Summary
A فحص الطفيليات الإنقاذ وتحول الخلايا المصابة مع THP1
Protocol
1. صيانة وثقافة ثانوية THP1 زراعة الخلايا
- الحفاظ على THP1 الخلايا في المتوسط RPMI-1640 (FBS مع 10٪ ودرجة الحموضة 7.4) في C ° 37 في حاضنة 5٪ CO 2.
- ثقافة فرعية الخلايا مرتين في الأسبوع لمنع خلايا من تجاوز 1x10 6 خلايا / مل. هذا مهم للحفاظ على قدرتها التحول.
2. صيانة وثقافة ثانوية الليشمانيا الدونوفانية الثقافة Promastigotes
- الحفاظ على L. الدونوفانية promastigotes (S1، السودان سلالة) في RPMI-1640 متوسطة (بدون بيكربونات الصوديوم والصوديوم البيروفات) مع FBS 10٪ عند 26 ° C.
- ثقافة فرعية L. الدونوفانية promastigotes مرتين في الأسبوع، مع تركيز أعلى الخلايا في نطاق promastigotes 6 20-25x10 / ml.Caution: يجب تقديم جميع وسائل الإعلام وحلول لدرجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
3. البذر وتمايز الخلايا THP1 في ج 96 صفيحة ميكروسكوبية جيدا و16-غرفة الشرائح الثقافة الزجاج.
- إعداد المخفف THP1 الثقافة مع عدد خلايا من الخلايا 5 2.5x10 / مل من ثقافة الخلية أربعة أيام من العمر (عدد خلايا يجب أن لا تتجاوز 10 6 خلية / مل) في RPMI-1640 مع FBS المعطل للحرارة بنسبة 10٪. أعدت 20 مل من ثقافة كل لوحة 96-4 مل بشكل جيد والثقافة لكل شريحة الدائرة 16-أيضا.
- إضافة phorbol 12-13-ميريستات خلات (PMA) (للتمايز THP1) إلى الخلية المخففة التعليق الثقافة (10 مل الثقافة μl/20 من المخزون من 50 ميكروغرام / مل في DMSO) (PMA النهائي تركيز الخلايا في الثقافة يجب أن تكون مخففة 25 نانوغرام / مل).
- للمقارنة بين صورة الرقمية تحليل المباشر العد والفحص الطفيلي الإنقاذ فإن التحول الفحص، إعداد المقايسات في وقت واحد في واضحة، مسطحة القاع لوحة 96-حسنا، و 16 غرفة، والزجاج والمجهرية الشريحة الثقافة.
- الاستغناء 200 ميكرولتر من الخلايا THP1-PMA المعاملة لكل بئر أو الدائرة.
- احتضان ع 96-جيداالمرحومين والشرائح غرفة 16-C بشكل جيد في درجة 37، 5٪ CO 2 حاضنة ليلة وضحاها للسماح التمايز شبه كامل للخلايا.
ملاحظة: يتم التمييز الخلايا THP1، التي تنمو عادة في التعليق، في الضامة ملتصقة.
4. إصابة الخلايا THP1 تحولت مع Promastigotes الدونوفانية الليشمانيا
- لإصابة خلية ثقافة متباينة THP1 مع promastigotes الدونوفانية الليشمانيا، ينبغي أن يكون غالبية الطفيليات المعدية في مرحلة metacyclic (أشكال اسطوانية طويلة، ~ 5-6 يوم الثقافة القديمة).
- A 1:10 THP1 الخلية إلى نسبة الطفيلي هو الأمثل لإصابة في كل من الفحص الرقمي، صورة التحليل المباشر العد والمشيقة الإنقاذ فإن التحول الفحص.
- إعداد ثقافة المخففة للL. الدونوفانية promastigotes مع عدد الطفيليات رقم 6 من الطفيليات 2.5x10 / مل (للTHP1 الخلايا: = نسبة الطفيليات 1:10) منثقافة 5-6 أيام من العمر في المتوسط RPMI-1640 مع 2٪ FBS.
- من الخطوة 3.5 (بعد التمايز بين عشية وضحاها من زراعة الخلايا THP1) إخراج لوحات الشرائح وغرفة، وإزالة المتوسطة وغسل مزارع الخلايا مرة واحدة مع المصل خالية متوسطة RPMI-1640.
- بعد غسل دقيق للتعامل PMA-THP1 الخلايا مع المصل خالية، دافئة RPMI-1640 (~ 37 درجة مئوية) المتوسط، استبدال المتوسطة المصل خالية مع 200 ميكرولتر من ثقافة المخففة للL. الدونوفانية promastigotes (2.5x10 6 الطفيليات / مل) من الخطوة 4.3. إعداد السيطرة على آبار THP1 الخلايا دون الطفيلي والطفيليات والخلايا دون THP1 في كل لوحة والشرائح غرفة 16-أيضا.
- بعد إضافة الطفيلي إلى زراعة الخلايا THP1، احتضان لوحة الشرائح وعند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 لمدة 24 ساعة للسماح للطفيليات لتصيب الخلايا المتمايزة THP1.
5. علاج الضامة المصابة مع أدوية اختبار / مركبات
- اختبارالأمفوتريسين B، البنتاميدين وMiltefosine والعقاقير المضادة لليشماني القياسية للفحص. إعداد حلول الأسهم من المخدرات / مركبات اختبار في الماء أو DMSO كما هو مذكور في الجدول كاشف. اختبار كل مركب المخدرات في 6 تجمعات.
- تخفيف متسلسل (1:5) على العقاقير القياسية ومركبات الاختبار في لوحة جديدة 96-جيدا أو 2 مل أنابيب (للشرائح غرفة) مع المتوسط RPMI-1640 مع 2٪ FBS. المخدرات / تركيزات المركب في هذا الاختبار هي لوحة 2X تركيزات النهائي.
- تغسل الصحون الثقافة والشرائح غرفة المصابين L. promastigotes الدونوفانية (من الخطوة 4.5) على الأقل 5 مرات مع المصل خالية متوسطة RPMI-1640. إضافة 100 ميكرولتر المتوسطة الثقافة (RPMI-1640 مع 2٪ FBS) في كل بئر / غرفة. والغسيل متعددة ضرورية لضمان إزالة كاملة من غير المنضوية promastigotes.
- إضافة 100 ميكرولتر من المتوسطة متسلسل-المخفف العقاقير المضادة لليشماني القياسية أو مركبات الاختبار لكل بئر أو الدائرة. إعداد العدوىتيد الخلايا THP1 تسيطر المخدرات دون وقت واحد في كل شريحة لوحة / غرفة.
- احتضان لوحات الشرائح وغرفة في 37 ° C، 5٪ CO 2 لمدة 48 ساعة.
6. غرفة تلوين الشرائح، التصوير مجهر نيون وتحليل الصور لالكمي لتأثير العدوى والعلاج الدوائي
- بعد 48 ساعة حضانة، وغسل الشريحة غرفة 3 مرات مع المصل خالية متوسطة RPMI-1640. انزع الدوائر من البلاستيك الشرائح وتحديد الخلايا عن طريق غمر الشرائح في الميثانول لمدة 30 ثانية. ترك الشرائح في الحيوية تحت غطاء محرك السيارة تدفق الهواء لتجفيف.
- إعداد الأخضر SYBR حل تلطيخ I (5X) من خلال تمييع (1:2،000) السهم (10،000 X) مع الماء.
- وصمة عار الشرائح في ظل ظروف مظلمة مع الأخضر المخفف SYBR I صمة عار حل لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وغسل مرة واحدة مع الماء ويترك الشرائح تحت تدفق الهواء لتجفيف.
- وضع ساترة الزجاج الكاملة على staiNED الشريحة بمساعدة المتوسطة المتزايدة.
- التقاط الصور الرقمية من خلايا THP1: دون العدوى (فارغة)، مع إصابة (التحكم)، الخلايا المصابة تعامل مع الأدوية القياسية المختلفة أو مركبات اختبار في التخفيفات مختلفة (الشكل 3 و 5 و 6)) باستخدام مجهر نيكون الكسوف 90i الفلورسنت رافق بواسطة NIS البرمجيات عنصر 3،2 AR.
- عد نوى البلاعم (كبيرة) ونواة الطفيلي (صغير مع منشأ الحركة) باستخدام يماغيج (الشكل 7)، والذي هو علنا المتاحة، ومعالجة الصور برنامج جافا القائمة المتقدمة في المعاهد الوطنية للصحة ( http://rsb. info.nih.gov / ط / download.html ). تعبر عن البيانات حيث وصل عدد amastigotes لكل 100 THP1 تحول الخلايا.
7. الطفيلي الإنقاذ فإن التحول-الفحص: تحلل من الشواهد L. الدونوفانية Amastigotes الضامة المصابة
- غسل صفيحة ميكروسكوبية 96-جيدا من الخطوة 5.5 مع المصل ثلاث مرات خالية RPMI-1640 متوسطة الثقافة.
- بين مختلف المنظفات اختبار بتركيزات مختلفة، 0.05٪ SDS العلاج لمدة 30 ثانية هو الأمثل للتحلل للرقابة (الحد الأقصى تحلل الخلايا مع فقدان الحد الأدنى من السلامة الطفيليات انقاذ ').
- إزالة المتوسطة المصل خالية من كل بئر بعد غسل الماضي، وإضافة 20 ميكرولتر من RPMI-1640 (0.05٪ مع SDS) إلى كل بئر. يهز لوحة لمدة 30 ثانية وإضافة 180 كاملة ميكرولتر RPMI-1640 (FBS مع 10٪) إلى كل بئر.
- احتضان لوحات في C ° 26 لمدة 48 ساعة لتحويل amastigotes انقاذ لpromastigotes.
8. التحليل الكمي من المشيقة المحولة (alamarBlue الفحص)
- بعد 48 ساعة حضانة في 26 ° C، يتم تحويل كافة amastigotes انقاذ الحية في promastigotes (1D الشكل). إضافة 10 ميكرولتر من كل بئر إلى alamarBlue من ص 96-جيداالمرحومين.
- احتضان لوحات عند 26 درجة مئوية خلال الليل.
- بعد مرور فترة الحضانة بين عشية وضحاها، وقراءة لوحات لمضان القياسية على مقياس التألق غالاكسي Fluostar (BMG مختبر تكنولوجيا) في الإثارة نانومتر 544، 590nm الانبعاثات.
- إعداد منحنيات الاستجابة للجرعة (في المئة مقابل نمو تركيز مركب المخدرات أو اختبار) مع ExcelFit (أرقام 7-9) وحساب IC 50/90 IC القيم من هذه المنحنيات (الجدول 1).
9. توحيد THP1 خلايا لنسبة الطفيليات
- توحيد الخلايا THP1 إلى نسبة الطفيليات لتحديد حساسية الفحص. ملاحظة: العدوى منخفض / عاليا الطفيليات أرقام / قد حل وسط مع الحساسية والانتقائية للفحص.
- توحيد الخلايا THP1 إلى نسبة الطفيليات باتباع البروتوكول المذكورة أعلاه للبذار والليشمانيا الخلايا THP1 العدوى المشيقة (القسم 3 و 4) فرق باستثناء استخدامerent نسب THP1 خلايا للطفيليات و1:1.25، 1:5، 1:2.5 و1:10.
- إعداد التجربة سواء في غرفة 16-الشريحة (لتحليل الصور) وكذلك 96-وحة (لطفيل الإنقاذ مقايسة) أشكال للمقارنة بين الطفيلي والإنقاذ المقايسات تحليل الصور.
10. توحيد المنظفات المختلفة للتحلل الخلايا تسيطر عليها
- والهدف الرئيسي من هذه التجربة هو لتحسين بروتوكول للرقابة تحلل الخلايا THP1 لتحقيق أقصى قدر من / تحلل الخلايا كاملة دون أن يؤثر ذلك بشكل كبير THP1 جدوى ليشمانة الطفيليات انقاذهم.
- اختبار المنظفات المختلفة مثل توين 20، توين 80، تريتون X-100، 40-NP وSDS بتركيزات مختلفة وفترات مختلفة من العلاج (الشكل 2).
- THP1 الخلايا لنسبة الطفيليات هو 1:10 و غيرها من الشروط هي مماثلة لأقسام أعلاه 1-8.
- اختبار العلاج SDS 0.05٪ لمزيد من الوقت معاملة مختلفةليالي لمزيد من تحسين تحلل الخلايا التي تسيطر عليها.
Representative Results
وقد تم A التحليل الكمي لكلا الرقمية صورة التحليل المباشر العد والفحص الطفيلي الإنقاذ فإن التحول الفحص لمدة 24، 72، 48 و 96 ساعة بعد العلاج المخدرات
في العد المباشر العدوى وطريقة L. تم حساب الدونوفانية الضامة المصابة (THP1 الخلايا) بواسطة المعادلة التالية:
حولت amastigotes (يحدده العد amastigotes نوى) / 100 THP1 الخلايا (عن طريق عد عد تحديد في نوى الخلايا THP1) (الشكل 7) هو مقياس أكثر دقة لتحليل تأثير معايير مختلفة أو مركبات الاختبار من النسبة المئوية للخلايا المصابة THP1 ، كما ورد في بعض الصحف السابقة، وذلك لأن هناك علاقة مباشرة هذا العدد إلى التأثير الكلي من المركبات، سواء من خلال انخفاضفي الطفيليات في خلايا البلاعم أو إزالة الطفيليات مجموعه من cells.Infection البلاعم تم حساب من الصور الرقمية من الخلايا المصابة THP1 تعامل مع الأدوية القياسية في مختلف التخفيفات مختلفة لفترات زمنية مختلفة (الشكل 10 والجدول 1). وقراءة وشامل للصورة الرقمية لتحليل الفحص المباشر العد والفرز تحولت amastigotes infection/100 THP1 الخلايا، في حين أن قراءة من على الطفيلي الإنقاذ، فإن التحول كان الفحص وحدات مضان النسبي (RFU)، والذي هو يتناسب طرديا مع عدد من amastigotes الليشمانيا الحية انقاذ المصابين من الضامة، والتحول إلى promastigotes. يستخدم بشكل روتيني الفحص alamarBlue لpromastigotes الليشمانيا فحص المخدرات المضادة لليشماني.
كان في البداية فحص موحدة والأمثل لتحلل الخلايا تسيطر THP1 الليشمانيا المصابين. كان الهدف هو تحسين شروط TRE المنظفاتatment، والتي تسفر عن تحلل شبه كامل من الخلايا THP1 مع تأثير ضئيل على صلاحية amastigotes انقاذهم. الشكل 1 يصور وجهة نظر المجهرية للبروتوكول الفحص الكامل. ويمكن رؤية سليمة THP1 الخلايا المصابة مع amastigotes الليشمانيا في الشكل 1A. يوضح الشكل 1B تحلل الخلايا THP1 بعد العلاج المنظفات. يوضح الشكل 1C انقاذ الليشمانيا amastigotes، والتي تم تحويلها جزئيا في promastigotes ويوضح الشكل 1D التحول الكامل إلى ما يقرب من amastigotes promastigotes وانتشارها اللاحقة. ويمكن نمو هذه promastigotes تحولت رصد كميا مع اضافة alamarBlue وقياس مضان على قارئ صفيحة ميكروسكوبية. هي lysed العلاج مع NP-40 (الشكل 2A) وتريتون X-100 (الشكل 2B) والخلايا المصابة THP1، إلا أنها أثرت أيضا على البقاء وتحويل amastigotes انقاذهم. لم العلاج مع توين 20 (الشكل 2C) وتوين 80 (الشكل 2D) لا يسبب تحلل الأمثل للTHP1 الخلايا الناتجة إلى الإنقاذ غير مكتملة من amastigotes كما أشارت إلى ذلك انخفاض عدد promastigotes تحول. أسفرت العلاج مع SDS 0.05٪ لمدة 30 ثانية (2E الشكل) تحلل شبه كامل من الخلايا المصابة THP1 الليشمانيا ولم يؤثر السلامة والتحول من amastigotes انقاذهم. وأظهرت كذلك أن التحسين علاج الخلايا مع SDS 0.05٪ لمدة 20-30 ثانية أسفرت عن إنقاذ أعلى amastigotes الليشمانيا قابلة للحياة (الشكل 2F). في التجارب اللاحقة، والمعاملة مع SDS 0.05٪ لمدة 30 ثانية واستخدم. إجراءات العلاج SDS هو نفسه بالنسبة لوحات مفردة أو متعددة. في لوحات متعددة، تم تنفيذ SDS العلاج عمود من الأعمدة مع ماصة الأقنية. تمت إزالة المصل خالية متوسطة من جميع 8 آبار من عمود واحد من لوحة و 20 و مو؛ وأضيف لتر من SDS 0.05٪ في 8 آبار من نفس العمود وتضعف بعد 30 ثانية مع RPMI-1640 مع FBS 10٪. خلال توحيد الأولية للمقايسة، تم فحص لوحات تحت المجهر لغير المنضوية promastigotes. كانت لا تقل عن خمس الغسيل اللازمة لإزالة الطفيليات قبل الخطوة 5 من علاج خلايا البلاعم المصابة مع المركبات القياسية وثلاثة الغسيل ضرورية قبل الخطوة 7 من العلاج SDS. وهكذا، تم غسلها الخلايا 8 مرات وليس غير مرئية المنضوية promastigotes ظلت تحلل قبل السيطرة على الخلايا المصابة THP1.
تحليل الصور الرقمية والعد المباشر
تم القبض على الصور الرقمية من الخلايا المصابة THP1 الليشمانيا على نيكون المجهر الفلورسنت 90i الكسوف بعد تلطيخ مع SYBR الأخضر I. شوهدت كل من نوى الخلايا البلاعم ونوى الليشمانيا مع DNA منشأ الحركة المميزة تحت المرشحات الفلورسنت (الشكل 3). علاوة على ذلك، تم القبض أيضا على الصور من الخلايا المصابة تحت THP1 DIC. وعندما تم دمج كل من الصور، ينظر إلى الخطوط العريضة لTHP1 الخلايا مع الخلايا amastigotes أكثر وضوحا (الشكل 4). تم استخدام برنامج يماغيج لتحليل هذه الصور. يماغيج هو المجال العام، جافا ومقرها لمعالجة الصور برنامج تطوير التابع للمعاهد القومية للصحة ( http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html ). وقد تم تصميم يماغيج مع بنية مفتوحة توفر التمدد عبر المحمول جافا وحدات الماكرو للتسجيل. ويمكن تطوير عادة اقتناء وتحليل وتجهيز الإضافات باستخدام يماغيج الذي بني في محرر ومترجم جافا. لعد الفرق من نوى الخلايا THP1 ونوى الطفيلي من يماغيج، وافتتح الصورة في يماغيج. تم العثور على مكافحة الخلايا في تحليل الخيار في البرنامج المساعد للبرنامج. تمت تهيئة الصورة وتم اختيار نوع من الخلايا 1 لمكافحة ج THP1وقد تم اختيار نواة الخلية الذراع ونوع العداد 2 للنوى الطفيلي (الشكل 3). وقد تم فرز التفضيلية للنوى الخلايا لا يقل عن 200 THP1 وamastigotes داخل الخلايا الموجودة في هذه نوى الخلايا THP1. وقدم مقارنة بين الطفيل والإنقاذ مقايسة صورة أسلوب التحليل لتقييم العدوى من الخلايا THP1 مع البلاعم مختلفة: promastigotes نسب (الشكل 4) الشكل 5 يمثل الفرق العدوى في خلايا THP1 في البلاعم مختلفة: نسب المشيقة. وأظهرت كل من الأساليب والنتائج قابلة للمقارنة على البلاعم: نسبة المشيقة من 1:10 أسفرت العدوى الأمثل وقابلة للتكرار.
مرة واحدة تم الأمثل شروط الفحص والتحليل parasite-rescue/transformation الصور الرقمية، تم تقييم مدى فائدة هذه المقايسات للفحص العقاقير المضادة لليشماني. تم علاج الليشمانيا الخلايا المصابة THP1 مع تركيزات مختلفة من معيارالمعهد القومي للاتصالات، وهي يشماني المخدرات الامفوتريسين B، البنتاميدين وMiltefosine لفترات زمنية مختلفة تتراوح بين 24 و 96 ساعة. انقاذ التجربة على الطفيلي وقد تم فحص / التحول في ثلاث نسخ، ويجري التجربة المباشرة للخلايا العد الأسلوب في تكرار. ويبين الشكل 6 الصور المجهرية لعنصر التحكم غير مصاب، ومراقبة المصابين دون علاج الليشمانيا والإصابة، وتعامل THP1 الخلايا. تم إعداد منحنيات الاستجابة للجرعة من الفحص الطفيلي الإنقاذ والتحول (تركيز الدواء مقابل الطفيليات تحول) وفحص وتحليل الصور (عدد الخلايا amastigotes/100 THP1) (الأرقام 7-9). حسبت ال 50 IC من الأدوية من قبل ExcelFit وترد في الجدول 1. وأظهرت صورة الرقمية تحليل المباشر العد والفحص الطفيلي الإنقاذ فإن التحول الفحص على النتائج قابلة للمقارنة. كان رقمي تحليل الصورة المباشر العد الفحص الأمثل أقل خلال وقت مبكر من النقاط 24 و 48 ساعة ر المخدراتreatments، في حين أن الطفيلي الإنقاذ فإن التحول-أظهرت نتائج الفحص أكثر اتساقا مع القيم المبلغ عنها في جميع النقاط مرة خلال ساعة 24-96 بعد علاجات الدوائية. قد هذا الاختلاف في النتائج مع الصور الرقمية تحليل المباشر العد والفحص الطفيلي الإنقاذ فإن التحول يكون الفحص-بسبب وجود غير قابلة للحياة amastigotes خلال فترات مبكرة من العلاج من تعاطي المخدرات في الصورة الرقمية تحليل العد المباشر -الفحص.
الشكل 1. A مشاهدة المجهري للالدونوفانية الليشمانيا amastigotes الانقاذ والتحول إلى promastigotes. A - تمسكا THP1 الخلايا المصابة مع amastigotes الليشمانيا؛ B -، تمسكا المصابة THP1 الخلايا بعد تحلل C الخاضعة للرقابة - تحولت الليشمانيا الدونوفانية promastigotes من amastigotes انقاذ المصابين من THP1 D خلايا البلاعم - النمو وانتشار ترانsformed الليشمانيا الدونوفانية promastigotes.
الشكل 2. الأمثل للتحلل للرقابة من الخلايا المصابة THP1 لتحقيق الحد الأقصى من amastigotes الانقاذ الحية الدونوفانية الليشمانيا وتحولها إلى promastigotes. تحليل تحلل الخلايا من THP1 والإنقاذ من amastigotes من الخلايا المصابة THP1 الليشمانيا مع المنظفات المختلفة. تم اختبار اثنين تركيزات (0.05٪ و 0.1٪) من المنظفات وفترتين زمنيتين (30 ثانية وثانية 60) لتلقي العلاج. = وحدات مضان RFU النسبية. كل شريط يمثل متوسط الملاحظات المكررة. [A] NP-40 العلاج تسبب تحلل الخلايا من THP1 وأثرت أيضا على بقاء الطفيليات ليشمانة انقاذهم. [B] تريتون X-100 المعالجة:تسبب تحلل NT من THP1 الخلايا وأثرت أيضا على بقاء الطفيليات ليشمانة انقاذ [C] تسبب تحلل جزئي توين 80 من THP1 الخلايا لانقاذ amastigotes. [D] تسبب تحلل جزئي توين 80 من THP1 الخلايا لانقاذ amastigotes. [E تسبب] SDS العلاج تحلل شبه كامل من الخلايا وTHP1 لم يؤثر صلاحية amastigotes إنقاذهم في 0.05٪ / 30 ثانية. [F] المعاملة مع SDS 0.05٪ لمدة 20-30 ثانية تسبب تحلل شبه كامل من الخلايا THP1 وقابلة للحياة الطفيلي انقاذ amastigotes للتحول إلى promastigotes. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
الشكل 3. نيون الصور الرقمية من خلية مصابة THP1 متباينة في المختبر مع Leishmaniوالدونوفانية amastigotes. يمكن أيضا أن ينظر kDNA مميزة مع كل نواة الطفيلي. يمكن نواة البلاعم (MN) (1) ونواة الطفيلي (PN) (2) وضع علامة تفاضلي وتحسب بشكل مختلف من قبل برامج التحليل الكمي لتقييم يماغيج للعدوى. وقد تم تحديد مقدار وعدد الخلايا THP1 amastigotes/100.
الشكل 4. مقارنة بين صورة الرقمية تحليل الفحص المباشر العد والفرز (اللوحة السفلى) والطفيليات الإنقاذ فإن التحول-الفحص (اللوحة العليا). أسفرت نسبة الإصابة المشيقة من 1:10 الأمثل: والبلاعم. وأظهرت نتائج مماثلة على حد سواء. وأظهرت الفحص الطفيلي الإنقاذ بعض القيم الأساسية. كل العروض بار يعني من قيم مكررة.
الشكل 5 THP1 الخلايا المصابة مع promastigotes الليشمانيا من THP1 مختلفة: نسبة المشيقة. يتم عرض النتائج الكمية وعدد من amastigotes/100 THP1 الخلايا في الشكل 4.
الشكل 6. الصور الرقمية (نيون + DIC) من الخلايا المصابة مع THP1 الدونوفانية الليشمانيا amastigotes بعد العلاج مع العقاقير المضادة لليشماني القياسية لفترات زمنية مختلفة. وتم قياس كمية النتائج على النحو عدد الخلايا THP1 amastigotes/100 وتستخدم لحساب النمو في المئة مقارنة مع الضوابط غير المعالجة وتحديد القيم IC 50.
الشكل 7. مقارنة الصورة الرقمية تحليل المباشر العد والفحص الطفيلي الإنقاذ فإن التحول-الفحص للكشف عن العقاقير المضادة لليشماني (Amophotericin B). تم علاج المصابين الضامة مع تركيزات مختلفة من العقاقير المضادة لليشماني القياسية لفترات مختلفة. حسبت IC 50 (ميكروغرام / مل) القيم من جرعة منحنى استجابة Excelfit. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
الشكل 8. مقارنة الصورة الرقمية تحليل المباشر العد والفحص الطفيلي الإنقاذ فإن التحول عن الفحص،المعهد القومي للاتصالات، يشماني فحص المخدرات (البنتاميدين). تم علاج المصابين الضامة مع تركيزات مختلفة من العقاقير المضادة لليشماني القياسية لفترات مختلفة. حسبت IC 50 (ميكروغرام / مل) القيم من منحنيات الاستجابة للجرعة من Excelfit. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
الشكل 9. مقارنة الصورة الرقمية تحليل المباشر العد والفحص الطفيلي الإنقاذ فإن التحول-الفحص للكشف عن العقاقير المضادة لليشماني (Mitefosine). تم علاج المصابين الضامة مع تركيزات مختلفة من العقاقير المضادة لليشماني القياسية لفترات زمنية مختلفة. حسبت IC 50 (ميكروغرام / مل) القيم من منحنيات الاستجابة للجرعة من Excelfit.انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
| اختبار المخدرات | 24 ساعة على | 48 ساعة على | 72 ساعة على | 96 ساعة على | ||||
| حنان ب | ج PRTA | حنان ب | ج PRTA | حنان ب | ج PRTA | حنان ب | ج PRTA | |
| الأمفوتريسين B | 0.24 ± 0.03 | 0.17 ± 0.01 * | 0.12 ± 0.04 | 0.20 ± 0.07 | 0.06 ± 0.01 | 0.06 ± 0.01 | 0.11 ± 0.03 | 0.10 ± 0.03 |
| البنتاميدين | > 10 | 2.55 ± 1.16 * | وجمع 2،88usmn؛ 0،58 | 1.43 ± 0.91 | 1.24 ± 0.35 | 1،52 ± 0،16 | 0،71 ± 0،63 | 0،98 ± 0،33 |
| Miltefosine | 0.38 ± 0.02 | 0.19 ± 0.08 * | 0.24 ± 0.06 | 0.30 ± 0.08 | 0.36 ± 0.02 | 0.16 ± 0.06 | 0.21 ± 0.15 | 0.17 ± 0.10 |
الجدول 1. مقارنة الصورة الرقمية تحليل المباشر العد والفحص الطفيلي الإنقاذ فإن التحول-الفحص للكشف عن العقاقير المضادة لليشماني. تم علاج المصابين الضامة مع تركيزات مختلفة من العقاقير المضادة لليشماني القياسية لفترات مختلفة. حسبت IC 50 (ميكروغرام / مل) القيم من منحنيات الاستجابة للجرعة من Excelfit (أرقام 7-9) دواء آخر ساعات العلاج؛ العد ينال ب = تحليل الصورة ومباشرةمقايسة؛ ج = PRTA الطفيلي الإنقاذ والفحص التحول. القيم المعطاة هي IC 50 (تركيز الدواء يسبب تثبيط نمو 50٪ في الطفيلي) كما ميكروغرام / مل وهي يعني ± SD ما لا يقل عن ثلاث تجارب. * مختلفة إحصائيا (<0.05) مقارنة مع قيم 50 IC حنان.
Discussion
هناك العديد من الطرق المتاحة لفحص المخدرات المضادة لليشماني يعتمد على البلاعم، ليشمانة النماذج. ويمكن أن يتم المقايسات مع الضامة التي تم جمعها من الحيوانات المضيفة الخلايا الافرازات البريتوني وهي (PEC)، وخلايا الدم الطرفية الوحيدات (PBMC) 6 أو نخاع العظام المستمدة الضامة (BMM) أو في خطوط الخلايا الوحيدات مثل الماوس (J774 وRAW264.7 ) 7 والبشرية (THP1، U937، HL-60) 8 خلايا الوحيدات. يجب أن المقايسات، والتي تستخدم تقسيم الخلايا المضيفة، وضمان أن يتم النظر في الآثار التباس النشاط المخدرات على كل من الطفيليات والخلايا المضيفة عدد. الضامة متباينة الأولية التي تم جمعها من مصادر مختلفة مثل الفئران والجرذان هي غير الفاصل في الطبيعة، ولكن هذه الاستعدادات قد لا يكون خلية خلية متجانسة السكان. خطوط الخلايا خلايا الوحيدات المستمدة متجانسة في طبيعتها، والتي تعتبر أفضل نموذج للفحص ليشمانة البلاعم-مقرا لها. من مختلف خطوط الخلايا الوحيدات، diffeيمكن rentiated THP1 الخلايا (خلايا سرطان الدم الحاد الإنسان الوحيدات الخط) تشكيل أحادي الطبقة غير تقسيم ويقدم بديلا جذابا لالضامة معزولة الأولية.
ويمكن أن يتم فحص البلاعم ليشمانة-القائم في عدة طرق. التقييم المجهري الكلاسيكية يعتمد على خلية الطفيل العد المباشر و9 هو كثيفة العمالة. غياب الأتمتة يحد من فائدة هذا الفحص. عد الخلايا تستغرق وقتا طويلا، وربما إعطاء تقرير غير دقيق عن القيم 50 IC منذ تحديد الجدوى الطفيلي من خلال إجراء تلطيخ أمر صعب. يمكن استخدام العديد من الأصباغ الفلورية والاجسام المضادة للفحوصات تدفق cytometric 10 و 11، لكنها محدودة أيضا هذه المقايسات بسبب حساسية أقل والحد من الفترة الزمنية للعلاج المخدرات ليوم واحد فقط. هناك عدة فحوصات الجينات مراسل المتاحة لقياس نمو الخلايا amastigotes 12،13،14. والآليقد يكون من الممكن فحص إد باستخدام الجينات مراسل، ولكن هذه المقايسات أيضا بعض العوائق. أولا، معظم هذه المقايسات تتطلب انتقاء الأدوية للحفاظ على التعبير episomal من الجينات مراسل، والتي قد لا تكون مثالية لتجربة المخدرات الفرز. يمكن أن الطريقة التي يتم من خلالها عرض الجينات مراسل تؤثر أيضا على خصائص الفسيولوجية للطفيل ويكون لها تأثير على الفحص. إذا كان الجين هو مراسل جزء من البلازميد episomal، قد خرج النسبية لمراسل تعتمد على عدد نسخة من البلازميد بالنقل (والذي يختلف من خلية إلى أخرى) بدلا من التركيز على نشاط المخدرات 14. بعض الطفيليات التي تتحول مراسل الطفيليات لا تحتاج الضغط الانتقائي للحفاظ على الجينات مراسل، ولكن يمكن أن يكون هناك العواقب البيولوجية إما عن طريق تعطيل البنية الجينية أو فقط من خلال وجود البروتينات مراسل الأجنبية 15. في بعض المقايسات الجينات مراسل القائمة، وهناكالقضايا حساسية النشاط والخلفية 16. الأهم من ذلك، فإن العديد من المقايسات مراسل التعبير الجيني، وخاصة مع مراسل واحد GFP gene15، لا يفرق بين الخلايا وamastigotes الحية والميتة. قد يعتمد على الجينات المقايسات مراسل وسيفيراز التمييز بين الخلايا الحية والميتة amastigotes، ولكن الركيزة وتحلل الخلية العازلة لهذه القياسات ليست مكلفة على نطاق واسع الفحص 17. للتغلب على هذه العيوب والقيود المفروضة على فحوصات الفرز السابقة، البلاعم ليشمانة القائم، وقد وضعنا هذا الاختبار الأمثل والطفيليات الإنقاذ والتحول. ويستند هذا الفحص على THP1 الخلايا، التي لديها تجانس جيدة وغير قابلة للتقسيم في الطبيعة، والخلايا المضيفة.
الفحص الطفيلي الإنقاذ فإن التحول-الفحص الموصوفة هنا هو مقارنة لفحص يعتمد على الصورة الرقمية لتحليل العد المباشر للamastigotes داخل الخلايا. الفلورسنت وDIC المجهر، ايماج الرقميةوقد المكرر ه من التحليلات ليماغيج الفرق العد والفرز لنواة ونواة البلاعم الطفيلي مزيد من الفحص المجهري العد. التقاط الصور تحت ضوء الفلورسنت الفلاتر والفرق المقابل تدخل (DIC) مرشحات تحسنت جودة الصورة الرقمية للفرز أكثر دقة من الطفيليات داخل الخلايا. يمكن دمجها كل الصور الفلورسنت ومدينة دبي للإنترنت للحصول على الصور الرقمية مع الخطوط العريضة واضحة خلية البلاعم والخلايا نوى الفلورسنت. يمكن نواة البلاعم ونواة الطفيلي يعترف تفاضلي مع يماغيج. لذلك، على حد سواء الرقمية صورة التحليل المباشر العد والفحص الطفيلي الإنقاذ فإن التحول الفحص، لديها القدرة اللازمة لأتمتة والتطبيق على نطاق واسع الفرز. الخطوات الحاسمة في الطفيل الإنقاذ، فإن التحول الفحص هي: (أ) الغسيل المتكرر لمزارع الخلايا بعد التعرض لTHP1 promastigotes الليشمانيا، لضمان إزالة كاملة تقريبا من غير متدربalized promastigotes و (ب) تحلل الخلايا تسيطر THP1 المصابة مع SDS. ويجوز لكل من الخطوات أيضا يمكن السيطرة عليها مع الأتمتة ويجب أن لا حل وسط مع الإنتاجية للمقايسة. الخطوة الثانية من الغسيل، بعد التعرض للإصابة خلايا الليشمانيا THP1 للعقاقير اختبار / مركبات يزيل ما تبقى من غير المنضوية الطفيليات، إن وجدت. الطفيلي الإنقاذ فإن التحول-الفحص يوفر مزايا هامة على القائمة المجهرية جينات مراسل، والمقايسات تحليل الصور. الفحص بسيط وقوية، وقابلة للتكرار، ويمكن أن يكون آليا لفحص واسعة النطاق، وبالتالي ينبغي أن يكون التطبيق هاما في فحص المركبات مكتبات كبيرة لاكتشاف جديد للأدوية المضادة لليشماني. مزيد، ويمكن أيضا أن تطبق الفحص لتقييم العدوى السريرية، وكذلك، العزلات مختبر الليشمانيا في المختبر.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
الاتفاق العلمية نسنبر-USDA-ARS رقم 58-6408-2-0009؛ CDMRP منحة جائزة # W81XWH-09-2-0093 عن طريق البحث الطبي التابع للجيش الأميركي وقيادة العتاد.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) | Sigma-Aldrich USA | P1585 | Required for differentiation of THP1 cells. |
| RPMI-1640 Medium | Invitrogen | 23400021 | |
| Lab-TeK Chamber Slide System (16 Chamber) | Thermo Scientific Nunc | 178599 | |
| Clear, Flat-Bottom, 96-Well Plates | BD Falcon | 353075 | Plates to perform 96-well plate assay |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich USA | A4888 | Standard anti-leishmanial drug dissolve in DMSO (2 mg/ml) |
| Pentamidine Isothionate Salt | Sigma-Aldrich USA | P 0547 | Standard anti-leishmanial drug dissolve in DMSO (2 mg/ml) |
| Miltefosine | EMD Biosciences USA | 475841 | Standard anti-leishmanial drug dissolve in serum-free RPMI-1640 medium (prepare fresh) (2 mg/ml) |
| Sodium Stibogluconate | EMD Biosciences USA | 567565 | Standard anti-leishmanial drug prepare in RPMI-1640 with 4% FBS. (1 mg/ml) |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich USA | L 5750 | |
| Fluorescence Microscope | NIKON | ECLIPSE 90i | |
| Fluorescence Microplate Reader | BMG | Polar Star Galaxy | |
| Mounting Medium | Sigma-Aldrich USA | M 1289 | |
| alamarBlue | AbD Serotec | BUF012 B | |
| SYBR Green I | Sigma-Aldrich USA | S 9430 | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Sci. | 523500 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich USA | P2256 | |
| 2-Mercapt–thanol | Sigma-Aldrich USA | M6250 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11050H | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich USA | P9416 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich USA | P6474 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich USA | T8787 | |
| NP-40 | Calbiochem | 492016 |
References
- WHO. Control of the leishmaniasis: report of a meeting of the WHO Expert Committee on the Control of Leishmaniasis. Xii, Geneva. 22-26 (2010).
- Croft, S. L., Seifert, K., Yardley, V. Current scenario of drug development for leishmaniasis. Indian J. Med. Res. 123 (3), 399-410 (2006).
- Croft, S. L., Sundar, S., Fairlamb, A. H. Drug Resistance in Leishmaniasis. Clinical Microbiology reviews. 19 (1), 111-126 (2006).
- Mikus, J., Steverding, D. A simple colorimetric method to screen drug cytotoxicity against Leishmania using the dye AlamarBlue. Parasitology International. 48 (3), 265-269 (2000).
- Callahan, H. L., Portal, A. C., Devereaux, R., Grogl, M. An Axenic Amastigote System for Drug Screening. Antimicrob. Agents Chemother. 41 (4), 818-822 (1997).
- Seifert, K., Escobar, P., Croft, S. L. In vitro activity of anti-leishmanial drugs against Leishmania donovani is host cell dependent. J. Antimicrob. Chemother. 65 (3), 508-511 (2010).
- Kolodziej, H., Kiderlen, A. F. Antileishmanial activity and immune modulatory effects of tannins and related compounds on Leishmania parasitized RAW 264.7 cells. Phytochemistry. 66 (17), 2056-2071 (2005).
- Maia, C., et al. Infectivity of five different types of macrophages by Leishmania infantum. Acta Tropica. 103 (2), 150-155 (2007).
- Neal, R. A., Croft, S. L. An in vitro system for determining the activity of compounds against the intracellular amastigote form of Leishmania donovani. J. Antimicrob. Chemother. 14, 463-475 (1984).
- Abdullah, S. M., Flath, B., Presber, H. W. Comparison of different staining procedures for the flow cytometric analysis of U-937 cells infected with different Leishmania-species. J. Microbiol Methods. 37 (2), 123-138 (1999).
- Giorgio, C. D., et al. Flow Cytometric Detection of Leishmania Parasites in Human Monocyte-Derived Macrophages: Application to Antileishmanial-Drug Testing. Antimicrob Agents Chemother. 44 (11), 3074-3078 (2000).
- Mandal, S., et al. High throughput screening of Leishmania donovani clinical isolates against drug using a colorimetric β Lactamase assay. Indian J. Exp. Biol. 47 (6), 475-479 (2009).
- Chan, M. M. Y., Bulinski, J. C., Chang, K. P., Fong, D. A. Microplate assay for Leishmania amazonensis promastigotes expressing multimeric green fluorescent protein. Parasitol. Res. 89 (4), 266-271 (2003).
- Buckner, F. S., Wilson, A. J. Colorimetric assay for screening compounds against Leishmania Amastigote Grown in macrophages. Am. J. Trop. Med. 72 (5), 600-605 (2005).
- Sereno, D., et al. Advances and perspectives in Leishmania cell based drug-screening procedures. Parasitol. Int. 56 (1), 3-7 (2007).
- Gupta, S., Nishi, Visceral leishmaniasis: experimental models for drug discovery. Indian J. Med. Res. 133, 27-39 (2011).
- Roy, G., et al. Episomal and stable expression of the luciferase reporter gene for quantifying Leishmania spp. Infections in macrophages and in animal models. Mol. Biochem. Parasitol. 110 (2), 195-206 (2000).
