Summary
zebrafish의 급속한 발전, 소형 크기 및 투명성은 감염의 타고난 면역 제어 연구를위한 엄청난 장점입니다
Abstract
병원균 칸디다 albicans에 의한 전파 칸디다 증은 입원 개인에서 임상적으로 중요한 문제이며 30~40% 기인 사망률 6 연결되어 있습니다. 침투성 칸디다 증은 보통 타고난 면역에 의해 제어와 같은 식세포 NADPH 산화 효소로서 타고난 면역 세포 구성 요소의 유전적 결함을 가진 개인은 candidemia 7-9에 더 감염될 수 있습니다된다. 아주 조금은 C.의 역학에 대한 알려져있다 생체내의 타고난 면역 세포와 albicans 상호 작용. 체외 연구에서 광범위한 설립 있지 않은 호스트 C의 외부 albicans은 macrophages 안에서 germinates, 빠르게 neutrophils 10-14 의해 파괴된다. 체외 연구에서 유용하지만, 시토킨 레벨, 세포외 기질 첨부 파일 및 세포 연락처 10 시간 종속적인 역학을 포함 생체내 환경에서 복잡한 요점을 되풀이 수 없습니다 15-18
zebrafish의 유충이 감염 연구를위한 독특하고 다양한 척추 호스트를 제공합니다. 개발 zebrafish 애벌레의 첫 30 일 동안에만 타고난 면역 방어 2, 19-21는 타고난 면역력에 크게 의존 전파 칸디다 증과 같은 질병의 연구를 단순화합니다. zebrafish 애벌레의 작은 크기와 투명성은 모두 호스트 및 병원체에 대한 세포 수준에서 감염 역학 이미징을 가능하게합니다. 타고난 면역 세포를 fluorescing있는 유전자 변형 애벌레는 감염 22-24에 관련된 특정 세포 유형을 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 수정된 안티 센스 oligonucleotides (Morpholinos)은 같은 식세포 NADPH 산화 효소 등 다양한 면역 요소를 허물고 funga에 대한 응답으로 변화를 연구하는 데 사용할 수 있습니다난 감염 5. 작은 낮은 척추를 사용하는 윤리적하고 실용적인 장점 이외에도, zebrafish 애벌레 이미지 모두 intravitally와 색상의 병원체와 호스트 간의 총력전을에 독특한 기능을 제공한다.
zebrafish는 인간 병원성 박테리아의 여러 모델 감염에 사용되었으며, mycobacterial 감염 3 25 우리의 이해에 큰 발전의 수단이되었습니다. 단, 최근에 이러한 유충 5를 감염하는 데 사용되었습니다 진균류, 23, 26, 훨씬 더 많은 병원체를 가지고 있고, 감염 방법에 대한 자세한 영상 설명도 없어 데이트. 여기에서 우리는 이전 프로토콜에 대한 우리의 수정을 포함하여 꼼꼼한 25 zebrafish의 hindbrain의 뇌실의 microinjection을 위해 우리의 기술을 소개합니다. 곰팡이 감염 애벌레 zebrafish 모델을 사용하여 우리의 연구 결과는 체외 연구에서에서 갈리는과 호스트 병원체 intera 검사의 필요성을 강화오히려 배양 접시 5 간소화 시스템보다 호스트의 복잡한 환경에서 ction.
Protocol
모든 zebrafish 관리 프로토콜 및 실험 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 프로토콜 A2009-11-01하에 수행되었다.
1. Morpholino와 애벌레 사출 요리
실험 기간 : * (10-15분)
어려움의 정도 : *
- 달걀 주사 들어, 멸균 물, 전자렌지에 2 % 아가로 오스 솔루션을 준비합니다. 그것의 반을 가득 때까지 솔루션은 별도의 깊은 페트리 접시 (피셔 과학)에 일부를 부어 냉각되면. 얼음과 접시 레벨 확인에 좋았어.
- 접시가 냉각되면 2퍼센트 아가로 오스의 15 ML 상위 레이어를 붓는다. 스프레이 용기에서 멸균 물로 플라스틱 금형 (적응형 과학 도구)를 홈 붙이 달걀 주사 스프레이. 뜨거운 아가로 오스로 금형 그루브 측면을 조심스럽게 내려 놓습니다. 아가로 오스가 냉각되면, 아가의 몰드를 떼어 놓다하기 (VWR 과학) 금속 평평한 주걱을 사용하여상승했다. 천천히 아가로 오스의 격자를 제거합니다. 바꿈 배아 주입 Parafilm의 요리 (VWR 과학)과 매장은 4 ° C.에 뒤집혀
- 물고기 애벌레 주사 들어 설명한대로 2 % 아가로 오스 솔루션을 준비합니다. 표준 크기의 페트리 접시 (VWR 과학)에 솔루션을 붓고하고 굳은 때까지 따로 설정합니다. Parafilm 및 저장소에 랩 애벌레 사출 요리는 4 ° C.에 뒤집혀
2. 곰팡이 문화 준비
실험 기간 : ** (30 분)
어려움의 정도 : **
- 10g / 리터 효모 추출물, 20 G / 리터 펩톤, 20 G / 리터 덱스 트로 오스, 그리고 그리고 압력솥에 20g / 리터 한천 : 추출 - 펩톤 - 덱스 트로 오스 (YPD) 한천 플레이트 효모를 준비합니다. YPD 액체 121 10 G / 리터 효모 추출물, 20 G / 리터 펩톤, 20 G / 리터 덱스 트로 오스와 압력솥 20~30분 ° C. 준비를 위해
- 생선 감염 이전 이틀 냉동에서 탄력 플레이트를 준비YPD 한천쪽으로 칸디다 albicans 문화의 주식은 하나의 식민지를 구하십시오.
- 37 ° C 하룻밤 사이에 알을 품다.
- 16 X 150mm 문화 튜브 (VWR 과학)에 5 ML YPD의 국물을 넣고.
- 생선 감염 전에 하루 목조 은못 (VWR 과학)와 YPD 한천에 한 작은 식민지를 선택하십시오. YPD 액체에서 다시 정지 서식지 주변 문화 관과 소용돌이에 막대기를 넣고.
- 14 인치 시험관 휠 (뉴 브 런 즈윅 과학)가 장착된 TC-7 조직 문화 롤러 드럼에 37 ° C에서 하룻밤 성장.
- 다음 날, 1.7 ML 튜브 (Axygen)에서 1 분 14000x의 g에서 문화의 한 ML을 돌리다. 표면에 뜨는를 제거하고 vortexing (VWR 과학)에 의해 잔류 액체에 펠렛을 resuspend.
- 식염수를 (VWR 과학) 버퍼 한 ML 1X 인산을 추가하고 이전에 설명된대로 스핀.
- PBS 세척을 3 번씩 반복합니다.
- 1X PBS에 1:100 희석합니다 (990 μL 1X P로 형편없는 C. albicans 10 μL 희석학사).
- Hemocytometer (VWR 과학) 믿는 수 밖에.
- 10 7 셀 / ML로 희석.
3. Zebrafish 감염
실험 기간 : **** (1-3시간)
어려움의 정도 : ****
- 섹션 5와 달걀 물 저장소, 멸균 탈이온수 60 MG / L 인스턴트 바다 소금 (피셔 과학)에 따라 배아를 수집합니다.
- 이러한 올림푸스 SZ61 (올림푸스), 감염 당일 dechorionate 배아와 같은 해부 현미경을 사용. 칩 한 봉지를 열고, 또는 부드럽게 chorion로 닫힌 위치에 핀셋을 찌르지 후 천천히 열어처럼 chorion 27 분열 시키려고 뒤몽 Dumoxel 핀셋 (VWR 과학)를 사용합니다. 물고기 chorion을 들락 거 렸고 바로 쏴버릴테다.
- 뚜껑 접시의 중앙에 물고기 이동에있는 소용돌이 추가 깊은 페트리 접시를. 접시의 뚜껑으로 물고기를 전송합니다. 달걀 물을 제거하고새로운 미디어로 바꿉니다. 미디어로 물고기를 추가합니다.
- 28시 인큐베이터에서 따뜻한 애벌레 사출 요리 ° C. tricaine 메탄 산염 (서양 화학 주식 회사) 200 μg / 생선 anesthetizing위한 ML에서 희석을 준비합니다.
- 감염 (20-50 생선)에 애벌레 중 원하는 번호를 세어보세요. tricaine의 메탄 산염 용액에 생선을 넣고 그들이 계속 움직이게 때까지 1~2분을 기다립니다.
- MPPI-3 분사 장치 (응용 과학 인 스트 루먼트)를 켭니다. 압력 스위치는 "펄스"에 있고 "펄스 기간은"backpressure 단위 3 PSI와 9 설정되어 있는지 확인하십시오. 사출 장치의 압력은 30 PSI를 읽고 때까지 질소 탱크에 밸브를 엽니다.
- 1x10 7 셀 / ML의 농도에서 vortexed 칸디다 albicans의 5 μL로 뽑았 micropipette 28로드합니다. micropipette 홀더 (응용 과학 인 스트 루먼트)의 micropipette를 놓습니다. 물로 빈 여분 깊은 페트리 접시를 채우십시오. 끝까지 micropipette를 이동 전뷰 사이의 막 뽑아 피펫의 끝부분에서 3mm에 대해 바늘을 고정하기 위해 현미경 및 사용 뒤몽 Dumoxel 핀셋 (VWR 과학)을 해부를 통해 수면을 건드렸다.
- 바늘이 잘린되었는지 확인하기 위해 발 스위치 (응용 과학 인 스트 루먼트) 누르십시오. 당신이 성공한다면 액체가 분산 나타납니다. 액체 bolus의 지름은 꼼꼼한 25 zebrafish의 유충의 학생 (0.21 mm, 부피의 4.9 NL의 영역을 항복)의 직경보다 더 큰 없어야합니다. 액체 bolus이 너무 크고 또는 너무 작은 경우에 따라 압력을 조정합니다.
- tricaine의 메탄 산염의 물고기 (200 μg / ML)을 마취. 일단 물고기 이동 소용돌이들에게 물고기가 중앙에있을 때까지에서 뚜껑이있는 접시를 중단했습니다. 전달 피펫 (피셔 과학)를 사용하여 50 물고기를 수집합니다. 끝쪽으로 물고기를 진정시킬 수 있도록 피펫의 측면을 누릅니다. 부드럽게 가능한 한 작은 액체로 사용 애벌레 아가로 오스 접시에 생선을 피펫.
- 부드러운 유리 막대 (그들을 부수기 위해서는 않도록 주의해!) 함께 선 물고기. 접시 가능한 오프만큼 액체로 기음. 모든 수분을 멀리 등심하기 KimWipe을 사용합니다.
- 같은 시간에 고기와 바늘의 좋은 경치를 얻을 때까지 현미경 물고기와 애벌레 아가로 오스 요리를 둡니다. 물고기를 향해 유리 바늘을 이동합니다. 당신은 물고기를 향해 바늘을 위치로 물고기와 바늘 모두에 확대. 조심스럽게 첫 번째 물고기의 귀의 소포 27, 29 일 (귀)로 유리 바늘을 이동합니다. 당신은 물고기로 바늘을 이동 후에는 당신이 발 스위치 (응용 과학 인 스트 루먼트) 밀어 때 hindbrain의 뇌실 약간 들어올려 때문에 당신은 알게 되겠죠.
- 발 스위치 (응용 과학 인 스트 루먼트) 누르면 액체가 물고기의 hindbrain 뇌실 27 내부에 분산 봐요. 생선과 이동에서 다음 물고기에 바늘을 접어야합니다. 당신이 접시에 물고기를 모두 주입 때까지 절차를 반복합니다. 모든 d를 제거EAD 생선과 (50 생선) 번호가 정확 계속 교체 투입. 50 물고기의 각 그룹에 대한 새 microinjection 바늘이 준비되어야합니다 주입, 또는 C. albicans는 바늘의 맨 아래에 놓이게하고 나막신이나 주입 농도를 throw합니다.
- 접시를 낚시와 60 ML 달걀 물을 포함하고 깨끗한 추가 깊은 배양 접시에 생선에 달걀 물을 분사하여 접시의 생선을 씻으십시오. 그것은 이상 15-20분 동안 아가로 오스의 생선을 떠나지 않는 것이 중요 아니면 그들은 건조하고 죽을 것이다.
- 완료까지 전체 사출 과정을 반복합니다. PBS와 비 병원성 주입 컨트롤을 잊지 말라.
- 완료되면, 28에서 물고기를 유지 ° C.
- 질소 탱크 밸브를 닫습니다. 탱크 라인의 압력을 완화하기 위해 "지속적인"에 "펄스"에서 분사 장치 스위치를 이동, 압력이 시점에서 제로로 떨어질한다. "펄스"로 분사 장치를 전환합니다. 사출 장치를 끄고 작업 공간을 정리. 4. 이미징을 위해 물고기를 준비
- (200 μg / ml) 쇼핑은 이전처럼 tricaine의 메탄 산염 솔루션을 준비합니다. 감염된 물고기를 꺼내, 그리고 tricaine로 그들을 전송합니다.
- 달걀 물에 47.9 ML 0.4 % 낮은 용해 아가로 오스 (VWR 과학)를 준비합니다. microwaving하여 솔루션을 가열. 37까지 쿨 ° C와 혼합에 추가 tricaine의 메탄 산염 (200 μg / ml) 쇼핑
- 일단 생선 tricaine의 메탄 산염, 0.4 % 낮은 용해 아가로 오스 (VWR 과학)를 포함하는 배양 접시 (VWR 과학)로 피펫 개별 생선 꼼짝 못하고있다.
- 다음으로, 이미징을위한 유리 바닥 접시 (MatTek 공사)의 개별적인 우물에 낮은 용해 아가로 오스에서 물고기를 이동합니다. 생선 접시의 바닥에 평평하게 놓여 있으므로 가능한 한 적게 용해 아가로 오스로 사용합니다. 오직 채워 충분한 tricaine-아가로 오스의를 사용하여유리 바닥 접시의 NER 서클.
- 원 외에 따라 불타는 브라운 Micropipette 풀러 모델 P-97 (셔터 인 스트 루먼트). 30를 사용하여 중공 유리 막대 BF120 69-10 (셔터 인 스트 루먼트) 당겨라. 다음 조건 히트 = 470, 속도 = 120 시간 = 200으로 프로그램 # 7을 선택합니다. 결과 바늘 한번 그것이 약 10 μm의의 직경을 가지고 팁 위 3mm에 이어 8 베벨부터 끝까지 mm하고있다.
- 브라켓으로 유리 micropipette를로드합니다. "당겨"을 선택하십시오. 가열 필라멘트는 프로그램 매개 변수와 유리 막대 두 뽑아 micropipettes으로 분리됩니다에 따라 바늘을 가열합니다. 피펫 저장 상자 (Sutt의 상점 micropipettes근데 악기).
- 로젠 외. 31 방법에 따라 배아를 수집합니다. 산란 탱크 (수생 서식지)에서 달걀을 수집하기 위해 플라스틱 체에을 (Knutsford의 상품)를 사용합니다. 추가 깊은 페트리 접시 위에 거꾸로 체를 잡고 알을 수집 탱크 물로 린스.
- morpholino 준비 들면, morpholino 300 nanomoles (GeneTools, LLC)가 300 μL 멸균 물을 추가합니다. 이 1.0 mm의 작업 주식을 제공합니다.
- Nanodrop (써모 과학)를 사용하여 morpholino의 농도를 확인합니다. "핵산을하고 샘플 유형을 변경"을 선택 265에 다른 "와 파장. absorptivit로 나눈 1,000 의한 morpholino의 분자량을 곱하여 상수를 입력하십시오Y 계수는 morpholino oligo 속성 시트에 나열.
- 2 μL 0.1 N HCL과 빈 nanodrop. 0.1 N HCL (20x 희석)의 95 μL로 morpholino 솔루션의 5 μL를 희석. nanodrop 페데 스탈을 클릭 조치에 희석 2 μL를 놓습니다. 희석 계수 (20)의 농도를 곱하면됩니다. 이것은 morpholino의 작동 농도를 제공합니다. millimolar 농도를 계산하려면 morpholino의 분자량에 의해 얻은 농도를 나눕니다.
- Danieau 버퍼에 morpholino (58 MM NaCl 0.7 MM KCl, 0.4 MM MgSO 4, 0.6 MM 칼슘 (NO 3) 2, 5.0 밀리미터 HEPES, 산도 7.6)와 0.01 % 페놀 레드 (VWR 과학)의 작동 재고를 준비합니다.
- morpholino 주입 작업에 로젠 외. 31 만원 외. 30에 따라 프로토콜을 따릅니다. 15 분 동안 28 ° C에서 달걀 물과 따뜻한으로 morpholino 분사 요리를 씻어. 사출 요리와 라인 업 한 C에서 물을 제거내말이 맞지 단계의 전송 피펫으로 사출 접시 (제 1에서 준비)의 홈에 배아. 각 접시는 약 250 알을를 개최한다. morpholino로 1-2 세포 단계 배아를 주입. 계란 15 분 27 한 세포 단계에서 유지됩니다.
- 추가 깊은 배양 접시 60 ML 달걀 물에 주입 완료 달걀 물에 달걀 (60 MG / L 인스턴트 오션 소금과 멸균 탈이온수)와 장소를 씻어. Morpholino 주입 요리 활용할 수 있습니다. 완료되면 달걀 물로 헹굼과 4 ° C.에 거꾸로 저장
- 스토리지를위한 배아로 뗀다는 60 ML 달걀 물을 추가합니다. 60 ML 달걀 물을 별도의 추가 깊은 배양 접시에 트랜스퍼 피펫으로 110 배아를 세어보세요. 28에서 미생물의 성장과 부화에 배아를 방지하기 위해 파란색 0.00003 %의 메틸렌 추가 ° C.
- 배아의 개발을 빠르게하기 위해서는 배아는 머리로 개발할 수 있도록 Kimmel 외. 27에 따라 24 시간 무대를 위해 33 ° C에서 배아 요리를 유지75 트렁크 각도 ° (꼼꼼한 25 단계 27).
- 애벌레 감염 업무 내용 C. 주사 후 28 ° C에서 배아를 유지 albicans.
- 매일 60 ML 신선한 달걀 물로 배아 요리를 바꿉니다.
- 앞서 설명한 유리 바닥 이미징 요리 (MatTek 주식 회사)에서 tricaine과 낮은 용해 아가로 오스 (4.2 절에 따라)에 물고기를 준비합니다. 올림푸스 IX-81 (올림푸스) 거꾸로 현미경 스테이지에서 접시를 놓습니다. 미분 간섭 대비 (DIC) 빛 아래에서 4X 배율 미만의 초점으로 물고기를 가져와. 이미지 4X, 20x에서 캡처하고, DIC, TRITC (tetramethyl rhodamine의 isothiocyanate) 및 FITC (플루오레신 isothiocyanate) 필터 설정에서 40x 배율. 수 있습니다
- FV-1과 올림푸스 IX-81 거꾸로 현미경을 사용하여000 레이저 Ariga 외 따라 공촛점 시스템을 스캔. 32. 1-1.5 μm의의 조각 감염의 모든 시간과 Z-스택을 설정하여 40x 배율에서 시간 과정을 실시합니다.
- 이시간 이상의 긴 시간 코스 이미징은 이미징 접시에 물고기마다 2~3시간 위에 낮은 용해 아가로 오스의 레이어를 놓습니다. 이것은 밖으로 건조하고 그것을 몇 군데되는 동안 물고기를 분쇄에서 아가로 오스를 방지합니다. 물고기의 수가 적은 긴 시간 코스의 경우 감염 기간 동안 28 ° C를 유지하기 위해 (Bioptechs 주식 회사) 가열 스테이지를 사용합니다.
실험 기간 : ** (30 분)
어려움의 정도 : **
5. 프로토콜을 정돈하기 위해 관련 수정
Microinjection위한 Micropipettes
실험 기간 : * (10-15분)
어려움의 정도 : *
배아 수집, Morpholino 주입 및 유지 관리
실험 기간 : *** (1-2시간)
어려움의 정도 : ***
이미징
실험 기간 : ***** (1-5 시간)
어려움의 정도 : ***
6. 대표 결과
성공 hindbrain 뇌실 C의 예 5시간 후 감염 (hpi) 24 hpi에 zebrafish 애벌레의 albicans 감염 (그림 1)에 표시됩니다. 빨아들이는 C.있는 대식 세포와 같은 세포 albicans은 5 hpi에서 hindbrain의 뇌실에서 볼 수 있습니다. 24 점차로 hpi, C. albicans는 대식 세포와 같은 세포 내부전파 칸디다 증을 나타내는 지느러미 꼬리 조직에의. 이 감염 결과는 10-15 효모 형태 C의 정확한 주입시 크게 의존 hindbrain에 꽂혔어 albicans. 감염된 생선을 즉시 사후 주입의 상영이 보장 수 있습니다.
그림 1 트렌스 제닉 fli1 :. EGFP 22 CAF2-yCherry 칸디다 albicans와 공촛점 현미경으로 intravitally 군데에 감염된 33 유충. (AC) 5시간 후 감염 감염의 사이트 (hindbrain 뇌실) 규모 막대 = 100 μm의에서 대식 세포와 같은 세포를 EGFP-표현으로 (A) 감염된 유충. 같은 생선 (B와 C) 높은 배율 이미지, C를 보여주는 phagocytes 이내 albicans. 스케일 바 = B 100 μm의와 C (DF) CAF2-yCherry C.있는 전파 칸디다 증과 24시간 후의 감염 (D) 감염된 유충 10 μm의 EGFP 맥 내부 albicans지느러미 꼬리 조직의 rophage 같은 세포. 스케일 막대 = 100 μm의. 같은 생선 (E와 F) 높은 배율 이미지, C를 보여주는 꼬리 조직의 albicans. 스케일 막대 = 100 μm의.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
여기서 제시 zebrafish microinjection 방법은 Gutzman 외 다릅니다. 34 저 여기에 우리가 36-48 hpf의 애벌레의 hindbrain의 뇌실에 귀의 소포를 통해 주사를 보여줍니다. 우리가 설명하는 방법은 감소 조직 손상과 hindbrain의 꽂혔어 10-15 효모의 일관된 주입을 허용합니다. 이 프로토콜은 24 hpi (그림 1)과 상당한 주죠 / 병적 5의 결과에 의해 신체 전반에 걸쳐 펼쳐지는 초기에 현지 감염을 생산하고 있습니다. hindbrain의 심실이 완전히 48 hpf 27, 29까지 봉쇄되지 않습니다. 개발 macrophages와 neutrophils의 초기 단계 동안 감염의 사이트 phagocytose C.로 마이 그 레이션 albicans와 신체 5 다른 부분으로 이동할 수 있습니다.
이 시스템의 진정한 능력은 형광 단백질 표현 세균 zebrafish의 트렌스 제닉을 결합하는 능력에서 비롯됩니다. 우리는 ko를 가지고C의 gineered 야생 - 타입과 돌연변이 얼룩 albicans가 constitutively mCherry, dTomato 및 eqFP650을 표현합니다. 산화 스트레스 반응이 발기인으로 이러한 표현 구조를 결합하면 라이브 zebrafish 애벌레 다섯 내에서 산화 스트레스 ratiometric 부량 허용합니다. 돌연변이 곰팡이 또는 물고기 morphant의 맥락에서 형광 곰팡이와 형광 타고난 면역 세포의 생체내 이미징의 듀얼도 robustly 같은 감염의 사이트에 마이 그 레이션, 병원체의 phagocytosis, 곰팡이 발아 방지 등의 변경 면역 반응을 계량하는 데 사용할 수 있습니다 , 5 죽이고.
이 프로토콜의 초보 사용자에게 문제가있을 수 있습니다 여러 기술 관련 문제가 있습니다. 첫째, 그것은 바늘이 적절하게 잘린되고 사출 압력이 제대로 설정되어 있는지 중요 그게 그렇게 C. 5 NL albicans 서스펜션은 microinjected됩니다. 이것은 bolus이에서 나오는 것을 확인할 수 있도록하려면섹션 3.8에서 설명한대로 바늘은 꼼꼼한 25 zebrafish의 유충의 동공의 크기입니다. 그것은 zebrafish 애벌레가 hindbrain의 뇌실에있는 10-15 효모있다는 것을 확인하기 위해 epifluorescence에 의해 즉시 검사 후 감염으로 확인하실 수 있습니다 injectant 같은 금액을받는 것이 중요합니다. 주입 물고기도 균질와 초기 식민지 검증 유닛에게 5 형성을위한 도금 수 있습니다. 이것은 유충의 조기 사망의 원인으로 두 번째로, 그것은 hindbrain의 뇌실에서 혈관을 펑쳐링 피하는 것이 중요합니다. 그것은 hindbrain의 뇌실로 직접 microinjection을 보장, 대략 45도 각도로 귀의 소포로 주입하는 것이 중요합니다. 셋째, 추가적인 치료 병원체 감염의 독립적 감염 사이트에 증가 염증이 발생할 수 귀의 소포 조직을 찢어하거나 손상하지 않기를. 애벌레는 아가로 오스 injecti에 위치하고 나면 넷째, 주사는 신속하게 수행되어야합니다접시에. 애벌레는 접시에 너무 오래 밖으로 건조합니다 왼쪽이가 발생하는 경우 PBS-주입 물고기의 사망률있을 것입니다. 15 분 내에 감염을 완료하고 물고기를 감염하는 것은 모두이 문제를 개량하다하는 데 도움을 줄 수있는 동안 접시에 물을 잔여 금액을 떠난다. 그러나, 접시에 너무 많은 물을 떠난 것은 애벌레를 떠도는와 주사를 더 어렵게 만들 수 있습니다. 구형 (4 dpf) 더 복잡하지만, 공기에 애벌레를 노출 방지 생선을 설명 주입의 다른 방법은 Cosentino 및 동료 28에 의해 제공됩니다.
zebrafish 애벌레는 박테리아 곰팡이 및 바이러스 병원체 5, 26, 35-46로 타고난 면역 반응을 모델링하는 데 사용되고 최신 상태로 있습니다. 이러한 획기적인 연구는 두 호스트 및 병원체에 새로운 세포와 분자 메커니즘을 발견하는이 모델은 시스템의 유틸리티를 설립했습니다. 이 설명한 프로토콜과 함께 찍은이 다른 출판 작품은 다른 laborato을위한 기초를 제공그대로 호스트의 컨텍스트에서 호스트 에게선 상호 작용을 조사하기 위해 RIES.
이러한 실험에 유용 있지만, fli1 : EGFP 유전자 변형 라인은 여기서 설명하는 것은 그것의 제한이 없습니다. fli1 유전자는 대식 세포와 같은 세포를 22 이외에 내피 vasculature에 표시됩니다. 종종 vasculature의 EGFP의 형광은 하드 C를 감지 할 수 대식 세포와 같은 세포의 albicans. 또한, 대식 세포와 같은 세포에서 EGFP 발현이 어렵게 감지하고 18-24시간 포스트 감염 주위 감소된다. 최근에 출판된 대식 세포에 특정한 유전자 변형 zebrafish 라인은 대식 세포 연구 23 모델과 같은 많은 장점을 가지고 있습니다.
설명 감염 기법은 zebrafish에서 사용할 수있는 강력한 유전자와 형광 현미경 도구의 수를 앙트레를 제공합니다. 그것은 적절한 유전자 변형 생선과 공학 C.와 함께 조합하여 사용할 수 있습니다 albicans C를 포함하는 neutrophils과 macrophages의 수를 포함하여 호스트 병원체 상호 작용의 여러 측면 부량을 설정하는 방법 albicans, C.의 빈도 소화 albicans와 C.의 분단 타고난 면역 세포 5 이내 albicans. 하나도 감염 5에서 각각 타고난 면역 유전자의 역할을 테스트하기 morpholino 안티 센스 oligonucleotides를 이용하여이 프로토콜을 조합하여 사용할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
Acknowledgments
저자는 장비의 배아 개발 및 사용 속도에 조언을 microinjection 교육, 고모 헨리 박사 캐롤 김 연구실 감사드립니다, 그리고 fli1 기여에 대한 나단 로손과 같습니다 EGFP 생선. 우리는 원고의 비판적 읽기를 위해 윌러 연구소와 션의 성벽의 회원 감사드립니다. 우리는 또한이 프로젝트에 대한 기술적 조언 생선 관심과 조언을 마크 Nilan, 그리고 라이언 Phennicie와 크리스틴 가보 감사드립니다. 이 작품은 K. 형제, MAFES 해치 기금 E08913-08, 그리고 R. 휠러에 대한 NIH NCRR 보너스 P20RR016463에 MAFES 연구 assistantship에 의해 재정 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spawning tanks | Aquatic habitats | 2L | |
| 1.7 mL tubes | Axygen | MCT-175-C | |
| Instant Ocean | Fisher Scientific | S17957C | |
| Extra deep Petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-11Z | |
| Standard Petri dishes | VWR Scientific | 25384-302 | |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| Yeast Extract | VWR Scientific | 90000-726 | |
| Peptone | VWR Scientific | 90000-264 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Agar | VWR Scientific | 90000-760 | |
| Disposable Hemocytometer | VWR Scientific | 82030-468 | |
| Phosphate Buffered Saline | VWR Scientific | 12001-986 | |
| Dumont Dumoxel Tweezers | VWR Scientific | 100501-806 | |
| Wooden Dowels | VWR Scientific | 10805-018 | |
| KimWipes | VWR Scientific | 300053-964 | |
| Low Melt Agarose | VWR Scientific | 12001-722 | |
| Agarose for injection dishes | VWR Scientific | 12002-102 | |
| Flaming Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Hollow glass rods | Sutter Instruments | BF120-69-10 | For glass rods smooth glass by heating over bunsen burner |
| Pipette Storage Box | Sutter Instruments | BX10 | |
| MPPI-3 Injection system | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
| Back Pressure Unit | Applied Scientific Instrumentation | BPU | |
| Micropipette Holder kit | Applied Scientific Instrumentation | MPIP | |
| Foot Switch | Applied Scientific Instrumentation | FSW | |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | |
| Magnetic Base | Applied Scientific Instrumentation | Magnetic Base | |
| Tricaine methane sulfonate | Western Chemical Inc. | MS-222 | |
| Dissecting Scope | Olympus | SZ61 top SZX-ILLB2-100 base | |
| Confocal Microscope | Olympus | IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system | |
| TC-7 Tissue Culture Roller drum with 14 inch test tube wheel | New Brunswick Scientific | TC-7 | |
| Imaging Dishes | MatTek Corporation | P24G-1.0-10-F | |
| Pipette tips for loading needles | Eppendorf | 930001007 | |
| Plate pouring grids | Adaptive Science Tools | TU-1 | |
| Heated Stage | Bioptechs Inc. | Delta T-5 | |
| Flat Spatula | VWR Scientific | 82027-486 | |
| Plastic Sieves | Wares of Knutsford Online | 12 cm | |
| Parafilm | VWR Scientific | 52858-000 | |
| Vortex Genie | VWR Scientific | 14216-184 | |
| 16 x 150 mm Culture tubes | VWR Scientific | 60825-435 | |
| Nanodrop | Thermo Scientific | ND 2000 | |
| Phenol Red | VWR Scientific | 97062-478 | |
| HCl | VWR Scientific | 87003-216 | |
| NaCl | VWR Scientific | BDH4534-500GP | |
| KCl | VWR Scientific | BDH4532-500GP | |
| MgSO4 | VWR Scientific | BDH0246-500GP | |
| Ca(NO3)2 | VWR Scientific | BDH0226-500GP | |
| HEPES | VWR Scientific | BDH4520-500GP | |
| Morpholinos | GeneTools, LLC |
References
- Trede, N. S., Langenau, D. M., Traver, D., Look, A. T., Zon, L. I. The use of zebrafish to understand immunity. Immunity. 20, 367-379 (2004).
- Kanther, M., Rawls, J. F. Host-microbe interactions in the developing zebrafish. Curr. Opin. Immunol. 22, 10-19 (2010).
- Meeker, N. D., Trede, N. S. Immunology and zebrafish: spawning new models of human disease. Dev Comp Immunol. 32, 745-757 (2008).
- Tobin, D., May, R. C., Wheeler, R. T. Zebrafish: a see-through host and fluorescent toolbox to probe host-pathogen interaction. PLoS Pathog. , (2011).
- Brothers, K. M., Newman, Z. R., Wheeler, R. T. Live imaging of disseminated candidiasis in zebrafish reveals role of phagocyte oxidase in limiting filamentous growth. Eukaryot. Cell. 10, 932-944 (2011).
- Pfaller, M. A., Diekema, D. J. Epidemiology of invasive candidiasis: a persistent public health problem. Clin. Microbiol. Rev. 20, 133-163 (2007).
- Ashman, R. B. Innate versus adaptive immunity in Candida albicans infection. Immunol. Cell Biol. 82, 196-204 (2004).
- de Repentigny, L. Animal models in the analysis of Candida host-pathogen interactions. Curr. Opin. Microbiol. 7, 324-329 (2004).
- Rogers, T. J., Balish, E. Immunity to Candida albicans. Microbiol. Rev. 44, 660-682 (1980).
- Calderone, R., Sturtevant, J. Macrophage interactions with Candida. Immunol. Ser. 60, 505-515 (1994).
- Frohner, I. E., Bourgeois, C., Yatsyk, K., Majer, O., Kuchler, K. Candida albicans cell surface superoxide dismutases degrade host-derived reactive oxygen species to escape innate immune surveillance. Mol. Microbiol. 71, 240-252 (2009).
- Kumamoto, C. A., Vinces, M. D. Contributions of hyphae and hypha-co-regulated genes to Candida albicans virulence. Cell Microbiol. 7, 1546-1554 (2005).
- Lorenz, M. C., Bender, J. A., Fink, G. R. Transcriptional response of Candida albicans upon internalization by macrophages. Eukaryot. Cell. 3, 1076-1087 (2004).
- Rubin-Bejerano, I., Fraser, I., Grisafi, P., Fink, G. R. Phagocytosis by neutrophils induces an amino acid deprivation response in Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 11007-11012 (2003).
- Behnsen, J. Environmental dimensionality controls the interaction of phagocytes with the pathogenic fungi Aspergillus fumigatus and Candida albicans. PLoS Pathog. 3, e13 (2007).
- Lavigne, L. M. Integrin engagement mediates the human polymorphonuclear leukocyte response to a fungal pathogen-associated molecular pattern. J. Immunol. 178, 7276-7282 (2007).
- Newman, S. L., Bhugra, B., Holly, A., Morris, R. E. Enhanced killing of Candida albicans by human macrophages adherent to type 1 collagen matrices via induction of phagolysosomal fusion. Infect. Immun. 73, 770-777 (2005).
- Netea, M. G., Brown, G. D., Kullberg, B. J., Gow, N. A. An integrated model of the recognition of Candida albicans by the innate immune system. Nat. Rev. Microbiol. 6, 67-78 (2008).
- Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Dev. Comp. Immunol. 28, 9-28 (2004).
- Magnadottir, B. Innate immunity of fish (overview). Fish Shellfish Immunol. 20, 137-151 (2006).
- Sullivan, C., Kim, C. H. Zebrafish as a model for infectious disease and immune function. Fish Shellfish Immunol. 25, 341-350 (2008).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev. Biol. 248, 307-318 (2002).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117, e49-e56 (2011).
- Renshaw, S. A. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108, 3976-3978 (2006).
- Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Curr Opin. Microbiol. 11, 277-283 (2008).
- Chao, C. C. Zebrafish as a model host for Candida albicans infection. Infect. Immun. 78, 2512-2521 (2010).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. , 203-253 (1995).
- Cianciolo Cosentino, C., Roman, B. L., Drummond, I. A., Hukriede, N. A. Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury. J. Vis. Exp. (42), e2079 (2010).
- Haddon, C., Lewis, J. Early ear development in the embryo of the zebrafish, Danio rerio. J. Comp. Neurol. 365, 113-128 (1996).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
- Ariga, J., Walker, S. L., Mumm, J. S. Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation. J. Vis. Exp. (43), e2093 (2010).
- Redd, M. J., Kelly, G., Dunn, G., Way, M., Martin, P. Imaging macrophage chemotaxis in vivo: studies of microtubule function in zebrafish wound inflammation. Cell Motil. Cytoskeleton. 63, 415-422 (2006).
- Gutzman, J. H., Sive, H. Zebrafish Brain Ventricle Injection. J. Vis. Exp. (26), e1218 (2009).
- Davis, J. M. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17, 693-702 (2002).
- Meijer, A. H. Identification and real-time imaging of a myc-expressing neutrophil population involved in inflammation and mycobacterial granuloma formation in zebrafish. Dev. Comp. Immunol. 32, 36-49 (2008).
- Mathias, J. R. Live imaging of chronic inflammation caused by mutation of zebrafish Hai1. J. Cell Sci. 120, 3372-3383 (2007).
- Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Dev. Biol. 7, 42 (2007).
- Vergunst, A. C., Meijer, A. H., Renshaw, S. A., O'Callaghan, D. Burkholderia cenocepacia creates an intramacrophage replication niche in zebrafish embryos, followed by bacterial dissemination and establishment of systemic infection. Infect Immun. 78, 1495-1508 (2010).
- Le Guyader, D. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish. Blood. 111, 132-141 (2008).
- Clatworthy, A. E. Pseudomonas aeruginosa infection of zebrafish involves both host and pathogen determinants. Infect. Immun. 77, 1293-1303 (2009).
- Brannon, M. K. Pseudomonas aeruginosa Type III secretion system interacts with phagocytes to modulate systemic infection of zebrafish embryos. Cell Microbiol. 11, 755-768 (2009).
- Levraud, J. P. Real-time observation of listeria monocytogenes-phagocyte interactions in living zebrafish larvae. Infect. Immun. 77, 3651-3660 (2009).
- van der Sar, A. M. Zebrafish embryos as a model host for the real time analysis of Salmonella typhimurium infections. Cell Microbiol. 5, 601-611 (2003).
- Phennicie, R. T., Sullivan, M. J., Singer, J. T., Yoder, J. A., Kim, C. H. Specific resistance to Pseudomonas aeruginosa infection in zebrafish is mediated by the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Infect Immun. 78, 4542-4550 (2010).
- Prajsnar, T. K., Cunliffe, V. T., Foster, S. J., Renshaw, S. A. A novel vertebrate model of Staphylococcus aureus infection reveals phagocyte-dependent resistance of zebrafish to non-host specialized pathogens. Cell Microbiol. 10, 2312-2325 (2008).
