Summary
Forstå funktionen af hvirveldyr centralnervesystemet kræver optagelser fra mange neuroner, fordi cortical funktion opstår ved størrelsen af populationer af neuroner. Her beskriver vi en optisk metode til at registrere suprathreshold neurale aktivitet med enkelt-celle-og single-spike opløsning, dithered random-access-scanning. Denne metode optegnelser somatiske fluorescens calcium-signaler fra op til 100 neuroner med høj tidsopløsning. En maksimal-sandsynlighed algoritme deconvolves den underliggende suprathreshold neurale aktivitet fra de somatiske fluorescens calcium signaler. Denne metode detekterer spikes med høj detektion effektivitet og en lav falsk positive og kan anvendes til at studere neurale populationer
Abstract
Signalering af oplysninger i hvirveldyr centrale nervesystem er ofte båret af populationer af neuroner snarere end individuelle neuroner. Også udbredelsen af suprathreshold spiking aktivitet indebærer populationer af neuroner. Empiriske undersøgelser vedrørende cortical funktion direkte derfor kræver optagelser fra populationer af neuroner med høj opløsning. Her beskriver vi en optisk metode og en dekonvolution algoritme til at optage neurale aktivitet fra op til 100 neuroner med enkelt-celle-og single-spike opløsning. Denne metode er baseret på påvisning af forbigående stigninger i intracellulær somatisk calciumkoncentration forbundet med suprathreshold elektriske pigge (aktionspotentialer) i kortikale neuroner. Høj tidsmæssig opløsning af de optiske optagelser opnås ved en hurtig random-access-scanning, hvor der anvendes akustooptiske deflektorer (AODs) 1. To-foton excitation af calcium-sensitive farvestof resulterer i høj rumlig opløsning i uigennemsigtige hjerne tissagsøge 2. Rekonstruktion af spidserne fra den fluorescens calcium optagelser opnås ved en maksimal sandsynlighed-metode. Samtidige elektrofysiologiske og optiske optagelser viser, at vores metode pålideligt detekterer spikes (> 97% spike afsløring effektivitet), har en lav falsk positiv spike detektion (<0,003 spikes / s), og en stor tidsmæssig præcision (ca. 3 ms) 3. Denne optiske fremgangsmåde til spike detektion kan anvendes til at registrere neurale aktivitet in vitro og in bedøvede dyr in vivo 3,4.
Protocol
1. Optiske opstilling (fig. 1)
- For to-foton excitering en infrarød pulseret laser system med femtosekund pulser anvendes. En høj laser udgangseffekt (i nogle tilfælde> 2W ved 890 nm bølgelængde) er forpligtet til at udligne de store tab indført ved de optiske komponenter i systemet.
- Et prechirper bestående af to prismer bibringer en negativ gruppehastighed dispersion (GVD) på de laserimpulser inden de akustooptiske deflektorer (AODs) for at kompensere for den tidsmæssige dispersion indført ved AODs 1.
- To AODs med store åbninger (10 mm for et 40x vand-nedsænkning formål med NA 0.8) afbøje laserstrålen i to dimensioner.
- En reflekterende diffraktionsgitter med 100 lunde / mm er placeret 13 cm bag AODs at kompensere for geografisk spredning indført ved AODs når du bruger korte laserpulser.
- Laserstrålen rettes med to relæ teleskoper i kameraporten af en opretstående microscope.
- Iris er placeret med regelmæssige mellemrum for opretning af de optiske komponenter.
- En dichroic beamsplitter foran målet transmitterer det infrarøde excitationslys til modellen og afspejler den fluorescens lys fra prøven på en detektor.
- Epi-og transfluorescence detektorer (fotoforstærkere, PMT'er) indsamle fluorescenssignal gennem målet og - i givet fald - gennem svaleren.
- Farvede glasfiltre (BG-39, 3-5 mm) placeres foran detektorerne for at forhindre excitationslys nå detektorerne.
- AOD deformation vinkler styres af en computer udstyret med en digital-analog-konverter board (156,25 kHz clock rate), som igen driver spændingsstyrede oscillatorer.
- Signalet fra fotoforstærkerne videresendes gennem et lavpas Butterworth-filter (cut-off-frekvens på 100 kHz) og digitaliseres af en analog-digital-konverter (156,25 kHz clock rate), før det lagres ien computer til analyse.
- Justering og elektrisk støj testes ved registrering af fordelingen af fluorescenssignaler med og uden laserlys, ved lav og høj forstærkning af fotoforstærkerne, samt med og uden indikator. Scanneren er korrekt opsætning og afskærmes ved bredden af fordelingen af fluorescenssignaler ved høj forstærkning og med indikator er meget større end bredderne af de andre fordelinger af fluorescenssignaler (fig. 2).
2. Eksperimentelle procedurer
- Dithered random-access-scanning er baseret på påvisning af intracellulære stigninger i calcium. Et stort antal neuroner kan farves ved hjælp af bolus-injektion af esteren form af et calcium-indikator (f.eks Oregon Green 488 BAPTA-1 AM) i nervevæv 5.
- Flere steder fra hver neuron soma registreres, hver for en kort tid ("dithering", 4 steder, 6,4 ps for hver lokalitet = 25,6 mikrosekunder optagetid for each neuron i hver cyklus, fig. 3C). At vælge neuroner af interesse fuld ramme bestående af 256x256 pixels erhverves (fig. 3A). Midten af hver neuron soma skal registreres vælges manuelt på dette billede. Kontrollen software automatisk tilføjer tre point på 2 um afstand omkring dette center.
- I hver cyklus, er fluorescens-signalet optages fra hver af de 40 neuroner (fig. 3B). Denne proces gentages for den samlede varighed af en optagelse (5 andet billede = 3255 cyklusser, 1 cyklus = 1,536 ms).
3. Online softwareværktøjer til at maksimere spike afsløring effektivitet
- Spike detektion af fluorescens somatiske calcium-signaler er baseret på et højt signal-til-støj (S / N) forholdet mellem somatiske fluorescens calcium-signaler. En høj S / N kan opnås ved at øge excitationsintensitet. Excitationsintensitet kan imidlertid kun øges til en vis grænse på grund af lysbeskadigelse. Spike detektion er høj inden for en meget lille window excitation intensiteter, når fluorescenssignaler har en høj S / N, men kun meget lidt lysbeskadigelse observeres 3. For at sikre, at de registrerede signaler ligger inden for vinduet med høj spike detektion under optagelser vi overvåger foton rate (se ligning 3.2) og fald i baseline fluorescens under anvendelse af online-analyse.
- Omtrentlig foton pr neuron beregnes ud fra en kort tidsvindue (100-200 ms) baseline støj. Antal fotoner (N λ) og foton rate (λ = N λ / At) beregnes ud fra de fluorescensværdier ved at montere fordelingen (σ) relative fluorescensændringer med følgende ligning:
Denne ligning repræsenterer Poissonfordelingen for photon shot støj med en ændring af variabel til relative fluorescens ændring: bf / F = (G * N λ (t)-G * N & lamBDA,, 0) / G * N λ, 0 hvor G angiver den kumulative gevinst på fotomultiplikator og alle andre elektroniske komponenter. Bemærk, at denne ligning ikke bestemmer antallet af registrerede fotoner til in vivo optagelser, fordi der er andre støjkilder (bevægelse artefakter), foruden foton skud støj. Alligevel denne ligning er nyttig til in vivo optagelser til at estimere støjen.
- Basisliniefluorescensen beregnes fra samme tidsvindue og afbildet som en funktion af tid eller forsøg. Den gennemsnitlige nedgang i baseline holdes under 0,0002 / s ved at justere laser magt, fordi spike detektion hurtigt falder, når overskrider denne grænse.
- Hver 10-20 min Neuron somata positioner verificeret af igen erhverve en full frame image. Hvis det er nødvendigt, er optagesteder justeret. Steder kan justeres til alle neuroner på én gang, eller for individuelle neuroner.
4. Reconstruction af spike tidspunkter fra fluorescenssignaler (dekonvolution)
- De fluorescenssignaler skyldes neural aktivitet ofte summere i tid, fordi henfald af calcium transienter er lang (flere hundrede millisekunder). En dekonvolution Fremgangsmåde rekonstruerer spike og piggen tider fra fluorescenssignaler.
- At bestemme den mest sandsynlige spike toget ligger til grund for optagede fluorescenssignal, er forskellige modeller sammenlignet. Her anvendte vi en genetisk algoritme for at bestemme modellens - og dermed piggen toget og spike tider - med maksimal sandsynlighed.
- I inhomogene populationer af neuroner, kan piggen-fremkaldte calcium-signalet varierer mellem neuroner. Til uovervåget analyse af datasæt vi udviklet en algoritme, som tager hensyn til variationen af piggen-fremkaldte calcium signal fra neuron til neuron.
- For at undgå et stort antal falske positive detektioner er det nyttigt at snøre den tilladte amplitude og henfald tidskonstant for model af spyddet-fremkaldte calcium signal. Den fælles fordeling af amplitude og henfald tidskonstanten for single-spike fremkaldt calcium transienter registreres i et separat sæt forsøg fra den samme type neuroner under de samme eksperimentelle betingelser under anvendelse af samtidige elektrofysiologiske og optiske optagelser.
- At tegne sig for langsomme baseline ændringer og reducere beregningsmæssige omkostninger ved deconvolving, er længere optagelser opdelt i flere kortere spor af 1-5 sekunder.
- For hver neuron og hver optagelse, kan dekonvolution algoritmen teste et stort antal modeller (op til 1.000.000 forskellige modeller eller mere). For at fremskynde dekonvolution, er et eksperiment deconvolved på op til 10 forskellige computere i parallel.
- Efter udfoldning, er piggen data analyseres og inspiceret. En peri-stimulus tid histogram, spike sandsynlighed, og fyring (gennemsnitligt spike pr neuroner) opgøres i en automatiseret måde.
5.Repræsentative resultater
Vellykkede spike detektion afhænger af et højt signal-støjforhold af de registrerede fluorescens somatiske calcium signaler. Simpelthen ved hjælp af høj excitation satser (høj laser power) kan resultere i en negativ indvirkning på photoeffects på biologisk materiale (solskader). I dithered random-access-scanning lysbeskadigelse manifesterer sig som et fald i basisliniefluorescensen og aftager af spike-fremkaldte calcium fluorescenssignaler. Faldet i piggen-fremkaldte signal kan hurtigt føre til en manglende påvisning spikes. Der er kun en meget lille vindue i excitationsintensitet hvor spike påvisning af fluorescenssignaler er høj. I den højere ende vinduet er begrænset af lysbeskadigelse, på den nedre ende af fluorescenssignaler har et lavt signal-støj-forhold. For corticale neuroner i akutte skiver vi bruger laser magt resulterer i foton satser på ca 400,000-1,500,000 foton / s ved optagelse på omkring 100 um under skive overflade. Når der anvendes en højAffinitet indikator - her Oregon Green 488 BAPTA - 1 - dette signal er tilstrækkeligt til at påvise individuelle pigge. Fig. 3E viser et eksempel på et fluorescenssignal registreret ved meget lav excitation rate, et eksempel på en optagelse i detektionsvinduet, og en i meget høj excitation rate.
Sammenlignet med andre teknikker til at optage neurale aktivitet med enkelt-celle-og single-spike opløsning, dithered random-access-scanning kan optage fra et større antal neuroner fra samme, lokale befolkning, og er mindre invasiv for eksempel i forhold til tetrode / multielectrode optagelser . Således dithered random-access-scanning kan anvendes til at optage neurale aktivitet fra mange neuroner til måling gensidige information signaleret af suprathreshold aktivitet 6 (fig. 4A), ændringer i neural aktivitet i en population af neuroner (kortikal plasticitet), og propagering af suprathreshold aktivitet gennem populationer af neuroner 14 (fig. 4B)
Fig. 1. Optisk udformning af dithered-random access scanning setup.
Figur 2 Justering og test:. Distributioner af fluorescenssignaler registreret under forskellige forhold. A) Ingen laserlys og lav fotomultiplikator gain, B) Ved højere PMT gain, men ingen laserlys, fordelingen er bredere på grund af fotomultiplikator mørkestrøm. C) Med laseren på og registreres ved høj PMT gevinst. En forskel mellem fordelingerne i vist i B og denne fordeling tyder på, at excitationslyset når de PMT detektorer. D) Fordelingen af fluorescenssignaler optaget ved høj gevinst fra neuron somata. Hvis ingen anden støjkilde bidrager denne fordeling skyldes foton shot-støj alene.
. Jpg "/>
Figur 3 A) Full frame fluorescensbillede at detektere og vælge neuron somata positioner, B) Scan vej én cyklus, C) Illustration af dithering princip. På hver Soma (cirkel) flere steder registreres før man går strålen til den næste soma, D) Illustration af udgangssignalet fra de to D / A-kanaler. For hver neuron soma, er fluorescenssignal registreres fra 4 forskellige steder i hver soma (S1-S4). Placeringen af hver plet er givet ved dets x og y position. X-og y-positioner for alle pletter og alle neuroner sendes til digital-til-analog konverter på en sekventiel måde. Mens strålen bevæges mellem to neuron somata, er der ikke signal erhvervet (blank). E) Eksempler på fluorescenssignaler. Bemærk, at hvert eksempel viser svar på en pig (målt med elektrofysiologisk cell-attached-optagelse).
Figur 4. Studere Cortical funktion ved hjælp dithered random-access-scanning. A) Måling gensidig information signaleret af populationer af neuroner. Øverste billede viser mikrofotografi af en akut hjerne skive og to stimulation pipetter anbragt i samme kortikale kolonne i laget 4 (L4). Center-grafer viser neurale reaktioner for hver gentagelse af en stimulus. Nederste graf viser Shannons gensidig information signaleres af den registrerede population af neuroner. B) Måling formering af suprathreshold spiking aktivitet (signaludbredelse) mellem populationer af kortikale neuroner. Øverste graf viser eksperimentelle design, midterste billede viser fluorescensbillede, stiplede linjer angiver tønde grænser, nederste graf viser detekterede spidser i respons på elektrisk stimulering af thalamocortical fibre (trekanter).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dithered random-access-scanning indirekte registrerer suprathreshold spiking aktivitet fra stigningerne i intracellulær somatisk calcium forbundet med hver stigning i et neuron somata. De stigninger i intracellulært calcium påvises ved fluorescerende calcium farvestoffer. Begrænsningerne ved dithered random-access-scanning skyldes i stor udstrækning af den begrænsede signal-støj-forholdet for calcium-fluorescenssignaler. The signal-støj-forhold er igen begrænset af lysbeskadigelse, som ikke tillader anvendelse af høje excitations-rater. På grund af den begrænsede signal-støj-forhold, ikke spike detektion i nogle neuroner og kan også mislykkes for en vedvarende og højfrekvent aktivitet. F.eks. Når optagelse in vivo, er spike detektion kraftigt reduceret for spike satser på 40 Hz og højere 4 Årsagen til reducerede spike opdagelse er, at sandsynligheden forskelle for rigtige og forkerte modeller blevet stadig mindre for kortere inter-spike intervaller. EndvidereKan dithered random-access-scanning kun anvendes til populationer af neuroner, hvor somatiske stiger i calcium er stærkt korreleret med spiking aktivitet 7, som ikke er tilfældet for alle områder i hjernen og celletyper (for eksempel til granulceller i haletudse lugtekolben 8 ).
Som et alternativ til den optiske udformning er der anvendt her en enkelt prisme kan anvendes til at kompensere for rumlig og tidsmæssig spredning af AODs stedet for to prismer og et diffraktionsgitter 4,9. Fordelen ved en enkelt prisme design er et højere gennemløb af lasereffekt. Som et alternativ til den analoge kontrol af frekvensgeneratorer vi har anvendt her, kan en digital kontrolsystem anvendes 1,4,10. En analog kontrol er enklere at gennemføre, men det er også mere udsat for elektrisk støj forvridninger. Elektrisk støj kan påvirke stråle placering og resultere i en højere støj af de registrerede calcium fluorescenssignaler, og dermed reducere spike forværringIndsatsen effektivitet. En digital kontrol-ordningen, på den anden side, kan være genstand for digitaliseringen artefakter.
Flere algoritmer er blevet foreslået til dekonvolution af spidserne fra fluorescenssignaler. Disse omfatter en skabelon matchningsalgoritme en "peeling" algoritme 4, sekventiel Monte-Carlo metoder 11, en maksimal sandsynlighed metode 3, og andre 12. Kun få af disse metoder forklare forskellene i spike-fremkaldte calcium-signaler i inhomogene befolkninger. Vores algoritme står for forskelle i spike-fremkaldte calcium amplitude mellem neuroner. Det kan således anvendes til at deconvolve store datasæt fra inhomogene populationer af neuroner i et automatiseret og ukontrollerede måde.
In-vivo optagelser med optisk spike detektion er begrænset til neuroner i overfladiske lag. Desuden in-vivo optagelser står over for den yderligere vanskelighed bevægelighed artefakter, der opstår fra hoved movements i frit at flytte dyr og hjerteslag i bedøvede eller immobiliseret dyr. Disse bevægelser artefakter kan let forhindre spike detektering, fordi selv små bevægelser vil resultere i fluorescensændringer der overstiger dem fremkaldt ved spiking aktivitet. Potentielle løsninger omfatter oversampling og bevægelse korrektioner metoder.
De sidste par år har oplevet en rivende udvikling af teknologien og de analysemetoder, der optisk registrerer suprathreshold neurale aktivitet. Fremtidige teknologiske forbedringer kan yderligere øge anvendeligheden af dithered random-access-scanning ved at øge arbejdscyklus. Både spike afsløring effektivitet samt antallet af registrerede neuroner drage fordel af en høj intermittens. Genetisk kodede calcium indikatorer kan eliminere bolus farvning af neuroner eller tillade farvning og optagelse fra bestemte subpopulationer af neuroner. I øjeblikket, men de nedre fluorescensændringer på genetisk indkodede calcium indikatorer gørikke tillade pålidelig detektion af enkelte pigge 13. Endelig ville en real-time kompensation for bevægelsesartefakter tillade optagelser i vågen og opfører dyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Randy Chitwood for kritisk læsning af manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af Whitehall Foundation og Alfred P. Sloan Foundation tilskud til HJK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Optical components are listed in order, starting from the laser | |||
| Titan:Sapphire Laser | Coherent Inc. | Chameleon Ultra 2 | High power output recommended (>2W at 900 nm) |
| Achromatic lens f = 30 mm | Thor labs | AC254-030-B | Anti-reflection (AR) coating for 650-1050 nm |
| Achromatic lens f = 100 mm | Thor labs | AC254-100-B | AR 650-1050 nm |
| lens f = 75 mm | Thor labs | LA1608-B | AR 650-1050 nm |
| lens f = 175 mm | Thor labs | LA1229-B | AR 650-1050 nm |
| Achromatic lens f = 300 mm | Thor labs | AC254-300-B | AR 650-1050 nm |
| Achromatic lens f = 100 mm | Thor labs | AC254-100-B | AR 650-1050 nm |
| Achromatic lens f = 100 mm | Thor labs | AC254-100-B | AR 650-1050 nm |
| Acousto-optical deflectors | Intraaction Corp | ATD 6510CD2 | |
| Reflective diffraction grating | Newport | 53-011R | 100 grooves/mm for AODs with 65 MHz bandwidth and scan angle of 45 mrad |
| 21.6 mm Brewster prisms | Lambda Research Optics Inc. | IBP21.6SF10 | |
| Colored Glass | Schott | BG-39 | |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp | Z532RDC | |
| Photomultiplier modules | Hamamatsu | H9305-03 | |
| DAC-ADC board | National Instruments | PCI-6115 | |
| Oregon Green 488 Bapta-1 AM | Invitrogen | O-6807 | |
References
- Iyer, V., Hoogland, T. M., Saggau, P. Fast functional imaging of single neurons using random-access multiphoton (RAMP) microscopy. J. Neurophysiol. 95, 535-545 (2006).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73 (1990).
- Ranganathan, G. N., Koester, H. J. Optical recording of neuronal spiking activity from unbiased populations of neurons with high spike detection efficiency and high temporal precision. J. Neurophysiol. 104, 1812-1824 (2010).
- Grewe, B. F., Langer, D., Kasper, H., Kampa, B. M., Helmchen, F. High-speed in vivo calcium imaging reveals neuronal network activity with near-millisecond precision. Nat. Methods. 7, 399-405 (2010).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 7319-7324 (2003).
- Pita-Almenar, J. D., Ranganathan, G. N., Koester, H. J. Impact of cortical plasticity on information signaled by populations of neurons in the cerebral cortex. J. Neurophysiol. 106, 1118-1124 (2011).
- Kerr, J. N., Greenberg, D., Helmchen, F. Imaging input and output of neocortical networks in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 14063-14068 (2005).
- Lin, B. J., Chen, T. W., Schild, D. Cell type-specific relationships between spiking and [Ca2+]i in neurons of the Xenopus tadpole olfactory bulb. J. Physiol. 582, 163-175 (2007).
- Zeng, S., Lv, X., Zhan, C., Chen, W. R. Simultaneous compensation for spatial and temporal dispersion of acousto-optical deflectors for two-dimensional scanning with a single prism. Opt. Lett. 31, 1091-1093 (2006).
- Otsu, Y., Bormuth, V., Wong, J., Mathieu, B. Optical monitoring of neuronal activity at high frame rate with a digital random-access multiphoton (RAMP) microscope. J. Neurosci. Methods. 173, 259-270 (2008).
- Vogelstein, J. T., Watson, B. O., Packer, A. M., Yuste, R. Spike inference from calcium imaging using sequential Monte Carlo methods. Biophys. J. 97, 636-655 (2009).
- Yaksi, E., Friedrich, R. W. Reconstruction of firing rate changes across neuronal populations by temporally deconvolved Ca2+ imaging. Nat. Methods. 3, 377-383 (2006).
- Hendel, T., Mank, M., Schnell, B., Griesbeck, O. Fluorescence changes of genetic calcium indicators and OGB-1 correlated with neural activity and calcium in vivo and in vitro. J. Neurosci. 28, 7399-7411 (2008).
- Ranganathan, G. N., Koester, H. J. Correlations decrease with propagation of spiking activity in the mouse barrel cortex. Front Neural Circuits. 5, 8 (2011).
