Summary
Zebra balığı hızla gelişmesi, küçük boyutu ve şeffaflık enfeksiyon doğal immün kontrolü çalışması için çok büyük avantajları vardır
Abstract
Patojen Candida albicans neden olduğu yaygın kandidiyazis yatan bireylerde klinik olarak önemli bir sorundur ve bir% 30-40 ölüm atfedilebilen 6 ile ilişkilidir. Sistemik kandidiyazis normalde doğal bağışıklığın tarafından denetlenir ve bu tür fagosit NADPH oksidaz gibi doğuştan gelen bağışıklık hücre bileşenleri genetik bozuklukların bireylerin kandidemi 7-9 daha duyarlıdırlar edilir. Çok az C. dinamikleri hakkında bilinmektedir in vivo olarak doğuştan gelen bağışıklık hücreleri ile albicans etkileşim. in vitro çalışmalar Kapsamlı kurduk ana C. dışında albicans, makrofajlar içinde filizlenir ve hızlı bir şekilde nötrofil 10-14 tarafından yok edilir. In vitro çalışmalar, faydalı olsa da, sitokin düzeyleri, hücre dışı matriks ekleri ve hücreler arası iletişim 10 zamana bağlı dinamiklerini içeren in vivo ortamda, karmaşık özetlemek olamaz 15-18
Zebra balığı larva enfeksiyon çalışma için benzersiz ve çok yönlü bir omurgalı sunar. Gelişim zebrabalıkları larvaların ilk 30 gün için sadece doğuştan gelen bağışıklık sistemi 2, 19-21 gibi doğal bağışıklığın çok bağımlı dissemine kandidiyazis gibi hastalıkların çalışma basitleştirilmesi, var. Zebra balığı larva küçük boyutu ve şeffaflığı hem de ev sahibi ve patojen için hücresel düzeyde enfeksiyon dinamiklerinin görüntüleme sağlar. Doğuştan gelen bağışıklık hücreleri floresanlama ile Transgenik larvalarının enfeksiyon 22-24 dahil belirli hücrelere türlerini tanımlamak için kullanılır. Modifiye anti-sense oligonükleotidler (Morpholinos) gibi fagosit NADPH oksidaz gibi çeşitli bağışıklık bileşenleri yıkmak ve funga yanıt değişiklikleri incelemek için kullanılabilirl enfeksiyonu 5. Küçük bir düşük omurgalı kullanılarak etik ve pratik bir avantaj ek olarak, resim her iki zebrafish larvaları intravitally ve renk açısından patojen ve ev sahibi arasındaki eğimli mücadele etmek eşsiz olasılığını sunar.
Zebra balığı, insan patojen bakterilerin bir dizi model enfeksiyon için kullanılır olmuştur ve mikobakteriyel enfeksiyonu 3, 25 anlayışımızda önemli gelişmeler etkili olmuştur. Bununla birlikte, sadece son larvası 5 gibi enfekte etmekte kullanıldığında edilmiş mantarlar, 23, 26 gibi daha büyük patojenler sahiptir ve enfeksiyona yöntem ayrıntılı bir açıklaması görsel olmamıştır güncel. Burada daha önceki protokollere bizim değişiklikler dahil olmak üzere prim 25 zebrabalıkları ve arka beyin ventrikül mikroenjeksiyon için, teknikler sunuyoruz. Mantar enfeksiyonu için larva zebrabalıkları modeli kullanarak Bulgularımız in vitro çalışmalar uzaklaşacak ve konak-patojen Intera incelemek gerekli kılmaktadıryerine Petri tabağı 5 basitleştirilmiş sistem daha konağın kompleksi ortamda ction.
Protocol
Tüm zebrabalıkları bakım protokolleri ve deneyler Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) protokolü A2009-11-01 altında yapıldı.
1. Morfolino ve Larva Enjeksiyon Yemekleri
Deney süresi: * (10-15 dakika)
Zorluk derecesi: *
- Yumurta enjeksiyonlar için steril su ve mikrodalga% 2 agaroz solüsyon hazırlanır. Bunun yarısını kadar çözüm ekstra bir derin Petri (Fisher Scientific) içine bazı dökün soğuduğunda. Buz ve plaka düzeyde olduğundan emin olun serin.
- Çanak soğuduktan sonra,% 2'lik agaroz bir 15 mL üst tabaka dökülür. Bir sprey şişesinden steril su ile plastik kalıp (Adaptif Bilim Araçları) yivli bir yumurta enjeksiyon püskürtün. Sıcak agaroz içine kalıp oluk tarafı dikkatlice aşağı yerleştirin. Agaroz soğuduğunda, aga gelen kalıp ayırmak için (VWR Bilimsel) bir metal düz spatula kullanınyükseldi. Yavaşça agaroz gelen ızgara çıkarın. Wrap embriyo enjeksiyon parafilm yılında yemekleri (VWR Bilimsel) ve mağaza 4 ° C de ters
- Balık larva enjeksiyonlar için, olarak tarif% 2 agaroz solüsyon hazırlanır. Standart bir boyut Petri (VWR Bilimsel) içine çözüm dökün ve katılaşır kadar kenara koyun. Parafilm ve mağaza içine al larva enjeksiyon yemekleri 4 ° C de ters
2. Mantar Kültür Hazırlık
Deney süresi: ** (30 dakika)
Zorluk derecesi: **
- 10 g / L maya ekstraktı, 20 g / L pepton, 20 g / L dekstroz ve ve otoklav içine 20 g / L agar: özü-pepton-dekstroz (YPD) agar maya hazırlayın. YPD sıvı 121 10 g / L maya ekstraktı, 20 g / L pepton, 20 g / L dekstroz ve otoklav 20-30 dakika ° C hazırlamak için
- Balık enfeksiyonları önce iki gün donmuş bir Sürme hazırlamakYPD agara Candida albicans kültürlerin stokları tek koloniler elde etmek.
- 37 ° C'da gece boyunca inkübe edilir.
- 16 x 150 mm kültür tüpleri (VWR Bilimsel) içine 5 ml YPD suyu koyun.
- Balık enfeksiyonları önceki gün bir ahşap takoz (VWR Scientific) ile YPD agar 1 küçük koloni seçin. YPD sıvı içerisinde tekrar askıya koloni etrafında kültür tüp ve girdabında sopa koyun.
- Bir 14 inç test tüpüne tekerlek (New Brunswick Scientific) ile donatılmış bir TC-7 Doku Kültürü bandajlar 37 ° C'de gece boyunca büyür.
- Ertesi gün, bir 1.7 ml tüp (Axygen) 1 dakika 14000x g de kültür 1 mL aşağı doğru döndürün. Süpernatantı ve vorteks (VWR Bilimsel) tarafından rezidüel sıvı pelletini.
- Salin (VWR Bilimsel) Buffered 1 ml 1x Fosfat ekleyin ve daha önce açıklandığı gibi dönerler.
- PBS yıkama 3 kez tekrarlayın.
- 1x PBS içinde 1:100 (990 uL 1x P içine yıkanmış C. albicans 10 uL sulandırınızBS).
- Bir hemositometre (VWR Bilimsel) güvenin.
- 10 7 hücre / ml ye tamamlanır.
3. Zebra balığı Enfeksiyonlar
Deney süresi: **** (1-3 saat)
Zorluk derecesi: ****
- Bölüm 5 ve yumurta-su deposu, steril deiyonize su içinde 60 mg / L anında okyanus tuzları (Fisher Scientific) göre embriyolar toplayın.
- Böyle Olympus SZ61 (Olympus), enfeksiyon günü dechorionate embriyolar gibi bir mikroskop kullanma. Cips bir çanta açarak, ya da hafifçe koryon içine kapalı konumda cımbız karıştırmak ve daha sonra yavaş yavaş onları açık gibi koryon 27 ayrı parçalara çektiğimi Dumont Dumoxel cımbız (VWR Bilimsel) kullanın. Balık koryon dışarı doğru pop gerekir.
- Kapak çanak ortasına balık taşımak için üzerine olan girdap ekstra derin Petri. Çanağı kapağı balık aktarın. Yumurta-su çıkarın vetaze ortam ile değiştirin. Medya balıkları ekleyin.
- 28 yaşında bir kuluçka sıcak larva enjeksiyon yemekleri ° C Tricaine metan sülfonat (Batı Kimya A.Ş.) 200 mg / balık anestezi için mL seyreltme hazırlayın.
- Enfeksiyonu (20-50 balık) için larva istenilen sayısını sayın. Tricaine sülfonat çözüm balık koyun ve hareketli durdurana kadar 1-2 dakika bekleyin.
- MPPI-3 enjeksiyon ünitesi (Uygulamalı Bilimsel Cihazlar) açın. Basınç anahtarı "darbe" üzerine ve "darbe süresi" backpressure birim için 3 PSI ile 9 ayarlanmış olduğundan emin olun. Enjeksiyon ünitesi üzerindeki basıncı 30 PSI okuyana dek azot tankına valfini açın.
- 1x10 7 hücre / mL 'lik bir konsantrasyonda santrifüja Candida albicans 5 uL sahip bir çekilmiş mikropipet 28 yerleştirin. Mikropipet tutucu (Uygulamalı Bilimsel Cihazlar) içinde mikropipet yerleştirin. Su ile boş bir ekstra derin Petri doldurun. Ucu kadar mikropipet taşıyın igörünüm içinde sadece çekti pipet ucundan 3mm hakkında iğne takılması için mikroskop ve kullanımı Dumont Dumoxel cımbız (VWR Bilimsel) diseksiyon ile su yüzeyine dokunmadan.
- Iğne kırpılmış oldu doğrulamak için ayak anahtarı (Uygulamalı Bilimsel Cihazlar) basın. Eğer başarılı olsaydı sıvı dağıtmak görmelisiniz. Sıvı bolus çapı prim 25 zebrafish larva pupil (0.21 mm, 4.9 hacim NL bir küre ye kadar) çapından daha büyük olmalıdır. Sıvı bolus çok büyük veya çok küçük buna göre eğer basıncını ayarlayın.
- Tricaine metan sülfonat da balık (200 ug / mL) uyuşturmak. Bir kez balık hareketli, girdap balık merkezinde kadar kapağı ile çanak durduruldu. Bir transfer pipeti (Fisher Scientific) kullanılarak 50 balık toplayın. Ucu doğru balık yerleşmek için pipet yan dokunun. Yavaşça mümkün olduğu kadar az bir sıvı olarak kullanarak larva agaroz tabağa balık Pipeti.
- Düzgün bir cam çubuk (onları ezmek için dikkatli olun!) Ile Hat balık. Çanağı mümkün kapalı olduğu kadar sıvı aspire. Herhangi nemi fitil için bir KimWipe kullanın.
- Aynı zamanda balık ve iğne iyi bir görünüm elde edene kadar mikroskop altında balık larva agaroz çanak yerleştirin. Balık doğru cam iğne taşıyın. Eğer balık doğru iğne konumlandırmak olarak balık ve iğne hem Yakınlaştır. Dikkatle ilk balık kulak vezikül 27, 29 (kulak) içine cam iğne taşıyın. Eğer balığa iğne taşıdığınız bir kez ayak anahtarı (Uygulamalı Bilimsel Cihazlar) bastığınızda, arka beyin ventrikül hafifçe yukarı kaldırın çünkü bileceksiniz.
- Ayak pedalı (Uygulamalı Bilimsel Aletler) basın ve sıvı balığın arka beyin ventrikül 27 içinde dispers izleyebilirsiniz. Balık ve hareket sonraki balığa iğne geri çekin. Eğer plaka üzerinde balık her enjekte kadar işlemi tekrarlayın. Herhangi bir d çıkarınEAD balık ve (50 balık) numarasının doğru tutmak yerine enjekte edin. 50 balık her bir grup için yeni bir mikroenjeksiyon iğne hazırlanması gerekmektedir enjekte veya C. albicans iğne alt yerleşir ve takunya, ya da enjekte konsantrasyonu atar.
- Çanak olta balıkçılığı ve 60 mL yumurta-su içeren temiz bir ekstra derin Petri kabına balık üzerine yumurta-su püskürterek yemeğin balık yıkayın. Bu daha uzun 15-20 dakika agaroz üzerinde balık bırakmamaya önemlidir ya da dışarı kurur ve ölür.
- Bitirene kadar tüm enjeksiyon işlemi tekrarlayın. PBS ve patojen olmayan enjekte kontrolleri ihmal etmeyin.
- Bittiğinde, 28 balık tutmak ° C
- Azot tankı vanasını kapatın. Tank hattı basıncı rahatlatmak için "sürekli" için "darbe" den enjeksiyon ünitesi anahtarı taşımak, basınç bu noktada sıfıra düşmesi gerekir. "Darbe" geri enjeksiyon ünitesi açın. Enjeksiyon ünitesi kapatın ve çalışma alanı temizlemek. 4. Görüntüleme için Balık hazırlanması
- (200 ug / mL) daha önce olduğu gibi tricaine metan sülfonat çözeltisi hazırlayın. Enfekte balıkların dışarı alın ve tricaine içine aktarabilirsiniz.
- Yumurta-su 47.9 mL% 0.4 düşük erime agaroz (VWR bilimsel) hazırlayın. Microwaving tarafından çözüm ısıtın. 37 ° C ve serin bir karışımına ilave tricaine metan sülfonat (200 ug / mL)
- Bir kez balık tricaine metan sülfonat,% 0.4 düşük erime agaroz (VWR Bilimsel) içeren Petri (VWR bilimsel) pipetlenir bireysel balık immobilize edilir.
- Sonra, görüntüleme için bir cam alt çanak (MatTek Corp Corporation) bireysel kuyulara düşük erime agaroz gelen balık taşıyın. Balık tabağın tabanına düz yatıyor yüzden mümkün olduğunca az düşük erime agaroz olarak kullanın. Sadece doldurmak için yeterli tricaine-agaroz kullanımıCam alt çanağı ner çevreler.
- Yuan ve ark göre Flaming Brown Mikropipet Çektirme Model P-97 (Sutter Araçlar). 30 ile içi boş cam çubuklar BF120-69-10 (Sutter Instruments) çekin. Aşağıdaki koşullar Isı = 470, Hız = 120, Zaman = 200 ile program # 7 seçin. Çıkan iğne kez yaklaşık 10 mikron çapındaki ucu yukarıda 3 mm'den az kırpılır 8 konik uca mm vardır.
- Parantez içine bir cam mikropipet yükleyin. "Çekin." I seçin Isıtma filament programı parametreleri ve cam çubuk iki çekilir mikropipetler içine ayıracaktır göre iğne ısıtır. Bir pipet saklama kutusu (Sutt Mağaza mikropipetlerer araçlar).
- Rosen ve diğ. 31 yöntemlere göre embriyosu Collect. Yumurtlama tankı (Sucul Habitatlar) yumurta toplamak için bir plastik elek (Knutsford Gereçleri) kullanın. Ekstra derin petri üzerinde baş aşağı tutun elek ve yumurta toplamak için tankı su ile durulayın.
- Morfolino hazırlanması için, morfolino 300 nanomol (GeneTools, LLC) 300 uL steril su ekleyin. Bu 1.0 mM çalışan bir stok verir.
- Bir Nanodrop (Thermo Scientific) kullanılarak morfolino konsantrasyonu doğrulayın. "Nükleik asit ve numune tipi değiştirme" 265 seçmek üzere diğer "ve dalgaboyu. Absorptivit bölünmesiyle 1000 tarafından morfolino moleküler ağırlığı çarparak sabiti Girişy katsayısı morfolino oligo özellik sayfasında listelenmiştir.
- 2 ul 0.1 N HCI ile boş nanodrop. 0.1 N HCI (20x seyreltme) 95 uL içine morfolino çözeltinin 5 uL seyreltilir. Nanodrop kaide ve tıklama önlem seyreltme 2 uL yerleştirin. Seyreltme faktörü (20) tarafından konsantrasyonu çarpma. Bu, morfolino çalışan bir konsantrasyonda verir. Milimolar konsantrasyonu hesaplamak için morfolino moleküler ağırlığı ile elde edilen konsantrasyon böler.
- Danieau tampon içinde morfolino (58 mM NaCI, 0.7 mM KCI, 0.4 mM MgSO 4, 0,6 mM Ca (NO 3) 2, 5.0 mM HEPES, pH 7.6) ve% 0.01 fenol kırmızısı (VWR Scientific) çalışan bir stok hazırlayın.
- Morfolino püskürtme çalışması için Rosen ve diğ. 31 ve Yuan ve ark. 30 göre protokolü takip. 15 dakika 28 ° C'de yumurta-su ve sıcak ile morfolino enjeksiyon yemekleri durulayın. Enjeksiyon yemekleri ve line-up tek-c su kaldırmaell aşamada bir transfer pipetle enjeksiyon çanak (Bölüm 1 hazırlanan) ve oyuklara embriyoların. Her plaka yaklaşık 250 yumurta yapacak. Morfolino ile 1-2 hücreli embriyo aşamasında enjekte edilir. Yumurta 15 dakika için 27 aşamasında bir hücre içinde kalır.
- Ekstra derin Petri 60 ml yumurta-su enjekte bitmiş yumurta suyu ile yumurta (60 mg / L Instant Ocean tuzları ile steril deiyonize su) ve yeri yıkayın. Morfolino enjeksiyon yemekler yeniden kullanılabilir. Bittiğinde yumurta su ile durulayın ve 4 ° C de ters mağazası
- Depolama için embriyoların çanak için 60 ml yumurta-su ekleyin. 60 ml yumurta su ile ayrı ekstra derin Petri içine bir transfer pipetle 110 embriyolar sayıyoruz. 28 mikrobiyal büyüme ve inkübe embriyo önlemek için mavi 0.00003% metilen ekle ° C
- Embriyo gelişimi hızlandırmak için embriyolar kafa geliştirmesine izin Kimmel ve ark. 27'ye göre 24 saat ve sahne için 33 ° C'de embriyo yemekleri tutmak75 gövde açısı ° (Prim 25 aşama 27).
- Larva enfeksiyonu iş için C ile enjekte sonra 28 ° C'de embriyo tutma albicans.
- Her gün 60 ml taze yumurta suyu ile embriyo yemekleri değiştirin.
- Daha önce anlatıldığı gibi cam alt görüntüleme yemekleri (MatTek Corp Corporation) olarak tricaine düşük erime agaroz (bölüm 4.2 'ye göre) balık hazırlayın. Olympus IX-81 (Olympus) inverted mikroskop sahnede tabak yerleştirin. Diferansiyel girişim kontrast (DIC) ışık altında 4x büyütme altında odak haline balık getir. Görüntüler 4x, 20x yakalandı ve DIC, TRITC (tetrametil rodamin izotiyosiyanat) ve FITC (fluorescein izotiyosiyanat) filtre ayarları 40x büyütme. Edilebilir
- Bir FV-1 ile bir Olympus IX-81 inverted mikroskop kullanın000 lazer Ariga ark göre konfokal tarama sistemi. 32. 1-1.5 mikron dilim enfeksiyon saatte Z-yığınlarının ayarlayarak 40x büyütmede zamanlı kurslar düzenlemek.
- 2 saat veya daha uzun süre ders görüntüleme için, görüntüleme çanak balık her 2-3 saatte üst üste düşük erime agaroz bir katman yer. Bu kuruma ve görüntülü edilirken balık ezme gelen agaroz önler. Balık küçük bir sayı ile uzun süre dersler için, enfeksiyonlar sırasında 28 ° C korumak için (Bioptechs A.Ş.) ateşli bir sahne kullanın.
Deney süresi: ** (30 dakika)
Zorluk derecesi: **
5.. Protokoller Vallahi İlgili Değişiklikler
Mikroenjeksiyon için mikropipetler
Deney süresi: * (10-15 dakika)
Zorluk derecesi: *
Embriyo Koleksiyonu, morfolino Enjeksiyon ve Bakım
Deney süresi: *** (1-2 saat)
Zorluk derecesi: ***
Görüntüleme
Deney süresi: ***** (1-5 saat)
Zorluk derecesi: ***
6. Temsilcisi Sonuçlar
Başarılı bir arka beyin ventrikül C. bir örneği 5 saat sonra enfeksiyon (hpi) ve 24 hpi bir zebrafish larva in albicans enfeksiyonu (Şekil 1) 'de gösterilmiştir. Yuttu C. ile makrofaj benzeri hücreler albicans 5 hpi azından arka beyin ventrikül görülür. 24 tarafından hpi, C. albicans makrofaj-benzeri hücre içindekidissemine kandidiyazis göstergesidir dorsal kuyruk dokusunda s. Bu enfeksiyon sonucu 10-15 maya-form C. doğru bir enjeksiyon üzerine oldukça bağımlıdır ardbeyin ventriküle albicans. Enfekte balıkların hemen post-enjeksiyon Eleme bunu sağlayabilir.
Şekil 1 Transgenik fli1:. EGFP 22, CaF2-yCherry Candida albicans ve konfokal mikroskopi ile intravitally yansıması ile enfekte 33 larva. (AC) 5 saat sonrası enfeksiyon enfeksiyon sitesi (arka beyin ventrikül) Ölçek çubuğu = 100 um az makrofaj benzeri hücreler EGFP-ifade ile (A) Enfekte larvanın. Aynı balık (B ve C) Yüksek büyütmeli görüntü, C. gösteren fagositler içinde albicans. Ölçek çubuğu = B için 100 mikron ve C. (DF) CaF2-yCherry C. ile dissemine kandidiyazis ile 24 saat sonrası enfeksiyon (D) Enfekte larvalar için 10 mikron EGFP mac içinde albicansdorsal kuyruk dokusunda rophage benzeri hücreler. Ölçek çubuğu = 100 mikron. Aynı balık (E ve F) Yüksek büyütmeli görüntü, C. gösteren kuyruk dokusunda albicans. Ölçek çubuğu = 100 mikron.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan zebrabalıkları mikroenjeksiyon yöntemi Gutzman ark farklıdır. 34 burada biz 36-48 hpf larvaların arka beyin ventrikül içine otik vezikül ile enjeksiyon göstermektedir. Bizim tarif ettiğimiz yöntem düşük doku hasarı ile arka beyin ventrikül içine 10-15 maya tutarlı enjeksiyon için izin verir. Bu protokol 24 hpi (Şekil 1) ve önemli öldürücülüğü / morbidite 5 sonuçları ile vücuda yayılır bir başlangıçta lokal enfeksiyon üretir. Ardbeyin ventrikül tamamen 48 hpf 27, 29 kadar kapatılmış değil. Geliştirme makrofaj ve nötrofillerin bu erken aşamada enfeksiyon sitesi, fagosite C. göç albicans, ve vücudun 5 diğer kısımlarını da hareket edebilirler.
Bu sistemin gerçek güç floresan proteini eksprese mikroplarla zebrabalıkları transgenik birleştirme yeteneğinden kaynaklanır. Biz tr varC. gineered vahşi tip ve mutant lekeler albicans yapısal olarak mCherry, dTomato ve eqFP650 ifade etmek. Oksidatif stres-duyarlı sahipleri ile bu ifade yapıları birleştiren canlı zebrabalıkları larva 5 içinde oksidatif stres oranlı metrik ölçümü verir. Mutant mantar veya balık morphant bağlamında floresan mantar ve floresan doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin in vivo görüntüleme Çift de sağlam gibi enfeksiyon sitesine göç, patojenin fagositoz, mantar çimlenme önlenmesi olarak değiştirilmiştir bağışıklık yanıtlarını ölçmek için kullanılabilir , ve 5 kişi öldü.
Bu protokolün bir acemi kullanıcı için problemli olabilir birçok tekniği ile ilgili sorunlar vardır. İlk olarak, iğne uygun şekilde kırpılır ve püskürtme basıncı düzgün bir şekilde ayarlanmış olması önemlidir böylece C. 5 nL albicans süspansiyon mikroenjeksiyon edilir. Bu bir bolus çıkan kontrol edebiliriz sağlamak içinbölüm 3.8 'de açıklandığı gibi iğne, bir prim 25 zebrabalıkları larva öğrencinin boyutudur. Bu Zebra balığı larvası ardbeyin ventrikül mevcut 10-15 maya olduğunu doğrulamak için Epifloresans tarafından hemen tarama sonrası enfeksiyon teyit edilebilir injectant aynı miktarda, aldığınız önemlidir. Enjekte balıklar da homojenize ve ilk koloni doğrulama birimleri 5 oluşturulması için kaplama yapılabilir. Bu larva erken ölümüne neden olarak İkincisi, bu, arka beyin ventrikül kan damarlarının delinmesiyle önlemek için önemlidir. Bu arka beyin ventrikül içine doğrudan mikroenjeksiyon sağlanması, yaklaşık 45 derecelik bir açı ile otik vezikül içine enjekte etmek için önemlidir. Üçüncü olarak, ekstra bakım patojen enfeksiyonu bağımsız enfeksiyon sitesine artış iltihabı neden olabilir otik vezikül doku, gözyaşı ya da zarar vermemeye alır. Larvalar agaroz Injecti üzerine yerleştirilmiş bir kez Dördüncüsü, enjeksiyonlar hızlı bir şekilde gerçekleştirilmesi gerekirçanağı. Larva çanak üzerinde uzun bir süre kurumaya bırakılan ve bu ortaya çıkarsa PBS enjeksiyonlu balık ölüm olacak. 15 dakika içinde enfeksiyon tamamlanması ve balık bulaşmasını hem de bu sorunu düzeltmek için yardımcı olurken tabağına su kalıntı miktarı bırakarak. Ancak, yemeğin çok fazla su bırakarak larva sürüklenen ile enjeksiyonlar daha zor hale getirebilir. Büyük (4 FAP) daha karmaşıktır, ancak havaya maruz larvaları önler balık için tarif enjeksiyon için alternatif bir yöntem Cosentino ve arkadaşları, 28 tarafından sağlanır.
Zebra balığı larva, bakteriyel, fungal ve viral patojenlere 5, 26, 35-46 kadar doğal immün yanıtın modellemek için kullanılmıştır bugüne kadar. Bu çığır açan çalışmalar her iki konak ve patojen yeni hücresel ve moleküler mekanizmalar keşfetmek için bu model sistem programını kurduk. Bu tarif protokolü ile birlikte değerlendirildiğinde, bu diğer yayınlanmış eserleri diğer Laboratories için bir temel oluşturmakbozulmamış bir konak bağlamında ana-mantar etkileşimini incelemek Ries.
Bu deneylerde faydalı olsa da, fli1: EGFP transgenik hattı burada açıklanan kendi sınırlılıkları vardır. Fli1 geni makrofaj gibi hücreler 22 ek olarak, endotel damar olarak ifade edilir. Genellikle damarların EGFP floresans zor C. algılamak için yapabilirsiniz makrofaj benzeri hücrelerde albicans. Buna ek olarak, makrofaj benzeri hücrelerde EGFP ifadesi zor algılamak için yapım 18-24 saat sonrası enfeksiyon etrafında azalır. Geçenlerde yayımlanan bir makrofaj özgü transgenik zebrabalıkları hattı makrofaj çalışmaları 23 için bir model olarak pek çok avantajı vardır.
Açıklanan enfeksiyon tekniği zebrabalıkları mevcut güçlü genetik ve floresan mikroskobu bir dizi araç için bir entrée sağlar. Uygun transgenik balık ve mühendislik C ile kombine edilebilir albicans C. içeren nötrofil ve makrofajların sayısı dahil, konak-patojen etkileşimi birçok açıdan miktarının etkinleştirmek için albicans, C. sıklığını albicans sindirim, ve C. bölünmesi doğuştan gelen bağışıklık hücreleri 5 içinde albicans. Bir de enfeksiyonu 5 bireysel doğuştan gelen bağışıklık genlerin rol test etmek için morfolino antisens oligonükleotidler kullanılarak bu protokolü birleştirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Yazarlar ekipman embriyo gelişimi ve kullanımı hızlandırmak konusunda tavsiye için mikroenjeksiyon eğitim, Clarissa Henry Dr Carol Kim laboratuar teşekkür ve fli1 katkıda bulunmak için Nathan Lawson olurdu: EGFP balık. Biz yazının eleştirel okuma için Wheeler laboratuar ve Shawn Duvarlar üyelerine teşekkür ediyorum. Biz de bu proje üzerinde teknik danışmanlık için balık bakımı ve tavsiye için Mark Nilan, ve Ryan Phennicie ve Kristin Gabor teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma K. Kardeşler, bir MAFES Hatch hibe E08913-08, ve R. Wheeler bir NIH NCRR ödülü P20RR016463 bir MAFES araştırma görevliliği tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spawning tanks | Aquatic habitats | 2L | |
| 1.7 mL tubes | Axygen | MCT-175-C | |
| Instant Ocean | Fisher Scientific | S17957C | |
| Extra deep Petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-11Z | |
| Standard Petri dishes | VWR Scientific | 25384-302 | |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| Yeast Extract | VWR Scientific | 90000-726 | |
| Peptone | VWR Scientific | 90000-264 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Agar | VWR Scientific | 90000-760 | |
| Disposable Hemocytometer | VWR Scientific | 82030-468 | |
| Phosphate Buffered Saline | VWR Scientific | 12001-986 | |
| Dumont Dumoxel Tweezers | VWR Scientific | 100501-806 | |
| Wooden Dowels | VWR Scientific | 10805-018 | |
| KimWipes | VWR Scientific | 300053-964 | |
| Low Melt Agarose | VWR Scientific | 12001-722 | |
| Agarose for injection dishes | VWR Scientific | 12002-102 | |
| Flaming Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Hollow glass rods | Sutter Instruments | BF120-69-10 | For glass rods smooth glass by heating over bunsen burner |
| Pipette Storage Box | Sutter Instruments | BX10 | |
| MPPI-3 Injection system | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
| Back Pressure Unit | Applied Scientific Instrumentation | BPU | |
| Micropipette Holder kit | Applied Scientific Instrumentation | MPIP | |
| Foot Switch | Applied Scientific Instrumentation | FSW | |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | |
| Magnetic Base | Applied Scientific Instrumentation | Magnetic Base | |
| Tricaine methane sulfonate | Western Chemical Inc. | MS-222 | |
| Dissecting Scope | Olympus | SZ61 top SZX-ILLB2-100 base | |
| Confocal Microscope | Olympus | IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system | |
| TC-7 Tissue Culture Roller drum with 14 inch test tube wheel | New Brunswick Scientific | TC-7 | |
| Imaging Dishes | MatTek Corporation | P24G-1.0-10-F | |
| Pipette tips for loading needles | Eppendorf | 930001007 | |
| Plate pouring grids | Adaptive Science Tools | TU-1 | |
| Heated Stage | Bioptechs Inc. | Delta T-5 | |
| Flat Spatula | VWR Scientific | 82027-486 | |
| Plastic Sieves | Wares of Knutsford Online | 12 cm | |
| Parafilm | VWR Scientific | 52858-000 | |
| Vortex Genie | VWR Scientific | 14216-184 | |
| 16 x 150 mm Culture tubes | VWR Scientific | 60825-435 | |
| Nanodrop | Thermo Scientific | ND 2000 | |
| Phenol Red | VWR Scientific | 97062-478 | |
| HCl | VWR Scientific | 87003-216 | |
| NaCl | VWR Scientific | BDH4534-500GP | |
| KCl | VWR Scientific | BDH4532-500GP | |
| MgSO4 | VWR Scientific | BDH0246-500GP | |
| Ca(NO3)2 | VWR Scientific | BDH0226-500GP | |
| HEPES | VWR Scientific | BDH4520-500GP | |
| Morpholinos | GeneTools, LLC |
References
- Trede, N. S., Langenau, D. M., Traver, D., Look, A. T., Zon, L. I. The use of zebrafish to understand immunity. Immunity. 20, 367-379 (2004).
- Kanther, M., Rawls, J. F. Host-microbe interactions in the developing zebrafish. Curr. Opin. Immunol. 22, 10-19 (2010).
- Meeker, N. D., Trede, N. S. Immunology and zebrafish: spawning new models of human disease. Dev Comp Immunol. 32, 745-757 (2008).
- Tobin, D., May, R. C., Wheeler, R. T. Zebrafish: a see-through host and fluorescent toolbox to probe host-pathogen interaction. PLoS Pathog. , (2011).
- Brothers, K. M., Newman, Z. R., Wheeler, R. T. Live imaging of disseminated candidiasis in zebrafish reveals role of phagocyte oxidase in limiting filamentous growth. Eukaryot. Cell. 10, 932-944 (2011).
- Pfaller, M. A., Diekema, D. J. Epidemiology of invasive candidiasis: a persistent public health problem. Clin. Microbiol. Rev. 20, 133-163 (2007).
- Ashman, R. B. Innate versus adaptive immunity in Candida albicans infection. Immunol. Cell Biol. 82, 196-204 (2004).
- de Repentigny, L. Animal models in the analysis of Candida host-pathogen interactions. Curr. Opin. Microbiol. 7, 324-329 (2004).
- Rogers, T. J., Balish, E. Immunity to Candida albicans. Microbiol. Rev. 44, 660-682 (1980).
- Calderone, R., Sturtevant, J. Macrophage interactions with Candida. Immunol. Ser. 60, 505-515 (1994).
- Frohner, I. E., Bourgeois, C., Yatsyk, K., Majer, O., Kuchler, K. Candida albicans cell surface superoxide dismutases degrade host-derived reactive oxygen species to escape innate immune surveillance. Mol. Microbiol. 71, 240-252 (2009).
- Kumamoto, C. A., Vinces, M. D. Contributions of hyphae and hypha-co-regulated genes to Candida albicans virulence. Cell Microbiol. 7, 1546-1554 (2005).
- Lorenz, M. C., Bender, J. A., Fink, G. R. Transcriptional response of Candida albicans upon internalization by macrophages. Eukaryot. Cell. 3, 1076-1087 (2004).
- Rubin-Bejerano, I., Fraser, I., Grisafi, P., Fink, G. R. Phagocytosis by neutrophils induces an amino acid deprivation response in Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 11007-11012 (2003).
- Behnsen, J. Environmental dimensionality controls the interaction of phagocytes with the pathogenic fungi Aspergillus fumigatus and Candida albicans. PLoS Pathog. 3, e13 (2007).
- Lavigne, L. M. Integrin engagement mediates the human polymorphonuclear leukocyte response to a fungal pathogen-associated molecular pattern. J. Immunol. 178, 7276-7282 (2007).
- Newman, S. L., Bhugra, B., Holly, A., Morris, R. E. Enhanced killing of Candida albicans by human macrophages adherent to type 1 collagen matrices via induction of phagolysosomal fusion. Infect. Immun. 73, 770-777 (2005).
- Netea, M. G., Brown, G. D., Kullberg, B. J., Gow, N. A. An integrated model of the recognition of Candida albicans by the innate immune system. Nat. Rev. Microbiol. 6, 67-78 (2008).
- Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Dev. Comp. Immunol. 28, 9-28 (2004).
- Magnadottir, B. Innate immunity of fish (overview). Fish Shellfish Immunol. 20, 137-151 (2006).
- Sullivan, C., Kim, C. H. Zebrafish as a model for infectious disease and immune function. Fish Shellfish Immunol. 25, 341-350 (2008).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev. Biol. 248, 307-318 (2002).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117, e49-e56 (2011).
- Renshaw, S. A. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108, 3976-3978 (2006).
- Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Curr Opin. Microbiol. 11, 277-283 (2008).
- Chao, C. C. Zebrafish as a model host for Candida albicans infection. Infect. Immun. 78, 2512-2521 (2010).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. , 203-253 (1995).
- Cianciolo Cosentino, C., Roman, B. L., Drummond, I. A., Hukriede, N. A. Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury. J. Vis. Exp. (42), e2079 (2010).
- Haddon, C., Lewis, J. Early ear development in the embryo of the zebrafish, Danio rerio. J. Comp. Neurol. 365, 113-128 (1996).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
- Ariga, J., Walker, S. L., Mumm, J. S. Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation. J. Vis. Exp. (43), e2093 (2010).
- Redd, M. J., Kelly, G., Dunn, G., Way, M., Martin, P. Imaging macrophage chemotaxis in vivo: studies of microtubule function in zebrafish wound inflammation. Cell Motil. Cytoskeleton. 63, 415-422 (2006).
- Gutzman, J. H., Sive, H. Zebrafish Brain Ventricle Injection. J. Vis. Exp. (26), e1218 (2009).
- Davis, J. M. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17, 693-702 (2002).
- Meijer, A. H. Identification and real-time imaging of a myc-expressing neutrophil population involved in inflammation and mycobacterial granuloma formation in zebrafish. Dev. Comp. Immunol. 32, 36-49 (2008).
- Mathias, J. R. Live imaging of chronic inflammation caused by mutation of zebrafish Hai1. J. Cell Sci. 120, 3372-3383 (2007).
- Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Dev. Biol. 7, 42 (2007).
- Vergunst, A. C., Meijer, A. H., Renshaw, S. A., O'Callaghan, D. Burkholderia cenocepacia creates an intramacrophage replication niche in zebrafish embryos, followed by bacterial dissemination and establishment of systemic infection. Infect Immun. 78, 1495-1508 (2010).
- Le Guyader, D. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish. Blood. 111, 132-141 (2008).
- Clatworthy, A. E. Pseudomonas aeruginosa infection of zebrafish involves both host and pathogen determinants. Infect. Immun. 77, 1293-1303 (2009).
- Brannon, M. K. Pseudomonas aeruginosa Type III secretion system interacts with phagocytes to modulate systemic infection of zebrafish embryos. Cell Microbiol. 11, 755-768 (2009).
- Levraud, J. P. Real-time observation of listeria monocytogenes-phagocyte interactions in living zebrafish larvae. Infect. Immun. 77, 3651-3660 (2009).
- van der Sar, A. M. Zebrafish embryos as a model host for the real time analysis of Salmonella typhimurium infections. Cell Microbiol. 5, 601-611 (2003).
- Phennicie, R. T., Sullivan, M. J., Singer, J. T., Yoder, J. A., Kim, C. H. Specific resistance to Pseudomonas aeruginosa infection in zebrafish is mediated by the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Infect Immun. 78, 4542-4550 (2010).
- Prajsnar, T. K., Cunliffe, V. T., Foster, S. J., Renshaw, S. A. A novel vertebrate model of Staphylococcus aureus infection reveals phagocyte-dependent resistance of zebrafish to non-host specialized pathogens. Cell Microbiol. 10, 2312-2325 (2008).
