Summary
De snelle ontwikkeling, de kleine oppervlakte en de transparantie van de zebravis zijn enorme voordelen voor de studie van aangeboren immuunsysteem controle op infecties
Abstract
Verspreid candidiasis door het pathogeen Candida albicans een klinisch belangrijke probleem opgenomen personen en is verbonden met 30 tot 40% aan mortaliteit 6. Systemische candidiasis wordt normaliter gestuurd door aangeboren immuniteit, en personen met genetische defecten bij aangeboren immuunresponsen cel componenten, zoals fagocytensysteem NADPH oxidase zijn vatbaarder voor candidemia 7-9. Er is weinig bekend over de dynamiek van C. albicans interactie met aangeboren immuunsysteem cellen in vivo. Uitgebreide in-vitro studies hebben aangetoond dat buiten de gastheer C. albicans kiemt binnenzijde van macrofagen en wordt snel vernietigd door neutrofielen 10-14. In vitro studies zijn nuttig, kan het complex niet vatten in vivo omgeving, tijdsafhankelijke dynamiek van cytokineniveaus, extracellulaire matrix bijlagen en intercellulaire contacten 10 omvat, 15-18
De zebravis larve biedt een unieke en veelzijdige gewervelde gastheer voor de studie van de infectie. Voor de eerste 30 dagen van de ontwikkeling zebravis larven hebben alleen aangeboren afweersysteem 2, 19-21, de vereenvoudiging van de studie van ziekten zoals gedissemineerde candidiasis die sterk afhankelijk zijn van aangeboren immuniteit. Het kleine formaat en de transparantie van de zebravis larven kunnen beeldvorming van de infectie dynamiek op cellulair niveau voor zowel de gastheer en ziekteverwekker. Transgene larven met fluorescerende aangeboren immuunsysteem cellen kunnen worden gebruikt om bepaalde types cellen betrokken bij infectie 22-24 identificeren. Gemodificeerde antisense oligonucleotiden (Morpholinos) kan worden gebruikt voor het neerslaan verschillende immuun componenten zoals fagocyt NADPH oxidase en bestuderen als reactie op Fungal infectie 5. In aanvulling op de ethische en praktische voordelen van het gebruik van een kleine lagere gewervelde, de zebravis larven biedt de unieke mogelijkheid om het imago van de veldslag tussen pathogeen en gastheer zowel intravitally en in kleur.
De zebravis is gebruikt om het model-infectie voor een aantal menselijke pathogene bacteriën, en heeft bijgedragen tot de grote vooruitgang in ons begrip van mycobacteriële infectie 3, 25. Echter, pas onlangs hebben veel grotere pathogenen zoals schimmels zijn gebruikt om larven te infecteren 5, 23, 26, en tot op heden is er geen sprake van een gedetailleerde visuele beschrijving van de infectie methodologie. Hier presenteren we onze technieken voor achterhersenen ventrikel micro-injectie van prim 25 zebravis, met inbegrip van onze wijzigingen naar de vorige protocollen. Onze bevindingen met behulp van de larven zebravis model voor een schimmelinfectie afwijken van de in vitro studies en versterken de noodzaak om de gastheer-pathogeen Intera te onderzoekenActies in de complexe omgeving van de gastheer in plaats van de vereenvoudigde regeling van de petrischaal 5.
Protocol
Alle zebravis zorgprotocollen en experimenten werden uitgevoerd onder Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) protocol A2009-11-01.
1. Morfolino en larvale Injection Dishes
Experimentele duur: * (10-15 minuten)
Moeilijkheidsgraad: *
- Voor ei injecties, stelt een 2% agarose oplossing in steriel water en een magnetron. Wanneer de oplossing is afgekoeld giet er wat van in een extra diepe petrischaal (Fisher Scientific) totdat het is half vol. Cool op ijs en zorg ervoor dat de plaat waterpas is.
- Zodra de schotel is afgekoeld, giet 15 ml toplaag 2% agarose. Spuit een ei injectie gegroefde plastic mal (Adaptive Science Tools) met steriel water uit een spuitfles. Leg de mal groef kant naar beneden in de hete agarose. Wanneer de agarose is afgekoeld, gebruik dan een metalen platte spatel (VWR Scientific) om de mal van de Aga distantiërenroos. Verwijder langzaam het net uit de agarose. Wrap embryo injectie gerechten in Parafilm (VWR Scientific) en op te slaan omgekeerd bij 4 ° C.
- Voor vis larven injecties bereiden een 2% agarose als beschreven. Giet de oplossing in een standaard formaat petrischaal (VWR Scientific) en zet ze opzij totdat het stolt. Wrap larvale injectie gerechten in Parafilm en op te slaan omgekeerd bij 4 ° C.
2. Schimmelkweek Voorbereiding
Experimentele duur: ** (30 minuten)
Moeilijkheidsgraad: **
- Bereid gistextract-pepton-dextrose (YPD) agar platen 10 g / liter gistextract, 20 g / liter pepton, 20 g / liter dextrose en 20 g / liter agar in en autoclaaf. Voor YPD vloeistof bereiden 10 g / liter gistextract, 20 g / liter pepton, 20 g / liter dextrose en autoclaaf 20-30 minuten bij 121 ° C.
- Twee dagen voorafgaand aan de vissen infecties voor te bereiden een streep plaat uit bevrorenvoorraden van Candida albicans culturen op YPD agar aan enkele kolonies te verkrijgen.
- Incuberen bij 37 ° C geroerd.
- Doe 5 ml YPD bouillon in 16 x 150 mm cultuur buizen (VWR Scientific).
- De dag voor de vissen infecties kies 1 kleine kolonie op de YPD agar met een houten plug (VWR Scientific). Plaats de stick in de cultuur buis en draai rond om opnieuw te schorten kolonie in de YPD vloeistof.
- Groei nacht bij 37 ° C op een TC-7 Tissue Culture roller trommel uitgerust met een 14 inch reageerbuis wiel (New Brunswick Scientific).
- De volgende dag, spin down 1 ml van de cultuur op 14000x g gedurende 1 minuut in een 1,7 ml buis (Axygen). Verwijder de bovenstaande vloeistof en resuspendeer de pellet in resterende vloeistof door vortexen (VWR Scientific).
- Voeg 1 ml 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (VWR Scientific) en draaien zoals eerder beschreven.
- Herhaal de PBS was 3 keer.
- Verdunnen 1:100 verdunning in 1x PBS (10 pl van gewassen C. albicans tot 990 pi 1x PBS).
- Reken op een hemocytometer (VWR Scientific).
- Verdun 10 7 cellen / ml.
3. Zebravis Infecties
Experimentele duur: **** (1-3 uur)
Moeilijkheidsgraad: ****
- Verzamel embryo's op basis van hoofdstuk 5 en winkel in ei-water, 60 mg / L direct oceaan zouten (Fisher Scientific) in steriel gedeïoniseerd water.
- Met behulp van een stereomicroscoop zoals de Olympus SZ61 (Olympus), dechorionate embryo's op infectie dag. Gebruik Dumont Dumoxel een pincet (VWR Scientific) om het chorion 27 uit elkaar te trekken zoals het openen van een zak chips, of veeg de pincet prikken in de gesloten positie in het chorion en dan langzaam openen. De vissen moeten recht pop uit het chorion.
- Schud de extra diepe petrischaal met het deksel op om te vissen verplaatsen naar het centrum van de schotel. Overdracht vis aan de deksel van de schotel. Verwijder de ei-water-envervangen vers medium. Voeg vis media.
- Warme larvale injectie gerechten in een incubator bij 28 ° C. Bereid tricaïne methaan sulfonaat (West-Chemical Inc) verdunning van 200 ug / ml voor verlamming vis.
- Tel het gewenste aantal larven op infectie (20-50 vis). Leg vis in tricaïne methaan sulfonaat oplossing en wacht 1-2 minuten tot ze stoppen met bewegen.
- Zet de MPPI-3 injectie-eenheid (Applied Scientific Instruments). Zorg ervoor dat de druk schakelaar op "impuls" en de "pulsduur" is ingesteld op 9 met 3 PSI voor de tegendruk eenheid. Open de klep op de stikstoftank totdat de druk op de injectie-eenheid leest 30 psi.
- Plaats een getrokken micropipet 28 met 5 pi gevortext Candida albicans in een concentratie van 1x10 7 cellen / ml. Plaats de micropipet in de micropipet houder (Applied Scientific Instruments). Vul een lege extra diepe petrischaal met water. Verplaats de micropipet tot de tip die iks in het zicht alleen maar het aanraken van het oppervlak van het water via het ontleden van microscoop en het gebruik Dumont Dumoxel pincet (VWR Scientific) om de naald clip ongeveer 3 mm van de punt van de pipet getrokken.
- Druk op de voetschakelaar (Applied Scientific Instruments) om te controleren of de naald is afgekapt. U ziet de vloeistof te verspreiden als je succesvol. De diameter van de vloeistof bolus dient niet groter dan de diameter van de pupil van het prim 25 zebravis larve (0,21 mm, waarbij een gebied van 4,9 nL in volume). Stel de druk dus als de vloeistof bolus is te groot of te klein.
- Verdoven de vis tricaïne methaansulfonaat (200 ug / ml). Zodra de vis stil staan, draai de schaal met de deksel op tot de vis zijn in het centrum. Verzamel 50 vissen met een transfer pipet (Fisher Scientific). Tik op de zijkant van de pipet om de vis naar de punt af te wikkelen. Voorzichtig pipetteer vis op de larvale agarose schaal met behulp van zo weinig vloeistof mogelijk te maken.
- Lijn de vis met een gladde glazen staaf (oppassen niet om ze te verpletteren!). Zuig zoveel vloeistof als mogelijk af van de schotel. Gebruik een KimWipe naar Wick weg vocht.
- Plaats de larvale agarose schotel met vis onder de microscoop tot je een goed zicht op de vissen en de naald op hetzelfde moment. Haal het glas naald naar de vis. Zoom in op zowel de vis en de naald als je de naald naar de vissen te plaatsen. Verplaats voorzichtig de glazen naald in de otic blaasje 27, 29 (oor) van de eerste vis. Je weet als je eenmaal hebt verplaatst de naald in de vis, want als je de voetschakelaar (Applied Scientific Instruments) duwen, de achterhersenen ventrikel zal iets omhoog.
- Druk op de voetschakelaar (Applied Scientific Instruments) en kijk naar de vloeistof te verspreiden binnen achterhersenen de vis ventrikel 27. Trek de naald uit de vis en naar de volgende vissen. Herhaal de procedure totdat u geïnjecteerd hebt alle vissen op de plaat. Verwijder dEAD vis en injecteer vervangingen te houden van het aantal correcte (50 vissen). Voor elke groep van 50 vissen geïnjecteerd een nieuwe micro-injectie naald moet worden voorbereid, of de C. albicans bezinkt in de bodem van de naald en verstopt, of werpt geïnjecteerde concentratie.
- Was de vis af van de schotel door hengelen de schotel en spuiten ei-water op de vissen in een schone extra diepe petrischaal met 60 ml ei-water. Het is belangrijk dat u niet de vis op de agarose te verlaten langer dan 15-20 minuten of ze zullen uitdrogen en sterven.
- Herhaal de hele injectie proces totdat u klaar bent. Vergeet niet PBS en niet-pathogene geïnjecteerd controles.
- Wanneer u klaar bent, houden de vis bij 28 ° C.
- Sluit de stikstof tank klep. Zet de injectie-eenheid schakelaar van "puls" aan "continu" druk in de tank leiding af moet de drukval naar nul op dit punt. Terug te schakelen injectie-eenheid naar "Pulse". Zet de injectie-eenheid en het schoonmaken van het werkgebied. 4. Voorbereiden van de Fish for Imaging
- Bereid tricaïne methaansulfonaat oplossing voor (200 ug / ml). Stap uit besmette vis, en zet ze in tricaïne.
- Bereid 47,9 mL 0,4% laag smeltpunt agarose (VWR wetenschappelijke) in ei-water. Verwarm de oplossing door de magnetron. Koel af tot 37 ° C en voeg tricaïne methaansulfonaat (200 ug / ml) aan mengsel
- Als vissen worden geïmmobiliseerd in tricaïne methaan sulfonaat, pipet individuele vissen in een petrischaal (VWR wetenschappelijke) met 0,4% laag smeltpunt agarose (VWR Scientific).
- Vervolgens gaan de vissen van de lage smelt agarose in afzonderlijke putjes van een glazen bodem schotel (MatTek Corporation) voor de beeldvorming. Gebruik zo weinig laagsmeltende agarosegel mogelijk zodat de vis plat op de bodem van de schaal. Gebruik alleen genoeg van de tricaïne-agarose in te vullen in deNeR kringen van de glazen bodem schaal.
- Trek holle glazen staven BF120-69-10 (Sutter Instruments) met behulp van een Flaming Brown Micropipet Puller Model P-97 (Sutter Instruments) volgens Yuan et al.. 30. Kies het programma # 7 met de volgende voorwaarden warmte = 470, Velocity = 120, Tijd = 200. De resulterende naald 8 mm van schuine te kantelen en zodra afgekapt 3 mm boven de bovenkant heeft een diameter van ongeveer 10 pm.
- Plaats een glas micropipet in de beugels. Selecteer "Trek." De verwarming filament warmt de naald volgens het programma parameters en de glazen staaf wordt gescheiden in twee getrokken micropipetten. Bewaar micropipetten in een pipet opbergdoos (Suttre instrumenten).
- Verzamelen embryo volgens de methoden van Rosen et al.. 31. Gebruik een plastic zeef (Waren van Knutsford) om eieren te verzamelen uit de kweekbak (aquatische habitats). Houd de zeef op zijn kop over een extra diepe petrischaal en spoel na met tank water om eieren te verzamelen.
- Voor morfolino voorbereiding, toevoeging van 300 ul steriel water tot 300 nanomol van morfolino (GeneTools, LLC). Dit geeft een werkvoorraad van 1,0 mM.
- Controleer de concentratie van de morfolino met een NanoDrop (Thermo Scientific). Kies "nucleïnezuur en wijzigen monstertype" andere "en golflengte 265. Invoeren constant vermenigvuldigd het molecuulgewicht van het morfolino door 1000 gedeeld door de absorptivity coëfficiënt vermeld in het morfolino oligo eigenschappenblad.
- Blanco de nanodrop met 2 pl 0,1 N HCl. Vul 5 pi van de morfolino oplossing in 95 il 0,1 N HCl (20x verdunning). Plaats 2 pi van de verdunning op de nanodrop voetstuk en klik maatregel. Vermenigvuldig de concentratie door de verdunningsfactor (20). Dit geeft een werkende concentratie morfolino. Om de concentratie millimolair berekenen verdelen de concentratie verkregen door het molecuulgewicht van het morfolino.
- Bereid een werkvoorraad van morfolino in Danieau buffer (58 mM NaCl, 0,7 mM KCl, 0,4 mM MgSÛ4, 0,6 mM Ca (NO3) 2, 5,0 mM HEPES, pH 7,6) en 0,01% fenol rood (geregistreerde Scientific).
- Voor morfolino injectie werk te volgen van het protocol volgens Rosen et al.. 31 en Yuan et al.. 30. Spoel morfolino injectie gerechten met ei-water en warm bij 28 ° C gedurende 15 minuten. Verwijder het water uit injectie gerechten en line-up een-cell embryo's in de groeven van de injectie schaal (bereid uit punt 1) met een transferpipet. Elke plaat zal houden ongeveer 250 eieren. Injecteer 1-2 cellig stadium embryo's met morfolino. Eieren blijft in de een-cel stadium gedurende 15 minuten 27.
- Spoel geïnjecteerd eieren met ei-water wanneer u klaar bent (steriel gedeïoniseerd water met 60 mg / L Instant Ocean zouten) en doe dit in 60 ml ei-water in extra diepe petrischalen. Morfolino injectie gerechten kunnen worden hergebruikt. Spoel met ei-water wanneer u klaar bent en opslaan die omgekeerd bij 4 ° C.
- Voor de opslag van embryo's toe te voegen 60 ml ei-water voor te schotelen. Tel uit 110 embryo's met een transfer pipet in aparte extra diepe petrischaaltjes met 60 ml ei-water. Voeg 0.00003% methyleenblauw tot microbiële groei en incubeer embryo's te voorkomen bij 28 ° C.
- Om het tempo van ontwikkeling van embryo's te houden embryo gerechten bij 33 ° C gedurende 24 uur en podium volgens Kimmel et al.. 27, waardoor embryo's te ontwikkelen tot een hoogtepuntstam hoek van 75 ° (25 Prim fase 27).
- Voor larvale infectie werk bij te houden embryo's bij 28 ° C na het injecteren van met C. albicans.
- Elke dag te vervangen embryo gerechten met 60 ml vers ei-water.
- Bereid vis in een lage smelt agarose (volgens paragraaf 4.2) met tricaïne in glazen bodem beeldvorming gerechten (MatTek Corporation) zoals eerder beschreven. Zet de schaal op een Olympus IX-81 (Olympus) omkeermicroscoop podium. Breng de vis op scherp onder 4x vergroting onder differentieel interferentie contrast (DIC) licht. Afbeeldingen kunnen worden vastgelegd met 4x, 20x, en 40x vergroting in DIC, TRITC (tetramethyl rhodamine isothiocyanaat) en FITC (fluoresceïne-isothiocyanaat) filter instellingen.
- Gebruik een Olympus IX-81 geïnverteerde microscoop met een FV-1000 confocale laserscanning volgens Ariga et al.. 32. Gedrag tijd cursussen op 40x vergroting door het instellen van Z-stacks met 1-1,5 um plakjes elk uur van de infectie.
- Voor lange tijdsverloop beeldvorming van 2 uur of meer, leg een laag van lage smelt agarose op de top van de vissen in de beeldvorming schotel om de 2-3 uur. Dit voorkomt de agarose uitdrogen en malen de vis terwijl het wordt afgebeeld. Voor lange tijd cursussen met een klein aantal vissen, gebruik maken van een verwarmde fase (Bioptechs Inc) tot 28 ° C te houden tijdens infecties.
Experimentele duur: ** (30 minuten)
Moeilijkheidsgraad: **
5. Wijzigingen in verband met protocollen Jove
Micro-injectie Micropipetten
Experimentele duur: * (10-15 minuten)
Moeilijkheidsgraad: *
Embryo's worden verzameld, morfolino Injection en onderhoud
Experimentele duur: *** (1-2 uur)
Moeilijkheidsgraad: ***
Imaging
Experimentele duur: ***** (1-5 uur)
Moeilijkheidsgraad: ***
6. Representatieve resultaten
Een voorbeeld van een succesvolle achterhersenen ventrikel C. albicans infectie in een zebravis larve op 5 uur na infectie (hpi) en 24 hpi is in (figuur 1). Macrofaag-achtige cellen met verzwolgen C. albicans worden gezien in de achterhersenen ventrikel op 5 hpi. Door 24 hpi, C. albicans is binnen macrofaag-achtige cellens in de dorsale staart weefsel indicatief voor gedissemineerde candidiasis. Deze infectie resultaat is sterk afhankelijk van een nauwkeurige injectie van 10-15 gist-vorm C. albicans de achterhersenen ventrikel. Screening van besmette vis onmiddellijk na de injectie kan hiervoor zorgen.
Figuur 1 Transgene fli1:. EGFP 22, 33 larve besmet met CaF2-yCherry Candida albicans en afgebeeld intravitally door confocale microscopie. (AC) 5 uur na de infectie (A) Geïnfecteerd larve met EGFP-expressie macrofaag-achtige cellen op de plaats van infectie (achterhersenen ventrikel) Schaal bar = 100 micrometer. (B en C) Hogere vergroting beelden van dezelfde vis, met C. albicans in fagocyten. Schaal bar = 100 micrometer voor B en 10 urn voor C. (DF) 24 uur na de infectie (D) Geïnfecteerd larve met gedissemineerde candidiasis met CaF2-yCherry C. albicans in EGFP macrophage-achtige cellen in de dorsale staart weefsel. Schaal bar = 100 micrometer. (E en F) hoger vergroting beelden van dezelfde vis toont C. albicans in de staart van weefsel. Schaal bar = 100 micrometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De zebravis micro-injectie methode hier gepresenteerde verschilt van Gutzman et al.. 34 in dat we hier laten zien injectie door de otic blaasje in de achterhersenen ventrikel van 36 tot 48 hpf larven. De methode beschreven zorgt voor consistente injectie van 10-15 gist in het achterhersenen ventrikel met verminderde weefselbeschadiging. Dit protocol levert een eerste lokale infecties die door het lichaam verspreiden met 24 hpi (figuur 1) en resulteert in significante letaliteit / morbiditeit 5. De achterhersenen ventrikel is niet volledig afgesloten tot 48 HPF 27, 29. In dit vroege stadium van ontwikkeling macrofagen en neutrofielen migreren naar de plaats van infectie, fagocyteren C. albicans, en kan naar andere delen van het lichaam 5.
De ware kracht van dit systeem is afkomstig van de mogelijkheid om transgene zebravis combineren met fluorescerend eiwit tot expressie microben. We hebben een eigengineered wild-type en mutant vlekken C. albicans op constitutief te uiten mCherry, dTomato en eqFP650. De combinatie van deze expressie constructen met oxidatieve stress-responsieve promotoren maakt het ratiometrische kwantificering van oxidatieve stress in levende zebravis larven 5. Twee in vivo imaging van fluorescerende schimmels en fluorescerende aangeboren immuunsysteem cellen in de context van een mutant schimmel of vis morphant kan ook worden gebruikt om krachtig kwantificeren gewijzigd immuunresponsen zoals migratie naar de plaats van infectie, fagocytose van het pathogeen voorkomen van schimmelinfecties kieming en doden 5.
Er zijn verschillende technieken beschreven die problemen kunnen opleveren voor een beginnende gebruiker van dit protocol. Allereerst is het belangrijk dat de naald voldoende is geknipt en de injectiedruk goed ingesteld dat 5 nL C. albicans schorsing wordt gemicroinjecteerd. Om ervoor te zorgen deze kan controleren of de bolus die uit denaald is de grootte van de pupil van een prim 25 zebravis larve, zoals beschreven in paragraaf 3.8. Het is cruciaal dat de zebravis larven krijgen dezelfde hoeveelheid geïnjecteerde materiaal, dat kan door het screenen direct na infectie worden bevestigd door epifluorescentie om te controleren of er 10-15 gist in de achterhersenen ventrikel. Geïnjecteerd vis kan ook worden gehomogeniseerd en bedekt voor de verificatie van de eerste kolonievormende eenheden 5. Ten tweede is het belangrijk om te beschadigen bloedvaten in de achterhersenen ventrikel, aangezien dit vroege dood van de larven. Het is belangrijk de otic vesicle injecteren ongeveer 45 graden, zodat direct micro-injectie in de achterhersenen ventrikel. Ten derde, neem extra zorg niet te scheuren of beschadigen otic blaasje weefsel, wat kan leiden tot een verhoogde ontsteking op de plaats van infectie, die onafhankelijk is van de pathogeen infectie. Vierde moet injecties snel worden uitgevoerd wanneer larven worden op de agarose injectiop schotel. Larven links te lang op de schotel zal uitdrogen, en als dit gebeurt zal er sterfte in de PBS-geïnjecteerde vissen zijn. Het invullen van de infecties binnen 15 minuten en het verlaten van een resterende hoeveelheid water op de schotel, terwijl infecteren vis kan zowel helpen om dit probleem te verbeteren. Echter, waardoor te veel water op de schotel te maken injecties moeilijker met dwalende larven. Een alternatieve methode beschreven injectie oudere (4 dpf) vis is complexer maar voorkomt bloot larven lucht door Cosentino en collega 28.
De zebravis larve is tot nu toe gebruikt om aangeboren immuunrespons te modelleren om bacteriële, schimmel-en virale pathogenen 5, 26, 35-46. Deze baanbrekende studies hebben aangetoond het nut van dit model systeem voor het ontdekken van nieuwe cellulaire en moleculaire mechanismen in zowel de gastheer en ziekteverwekker. Samen met deze beschreven protocol, deze andere gepubliceerde werken bieden een basis voor andere laboratoriaRies tot gastheer-schimmel interactie in de context van een intact gastheer onderzoeken.
Hoewel nuttig in deze experimenten, de fli1: EGFP transgene lijn hier beschreven heeft wel zijn beperkingen. De fli1 gen uitgedrukt in endotheelcellen vasculatuur naast macrofaagachtige cellen 22. Vaak is de EGFP fluorescentie van het vaatstelsel kan het moeilijk maken om C. te detecteren albicans in macrofaagachtige cellen. Bovendien wordt de EGFP expressie macrofaagachtige cellen verminderd ongeveer 18-24 uur na infectie waardoor het moeilijk te detecteren. Een recent gepubliceerd macrofaag-specifieke transgene zebravis lijn heeft veel voordelen als een model voor macrofaag studies 23.
De beschreven infectie techniek biedt een entree aan een aantal krachtige genetische en fluorescentie microscopie hulpmiddelen die beschikbaar zijn bij de zebravis. Het kan worden gecombineerd met geschikte transgene vis en ontworpen C. albicans C. albicans, de frequentie van C. albicans spijsvertering, en de verdeling van C. albicans binnen aangeboren immuunsysteem cellen 5. Men kan dit protocol combineren het gebruik van morfolino antisense oligonucleotiden om de rol van individuele aangeboren immuunsysteem genen testen infectie 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs willen graag naar het laboratorium van Dr Carol Kim te bedanken voor micro-injectie opleiding, Clarissa Henry voor advies over de bespoediging ontwikkeling van het embryo en het gebruik van apparatuur, en Nathan Lawson om bij te dragen fli1: EGFP vis. Wij danken de leden van de Wheeler lab en Shawn Muren voor de kritische lezing van het manuscript. Wij zouden ook graag Mark Nilan voor vissen zorg en advies, en Ryan Phennicie en Kristin Gabor bedanken voor technisch advies over dit project. Dit werk werd gefinancierd door een MAFES onderzoek assistentschap aan K. Brothers, een MAFES Hatch subsidie E08913-08, en een NIH NCRR award P20RR016463 naar R. Wheeler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spawning tanks | Aquatic habitats | 2L | |
| 1.7 mL tubes | Axygen | MCT-175-C | |
| Instant Ocean | Fisher Scientific | S17957C | |
| Extra deep Petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-11Z | |
| Standard Petri dishes | VWR Scientific | 25384-302 | |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| Yeast Extract | VWR Scientific | 90000-726 | |
| Peptone | VWR Scientific | 90000-264 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Agar | VWR Scientific | 90000-760 | |
| Disposable Hemocytometer | VWR Scientific | 82030-468 | |
| Phosphate Buffered Saline | VWR Scientific | 12001-986 | |
| Dumont Dumoxel Tweezers | VWR Scientific | 100501-806 | |
| Wooden Dowels | VWR Scientific | 10805-018 | |
| KimWipes | VWR Scientific | 300053-964 | |
| Low Melt Agarose | VWR Scientific | 12001-722 | |
| Agarose for injection dishes | VWR Scientific | 12002-102 | |
| Flaming Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Hollow glass rods | Sutter Instruments | BF120-69-10 | For glass rods smooth glass by heating over bunsen burner |
| Pipette Storage Box | Sutter Instruments | BX10 | |
| MPPI-3 Injection system | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
| Back Pressure Unit | Applied Scientific Instrumentation | BPU | |
| Micropipette Holder kit | Applied Scientific Instrumentation | MPIP | |
| Foot Switch | Applied Scientific Instrumentation | FSW | |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | |
| Magnetic Base | Applied Scientific Instrumentation | Magnetic Base | |
| Tricaine methane sulfonate | Western Chemical Inc. | MS-222 | |
| Dissecting Scope | Olympus | SZ61 top SZX-ILLB2-100 base | |
| Confocal Microscope | Olympus | IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system | |
| TC-7 Tissue Culture Roller drum with 14 inch test tube wheel | New Brunswick Scientific | TC-7 | |
| Imaging Dishes | MatTek Corporation | P24G-1.0-10-F | |
| Pipette tips for loading needles | Eppendorf | 930001007 | |
| Plate pouring grids | Adaptive Science Tools | TU-1 | |
| Heated Stage | Bioptechs Inc. | Delta T-5 | |
| Flat Spatula | VWR Scientific | 82027-486 | |
| Plastic Sieves | Wares of Knutsford Online | 12 cm | |
| Parafilm | VWR Scientific | 52858-000 | |
| Vortex Genie | VWR Scientific | 14216-184 | |
| 16 x 150 mm Culture tubes | VWR Scientific | 60825-435 | |
| Nanodrop | Thermo Scientific | ND 2000 | |
| Phenol Red | VWR Scientific | 97062-478 | |
| HCl | VWR Scientific | 87003-216 | |
| NaCl | VWR Scientific | BDH4534-500GP | |
| KCl | VWR Scientific | BDH4532-500GP | |
| MgSO4 | VWR Scientific | BDH0246-500GP | |
| Ca(NO3)2 | VWR Scientific | BDH0226-500GP | |
| HEPES | VWR Scientific | BDH4520-500GP | |
| Morpholinos | GeneTools, LLC |
References
- Trede, N. S., Langenau, D. M., Traver, D., Look, A. T., Zon, L. I. The use of zebrafish to understand immunity. Immunity. 20, 367-379 (2004).
- Kanther, M., Rawls, J. F. Host-microbe interactions in the developing zebrafish. Curr. Opin. Immunol. 22, 10-19 (2010).
- Meeker, N. D., Trede, N. S. Immunology and zebrafish: spawning new models of human disease. Dev Comp Immunol. 32, 745-757 (2008).
- Tobin, D., May, R. C., Wheeler, R. T. Zebrafish: a see-through host and fluorescent toolbox to probe host-pathogen interaction. PLoS Pathog. , (2011).
- Brothers, K. M., Newman, Z. R., Wheeler, R. T. Live imaging of disseminated candidiasis in zebrafish reveals role of phagocyte oxidase in limiting filamentous growth. Eukaryot. Cell. 10, 932-944 (2011).
- Pfaller, M. A., Diekema, D. J. Epidemiology of invasive candidiasis: a persistent public health problem. Clin. Microbiol. Rev. 20, 133-163 (2007).
- Ashman, R. B. Innate versus adaptive immunity in Candida albicans infection. Immunol. Cell Biol. 82, 196-204 (2004).
- de Repentigny, L. Animal models in the analysis of Candida host-pathogen interactions. Curr. Opin. Microbiol. 7, 324-329 (2004).
- Rogers, T. J., Balish, E. Immunity to Candida albicans. Microbiol. Rev. 44, 660-682 (1980).
- Calderone, R., Sturtevant, J. Macrophage interactions with Candida. Immunol. Ser. 60, 505-515 (1994).
- Frohner, I. E., Bourgeois, C., Yatsyk, K., Majer, O., Kuchler, K. Candida albicans cell surface superoxide dismutases degrade host-derived reactive oxygen species to escape innate immune surveillance. Mol. Microbiol. 71, 240-252 (2009).
- Kumamoto, C. A., Vinces, M. D. Contributions of hyphae and hypha-co-regulated genes to Candida albicans virulence. Cell Microbiol. 7, 1546-1554 (2005).
- Lorenz, M. C., Bender, J. A., Fink, G. R. Transcriptional response of Candida albicans upon internalization by macrophages. Eukaryot. Cell. 3, 1076-1087 (2004).
- Rubin-Bejerano, I., Fraser, I., Grisafi, P., Fink, G. R. Phagocytosis by neutrophils induces an amino acid deprivation response in Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 11007-11012 (2003).
- Behnsen, J. Environmental dimensionality controls the interaction of phagocytes with the pathogenic fungi Aspergillus fumigatus and Candida albicans. PLoS Pathog. 3, e13 (2007).
- Lavigne, L. M. Integrin engagement mediates the human polymorphonuclear leukocyte response to a fungal pathogen-associated molecular pattern. J. Immunol. 178, 7276-7282 (2007).
- Newman, S. L., Bhugra, B., Holly, A., Morris, R. E. Enhanced killing of Candida albicans by human macrophages adherent to type 1 collagen matrices via induction of phagolysosomal fusion. Infect. Immun. 73, 770-777 (2005).
- Netea, M. G., Brown, G. D., Kullberg, B. J., Gow, N. A. An integrated model of the recognition of Candida albicans by the innate immune system. Nat. Rev. Microbiol. 6, 67-78 (2008).
- Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Dev. Comp. Immunol. 28, 9-28 (2004).
- Magnadottir, B. Innate immunity of fish (overview). Fish Shellfish Immunol. 20, 137-151 (2006).
- Sullivan, C., Kim, C. H. Zebrafish as a model for infectious disease and immune function. Fish Shellfish Immunol. 25, 341-350 (2008).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev. Biol. 248, 307-318 (2002).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117, e49-e56 (2011).
- Renshaw, S. A. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108, 3976-3978 (2006).
- Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Curr Opin. Microbiol. 11, 277-283 (2008).
- Chao, C. C. Zebrafish as a model host for Candida albicans infection. Infect. Immun. 78, 2512-2521 (2010).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. , 203-253 (1995).
- Cianciolo Cosentino, C., Roman, B. L., Drummond, I. A., Hukriede, N. A. Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury. J. Vis. Exp. (42), e2079 (2010).
- Haddon, C., Lewis, J. Early ear development in the embryo of the zebrafish, Danio rerio. J. Comp. Neurol. 365, 113-128 (1996).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
- Ariga, J., Walker, S. L., Mumm, J. S. Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation. J. Vis. Exp. (43), e2093 (2010).
- Redd, M. J., Kelly, G., Dunn, G., Way, M., Martin, P. Imaging macrophage chemotaxis in vivo: studies of microtubule function in zebrafish wound inflammation. Cell Motil. Cytoskeleton. 63, 415-422 (2006).
- Gutzman, J. H., Sive, H. Zebrafish Brain Ventricle Injection. J. Vis. Exp. (26), e1218 (2009).
- Davis, J. M. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17, 693-702 (2002).
- Meijer, A. H. Identification and real-time imaging of a myc-expressing neutrophil population involved in inflammation and mycobacterial granuloma formation in zebrafish. Dev. Comp. Immunol. 32, 36-49 (2008).
- Mathias, J. R. Live imaging of chronic inflammation caused by mutation of zebrafish Hai1. J. Cell Sci. 120, 3372-3383 (2007).
- Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Dev. Biol. 7, 42 (2007).
- Vergunst, A. C., Meijer, A. H., Renshaw, S. A., O'Callaghan, D. Burkholderia cenocepacia creates an intramacrophage replication niche in zebrafish embryos, followed by bacterial dissemination and establishment of systemic infection. Infect Immun. 78, 1495-1508 (2010).
- Le Guyader, D. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish. Blood. 111, 132-141 (2008).
- Clatworthy, A. E. Pseudomonas aeruginosa infection of zebrafish involves both host and pathogen determinants. Infect. Immun. 77, 1293-1303 (2009).
- Brannon, M. K. Pseudomonas aeruginosa Type III secretion system interacts with phagocytes to modulate systemic infection of zebrafish embryos. Cell Microbiol. 11, 755-768 (2009).
- Levraud, J. P. Real-time observation of listeria monocytogenes-phagocyte interactions in living zebrafish larvae. Infect. Immun. 77, 3651-3660 (2009).
- van der Sar, A. M. Zebrafish embryos as a model host for the real time analysis of Salmonella typhimurium infections. Cell Microbiol. 5, 601-611 (2003).
- Phennicie, R. T., Sullivan, M. J., Singer, J. T., Yoder, J. A., Kim, C. H. Specific resistance to Pseudomonas aeruginosa infection in zebrafish is mediated by the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Infect Immun. 78, 4542-4550 (2010).
- Prajsnar, T. K., Cunliffe, V. T., Foster, S. J., Renshaw, S. A. A novel vertebrate model of Staphylococcus aureus infection reveals phagocyte-dependent resistance of zebrafish to non-host specialized pathogens. Cell Microbiol. 10, 2312-2325 (2008).
