik väg genom vävnaden. Men CCD-kameror har en begränsad dynamiskt omfång och avläsning brus begränsar deras slutliga känslighet. Den andra konstruktionen undviker potentiell begränsning tioner av CCD-kameran detektering genom användning av mycket känsliga enda fotonräkning teknik baserad på användningen av sådana detektorer som fotomultiplikatorrör eller fotodioder lavin ^10-13. Nackdelen med dessa mer känsliga metoder för detektering är att varje detektor endast kan samla ljus vid en enda punkt, och därför att åstadkomma tät vävnad provtagning, antingen många detektorer måste användas (vilket är mycket dyr) eller många utsprång måste avbildas med samma detektor (som kan vara tidskrävande). Medan den optimala nivån av vävnad provtagning för små djur FT inte har avtalats, och kan variera från fall till fall, är det överenskommet att enda fotonräkning instrumentering bättre lämpad att utforska känslighet gränserna för FT i form av sin förmåga att detektera låga koncentrationer av molekylära markörer. I denna studie ger vi en metod för att genomföra FT med single-photon instrumentering räknar upptäckt att lokalisera tumörer hos möss.

ENT "> Det finns fyra viktiga stegen för att producera robusta dataset med tidskorrelerade enda fotonräknande FT. Den första är tillämpningen av en lämplig och enkel kalibrering. I den presenterade metoden är respektive känslighet för varje detekteringskanal svarade för uppsamling av en baslinjemätning av excitationsljus som sänds genom en linje-diffusor utformad för att rikta lika stora fraktioner av ljus till varje detektor ^15. Vidare är det detekterade ljuset vid ett experiment kontinuerligt kalibreras för att lasern referens, i termer av både intensitet och medelvärdet .-tid, vilket kan variera över tiden, genom användning av en laser referenskanalen ^11,15 Det andra kritiska steget är korrekt insamling och sam-registrering av anatomisk avbildning för guidade fluorescens rekonstruktioner FT uppgifter enbart erbjuder ingen anatomisk information. Därför, för att skapa en modell av ljus transport som kan användas för att rekonstruera den lokatjon av fluorescerande källor inom ett prov från den detekterade fluorescensen vid ytan av provet, måste anatomi av provet i förhållande till FT systemet vara exakt känd. I vårt system är den anatomiska information som inhämtats genom en mikro-datortomografi system med rumsliga koordinater som har rumsligt registrerats med dem i FT-systemet ^15,20. Det tredje kritiska steget innebär att säkerställa att en optimal exponering (dvs. totalt fotondetektering tid för varje laser projektion) är anställd vid varje källa-detektor position. Detta är viktigt av två skäl: För det första att se till att det finns tillräckligt med signal-till-brus vid varje upptäckt läget och andra att undvika detektorn mättnad, vilket kan skada upptäckt enheterna. För att uppnå optimal exponering vid varje detektor läge, en automatisk exponeringskontroll anställd som i huvudsak triangulates optimal exponering från två låg signal exponeringar ^14. Den fjärde kritiskasteg av metoden refererar de uppsamlade fluorescensdata till mängden överförda excitationsljus. Detta referenser kallas ofta Född förhållandet, och ger många fördelar för FT, med den viktigaste är en minskning av modell-data oöverensstämmelsefel ^23,24. Det presenterade systemet utformades för att detektera både fluorescens-och sänd excitationsljus samtidigt genom att kanalisera ljuset i varje detekteringskanal i 2 separata fotomultiplikatorrör. Genom att göra detta undviker vi några effekter av rörelse på noggrannheten i Born förhållandet.

Med en robust datamängd det sidan innebär bildrekonstruktion tid-domän uppgifter att lösa inversa problemet med finita element nät med uttrycket:

d = Jx

där d är en vektor med n x m element för n källa-detektor utsprång och m TPSF tid grindar; J är en n x m-för-l känslighet matrix (eller Jacobian), för l noder i nätet, och x är vektorn av fluorescens optiska egenskaper i varje nod, med storlek L d är de kalibrerade data som samlas in under experimentet och J simuleras med hjälp av finita element lösningen. till tidsdomänen diffusion tillnärmning av fluorescens transportmedel ^25. Den tids-dimension J också faltad med detektorn specifika funktioner instrumentets respons. Är en representation av fluorescens karta av intresse och löses för att använda en Levenberg-Marqardt icke-negativ minsta kvadratmetoden tillvägagångssätt med Tikhonov reglering ¹⁵ x.

Den metod som presenteras här, som beskriver en process som kan lokalisera fluorescensmärkta tumörer i möss med hjälp av mycket känsliga fotonräknande fluorescensdetektering, har potentialen att pressa gränserna för FT. I en tidigare studie, den potential som använder dennatillvägagångssätt i större än möss djur modeller, såsom råttor, samt förbättrad känslighet över befintliga systemet mönster i mus-storlek prover, visades ^17. Omedelbar tillämpning av denna metod skulle vara för övervakning av biomarkörer uttryck in vivo i små djurtumörmodeller att bedöma läkemedlets effektivitet i en hög genomströmning medel. Förmågan hos systemet att excitera och detektera fluorescens vid multipla våglängder tillåter samtidig detektion av flera fluorescerande markörer. Ytterligare fluorescerande markörer ger ett medel för att förhöra flera aspekter av en patologi, samtidigt, eller kan användas, som i denna studie, att anställa fler kvantitativa imaging metoder såsom dubbla reporter metoder för att mäta in vivo bindningen potential, en markör för receptortäthet ^26,27.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
IRDye 800CW-EGF	LI-COR Biosciences	926-08446
Alexa Fluor 647, succinimidyl ester	Life Technologies	A20106	Reacted with water to minimize non-specific binding