Summary
En parasit-rednings-og transformationsassay med THP1 inficerede celler
Abstract
Leishmaniasis er en af verdens mest oversete sygdomme, hovedsagelig rammer de fattigste af de fattige, især i udviklingslandene. Over 350 millioner mennesker er der risiko for at pådrage leishmaniasis, og cirka 2 millioner nye tilfælde forekommer hvert år 1. Leishmania donovani, er det kausative middel for visceral leishmaniasis (VL), den mest dødelige form af sygdommen. Valget af medicin til rådighed til behandling af leishmaniasis er begrænset 2; nuværende behandlinger giver begrænset effekt, og mange er giftige ved terapeutiske doser. Desuden har de fleste af den første linie behandling narkotika allerede mistet deres anvendelighed som følge af stigende blandingsmisbrug modstand 3. Den nuværende pipeline af anti-leishmanial stoffer, er også stærkt decimeret. Vedvarende indsats er nødvendig for at berige en ny anti-leishmanial lægemiddelforskning pipeline, og denne bestræbelse er afhængig af tilgængeligheden af egnede in vitro screening modeller.
In vitro promastigoter 4 og axeniske amastigotes assays 5 anvendes primært til anti-leishmanial lægemiddelscreening kan dog ikke være hensigtsmæssigt som følge af betydelige cellulære, fysiologiske, biokemiske og molekylære forskelle i forhold til intracellulære amastigotes. Assays med makrofag-amastigoter modeller anses tættest på de patofysiologiske betingelser for leishmaniasis, og er derfor bedst egnet til in vitro-screening. Differentierede, ikke-delende humane akutte monocytiske leukæmiceller (THP1) (gøre en attraktiv) alternativ til isolerede primære makrofager og kan anvendes til at analysere anti-leishmanial aktivitet af forskellige forbindelser over for intracellulære amastigoter.
Her præsenterer vi en parasit-rednings-og transformationsassay med differentierede THP1 celler inficeret in vitro med Leishmania donovani til screening rene forbindelser og naturlig proddukter ekstrakter og bestemme effekt mod de intracellulære Leishmania amastigotes. Assayet omfatter følgende trin: (1) differentiering af THP1-celler til ikke-delende makrofager, (2) infektion af makrofager med L. donovani metacyclic promastigoter, (3) behandling af inficerede celler med testlægemidlerne, (4) kontrolleret lysis af inficerede makrofager, (5) frigivelse / redning af amastigoter og (6) transformation af levende amastigoter til promastigoter. Assayet blev optimeret ved hjælp af detergent-behandling til kontrolleret lysis af Leishmania-inficerede THP1-celler for at opnå næsten fuldstændig redde levedygtige intracellulære amastigoter med minimal virkning på deres evne til at omdanne til promastigoter. Forskellige makrofag: promastigoter forhold blev testet for at opnå maksimal infektion. Kvantificering af infektionen blev udført ved transformation af levende, reddede Leishmania amastigoter til promastigoter og evaluering af deres vækst med en alamarBlue fluorometrisk assay i mikroplader med 96 brønde. Dette assay kan sammenlignes med den aktuelt anvendte mikroskopisk, transgene reportergen og digital-billedanalyse assays. Denne analyse er robust og måler kun de levende intracellulære amastigotes forhold til reportergen og billedanalyse assays, som måske ikke skelne mellem levende og døde amastigotes. Desuden er assayet blevet valideret med aktuel panel af anti-leishmanial lægemidler og er blevet anvendt til omfattende screening af rene forbindelser og et bibliotek af naturprodukter fraktioner (Tekwani et al. Upubliceret).
Protocol
1. Vedligehold og Subkultur THP1 Cell Culture
- Opretholde THP1-celler i RPMI-1640 medium (med 10% FBS og pH 7,4) ved 37 ° C i en 5% CO2-inkubator.
- Subkultur cellerne to gange om ugen for at forhindre celletallet fra over 1x10 6 celler / ml. Dette er vigtigt for at opretholde deres transformation evne.
2. Vedligehold og Subkultur Leishmania donovani promastigoter Culture
- Vedligehold L. donovani promastigoter (S1, Sudan stamme) i RPMI-1640-medium (uden natriumbicarbonat og natriumpyruvat) med 10% FBS ved 26 ° C.
- Subkultur L. donovani promastigoter to gange om ugen, med højeste celler koncentration i intervallet 20-25x10 6 promastigoter / ml.Caution: Alle medier og opløsninger skal bringes til stuetemperatur før brug.
3. Podning og differentiering af THP1-celler i en 96-godt Microplate og 16-kammer Glass Culture Slide.
- Fremstilling af en fortyndet THP1 kultur med celletal på 2.5x10 5 celler / ml fra en fire dage gammel cellekultur (celletal bør ikke overstige 10 6 celler / ml) i RPMI-1640 med 10% varmeinaktiveret FBS. Fremstilles 20 ml af kulturen for hver 96-brønds plade og 4 ml kultur for hver 16-brønds kammer slide.
- Tilføj phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) (for differentiering af THP1) til fortyndet cellekultur suspension (10 μl/20 ml kultur fra beholdningen af 50 ug / ml i DMSO) (final PMA koncentration i fortyndede celler kulturen bør være 25 ng / ml).
- At sammenligne Digital-Image-Analyse-Direct-Optælling-analysen og Parasite-Rescue-Transformation-Assay, opsætte assays samtidig i klare, fladbundede, 96-brønds plade og 16-kammer, glas, mikroskopisk kultur dias.
- Dispensér 200 pi THP1-PMA-behandlede celler til hver brønd eller kammer.
- Inkuber i 96-brønds psidste udkald og 16-brønds kammer objektglas i en 37 ° C, 5% CO2-inkubator natten over for at tillade næsten fuldstændig differentiering af cellerne.
Bemærk: THP1-celler, der normalt vokser i suspension, er differentieret i adhærente makrofager.
4. Infektion af den transformerede THP1 Celler med Leishmania donovani promastigoter
- Til infektion af differentieret THP1 cellekultur med Leishmania donovani promastigoter, bør størstedelen af parasitter være i den infektive metacyclic fase (lange cylindriske former, ~ 5-6 dage gammel kultur).
- En 1:10 THP1 celle til parasit-forholdet er optimal for infektionen i både den digitale-Image-Analyse-Direct-tælling-Assay og Promastigote-Rescue-Transformation-Assay.
- Forbered en fortyndet kultur af L. donovani promastigoter med en parasit optælling af 2.5x10 6 parasit / ml (for THP1-celler: parasitter forhold = 1:10) fraen 5-6 dage gammel kultur i RPMI-1640 medium med 2% FBS.
- Fra trin 3.5 (efter overnight differentiering af THP1 cellekultur) tages ud af pladerne og kammer slides, fjern medium og vask cellekulturerne en gang med serumfrit RPMI-1640 medium.
- Efter en grundig vask af PMA-behandlede THP1-celler med serumfrit, varm RPMI-1640 (~ 37 ° C) medium, udskiftes serumfrit medium med 200 gl af den fortyndede kultur af L. donovani promastigoter (2.5x10 6 parasitter / ml) fra trin 4.3. Opsæt kontrolbrøndene af THP1 celler uden parasitten og parasitter uden THP1 celler i hver plade og 16-godt kammer slides.
- Efter tilsætning af parasitten til THP1 cellekultur pladen og glider inkuber ved 37 ° C, 5% CO2 i 24 timer for at tillade parasitterne at inficere de differentierede THP1-celler.
5. Behandling af inficerede makrofager med testlægemidlerne / forbindelser
- TestAmphotericin B, pentamidin og miltefosin som standard anti-leishmanial lægemidler til screening. Fremstille stamopløsninger af lægemidler / testforbindelserne i vand eller DMSO som nævnt i reagens tabel. Test hver lægemiddelforbindelsen ved 6 koncentrationer.
- Serielt fortyndet (1:5) faste stoffer og testforbindelser i en frisk 96-brønds plade eller 2 ml rør (for kammerets objektglas) med RPMI-1640 medium med 2% FBS. De lægemidler / testforbindelsesopløsninger koncentrationer i denne plade er 2X af slutkoncentrationer.
- Vask dyrkningspladerne og kammer dias inficeret med L. donovani promastigoter (fra trin 4.5) i det mindste 5 gange med serumfrit, RPMI-1640 medium. Tilsæt 100 pi kulturmedium (RPMI-1640 med 2% FBS) i hver brønd / kammer. De mange vask er nødvendig for at sikre fuldstændig fjernelse af ikke-internaliserede promastigoter.
- Tilsæt 100 ul medium fra serielt-fortyndede standard anti-leishmanial narkotika eller testforbindelserne til hver brønd eller kammer. Opsætning af infektionted THP1 celler styrer uden stoffer samtidig i hver plade / kammer dias.
- Inkubér pladerne og kammer slides ved 37 ° C, 5% CO2 i 48 timer.
6. Chamber Slide Staining, fluorescerensmikroskop Imaging og billede analyse for Kvantificering af Infektion og Effekt af Narkotikabehandling
- Efter en 48 timers inkubering vaskes kammeret slide 3 gange med serumfrit RPMI-1640 medium. Peel off plastik kamre fra dias og fikseres cellerne ved at nedsænke dias i methanol i 30 sek. Lad objektglassene i bio-hætte under luftstrøm til tørring.
- Der fremstilles en SYBR Green I farvningsopløsning (5X) ved fortynding (1:2000) bestanden (10.000 X) med vand.
- Farv glassene under mørke betingelser med det fortyndede SYBR Green I plet opløsningen i 15 minutter ved stuetemperatur, vaskes en gang med vand og lad objektglassene i luftstrømmen til tørring.
- Placer et helt glas dækglas over staineret slide med hjælp fra montage medium.
- Indfange de digitale billeder af THP1-celler: uden infektion (blank), med infektion (kontrol), inficerede celler behandlet med forskellige faste stoffer eller testforbindelser i forskellige fortyndinger (figur 3, 5 og 6)) under anvendelse af et Nikon Eclipse 90i fluorescerende ledsaget mikroskop af NIS element AR 3,2 software.
- Tæl makrofag kerner (store) og parasitten kerner (små med kinetoplast) ved hjælp ImageJ (fig. 7), som er et offentligt-tilgængelige, Java-baseret billedbehandling program udviklet på National Institutes of Health ( http://rsb. info.nih.gov / ij / download.html ). Udtrykke dataene som antal amastigoter per 100 transformerede THP1-celler.
7. Parasitten-Rescue-Transformation-Assay: Kontrolleret lysis af L. donovani amastigoter-inficerede makrofager
- Vask mikroplade med 96 brønde fra trin 5,5 tre gange med serumfrit RPMI-1640 dyrkningsmedium.
- Blandt forskellige detergenter testet ved forskellige koncentrationer, 0,05% SDS-behandling i 30 sek er optimal for kontrolleret lysis (maksimal cellelyse med minimum tab af reddede parasitter levedygtighed).
- Fjerne serumfrit medium fra hver brønd efter den sidste vask, og der tilsættes 20 ul RPMI-1640 (med 0,05% SDS) til hver brønd. Ryste pladen i 30 sek, og der tilsættes 180 ul komplet RPMI-1640 (med 10% FBS) i hver brønd.
- Pladerne inkuberes ved 26 ° C i 48 timer til transformation af reddede amastigoter til promastigoter.
8. Kvantitativ analyse af transformerede Promastigote (alamarBlue assay)
- Efter en 48 timers inkubering ved 26 ° C, er alle de reddede levende amastigoter omdannet til promastigoter (figur 1D). Der tilsættes 10 ul alamarBlue i hver brønd af 96-brønds psidste udkald.
- Pladerne inkuberes ved 26 ° C natten over.
- Efter inkubation natten over, læse plader til standard fluorescens på en Fluostar Galaxy fluorimeter (BMG Lab Technologies) ved 544 nm excitation, 590 nm emission.
- Forberede dosisresponskurverne (procentuel vækst sammenstillet med koncentrationen af medikamentet eller testforbindelse) med ExcelFit (figur 7-9) og beregne IC50 / IC90 værdier fra disse kurver (tabel 1).
9. Standardisering af THP1 celler til Parasitter Ratio
- Standardisere de THP1-celler til parasitter forholdet for at bestemme assayets følsomhed. Bemærk: Lav / høj parasitter numre / infektion kan kompromis med følsomhed og selektivitet af screeningen.
- Standardisere de THP1 celler til parasitter forholdet ved at følge den ovenfor beskrevne protokol for THP1 celler såning og Leishmania promastigote infektion (afsnit 3 & 4) undtagen brug different forhold mellem THP1 celler til parasitter som 1:1,25, 1:2.5, 1:5 og 1:10.
- Opsætte eksperimentet både i 16-kammer slide (for billedanalyse) og 96-brønds plade (for parasit-redning assay) formater til sammenligning parasitten rednings-og billedanalyse assays.
10. Standardisering af forskellige detergenter til kontrolleret cellelyse
- Det primære formål med dette eksperiment er at optimere protokollen for kontrolleret lysis af THP1 cellerne for at opnå maksimal / komplet THP1 celler lysis uden væsentlig påvirkning af levedygtighed de reddede amastigote parasitter.
- Afprøve forskellige detergenter, såsom Tween 20, Tween 80, Triton X-100, NP-40 og SDS ved forskellige koncentrationer og forskellige varigheder af behandlingen (figur 2).
- THP1 celler til parasitter forholdet er 1:10 og andre betingelser er de samme som ovenstående afsnit 1-8.
- Test 0,05% SDS behandling yderligere for forskellig behandling tids til yderligere at optimere den styrede cellelysis.
Representative Results
En kvantitativ analyse blev udført for både digital-Image-Analyse-Direct-Optælling-analysen og Parasite-Rescue-Transformation-Assay for 24, 48, 72 og 96 timer efter medicinsk behandling
I den direkte tælling fremgangsmåde, infektion af L. donovani-inficerede makrofager (THP1-celler) blev beregnet ved følgende ligning:
De amastigoter (bestemt ved tælling amastigoter kerner) / 100 transformerede THP1-celler (bestemt ved tælling registreret ved THP1 cellekerner) (fig. 7) er et mere nøjagtigt mål at analysere virkningen af forskellige standard eller testforbindelser end procentdelen af inficerede THP1-celler , som rapporteret i nogle tidligere artikler, idet dette antal er direkte relateret til den samlede virkning af forbindelser, enten ved et faldi parasitter i makrofagceller eller fuldstændig fjernelse af parasitten fra makrofag cells.Infection blev beregnet ud fra digitale billeder af inficerede THP1-celler behandlet med forskellige faste stoffer ved forskellige fortyndinger til forskellige tidsintervaller (figur 10 og tabel 1). Den udlæsning for den digitale-Image-Analyse-Direct-Optælling-Assay blev amastigotes infection/100 transformeret THP1 celler, mens læse-out for parasitten-Rescue-Transformation-Assay var relativ fluorescens enheder (RFU), hvilket er direkte proportional med antallet af levende Leishmania amastigoter reddet fra de inficerede makrofager og forvandles til promastigoter. The alamarBlue assay anvendes rutinemæssigt til Leishmania promastigoter anti-leishmanial lægemiddelscreening.
Assayet var oprindeligt standardiseret og optimeret til kontrolleret lysis af Leishmania-inficerede THP1-celler. Formålet var at optimere betingelserne for detergent threeatment, hvilket giver næsten fuldstændig lysis af THP1-celler med minimal indvirkning på levedygtigheden af de reddede amastigoter. Figur 1 viser et mikroskopisk billede af den komplette assayprotokollen. Intakte THP1-celler inficeret med Leishmania amastigoter kan ses i figur 1A. Figur 1B viser lysering af THP1-celler efter detergentbehandling. Figur 1C viser reddet Leishmania amastigoter, der er blevet delvis omdannet til promastigoter og Figur 1D viser næsten fuldstændig omdannelse af amastigoter i promastigoter og deres efterfølgende spredning. Væksten af disse transformerede promastigoter kan kvantitativt monitoreres ved tilsætning af alamarBlue og måling af fluorescens på en mikropladelæser. Behandling med NP-40 (figur 2A) og Triton X-100 (figur 2B) lyserede inficerede THP1-celler, men det har også indflydelse på levedygtighed ogtransformation af de reddede amastigotes. Behandling med Tween 20 (fig. 2C) og Tween 80 (figur 2D) forårsagede ikke optimal lysis af THP1-celler resulterer i en ufuldstændig redning af amastigoter som indikeret ved et lavt antal transformerede promastigoter. Behandling med 0,05% SDS i 30 sek (Figur 2E) gav næsten fuldstændig lysis af Leishmania-inficerede THP1 celler og påvirkede ikke levedygtighed og transformation af reddede amastigotes. Yderligere optimering viste, at behandling af celler med 0,05% SDS i 20-30 sek gav højeste redde levedygtige Leishmania amastigoter (figur 2F). I efterfølgende eksperimenter, sec behandling med 0,05% SDS i 30 blev anvendt. Procedure for SDS-behandling er den samme for en eller flere plader. I flere plader, blev SDS-behandling gennemføres kolonne for kolonne med en multikanalpipette. Serumfrit medium blev fjernet fra alle otte brønde i en kolonne af pladen og 20 og mu; Liter 0,05% SDS blev tilsat i 8 brønde i den samme kolonne og fortyndes efter 30 sek med RPMI-1640 med 10% FBS. Under den indledende standardisering af assayet blev pladerne kontrolleret under mikroskop for ikke-internaliserede promastigoter. Mindst fem vaskninger var nødvendige til fjernelse af parasitter før trin 5 i behandling af inficerede makrofag celler med faste forbindelser og tre vaskninger var nødvendige før trin 7 i SDS-behandling. Således blev cellerne vasket 8 gange og ingen synlige ikke-internaliserede promastigoter forblev inden kontrol lysis af inficerede THP1-celler.
Digital Image Analysis og direkte tælling
De digitale billeder af Leishmania-inficerede THP1 celler blev fanget på Nikon Eclipse 90i fluorescerende mikroskop efter farvning med SYBR Green I. Både makrofag kerner og intracellulær Leishmania kerner med karakteristisk kinetoplast DNA blev observeret under de fluorescerende filtre (figur 3). Desuden blev billeder af inficerede THP1-celler også optages under DIC. Når begge billeder blev slået sammen, blev omridset af THP1-celler med intracellulære amastigoter ses tydeligere (figur 4). The ImageJ software blev anvendt til analyse af disse billeder. ImageJ er et offentligt domæne, Java-baseret, billed-behandling program udviklet på National Institutes of Health ( http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html ). ImageJ er designet med en åben arkitektur, der giver udvidelsesmuligheder via Java plugins og brændbare makroer. Brugerdefineret erhvervelse, analyse og behandling plugins kan udvikles ved hjælp ImageJ indbyggede editor og en Java compiler. For differentieret tælling af THP1 celler kerner og parasit kerner af ImageJ, er billedet åbnet i ImageJ. Celletæller blev fundet i Analyser mulighed i plugin af Softwaren. Billedet blev initialiseret og celletalsmåleren type 1 blev udvalgt til THP1 cell kerner og celletæller type 2 blev udvalgt til parasit kerner (figur 3). Differential tælling blev udført i mindst 200 THP1 cellekerner og de intracellulære amastigoter stede i disse THP1 cellekerner. En sammenligning af parasit-rednings assay og billedanalyse metoden blev foretaget til evaluering af infektiviteten af THP1-celler med forskellige makrofag:. Promastigoter forhold (figur 4) Figur 5 repræsenterer forskellen infektivitet i THP1-celler ved forskellige makrofag: promastigote forhold. Begge metoder viste sammenlignelige resultater og makrofag: promastigote forhold på 1:10 gav optimal og reproducerbar infektivitet.
Når betingelserne for parasite-rescue/transformation assay og det digitale billedanalyse blev optimeret, blev anvendeligheden af disse assays evalueret for anti-leishmanial lægemiddelscreening. De Leishmania-inficerede THP1-celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af standard aNTI-leishmanial lægemidler nemlig Amphotericin B, pentamidin og miltefosin for forskellige tidsintervaller spænder fra 24 til 96 timer. Eksperimentet for parasit reddet / transformation assay blev udført in triplo og forsøget for direkte celler optælling fremgangsmåde blev udført in duplo. Figur 6 viser mikroskopiske billeder af kontrollen uinficerede, kontrol-inficerede ubehandlede og Leishmania-inficerede, behandlede THP1-celler. Dosisresponskurverne blev fremstillet ud fra parasitten-redning og transformationsassay (koncentration af lægemidlet vs transformerede parasitter) og billedanalyse assay (antal amastigotes/100 THP1-celler) (figur 7-9). IC50 af de lægemidler blev beregnet ved ExcelFit og er vist i tabel 1.. Digital-Image-Analyse-Direct-Optælling-analysen og Parasite-Rescue-Transformation-assay viste sammenlignelige resultater. Digital-Image-Analyse-Direct-Optælling-Assay var mindre optimal i de tidlige tidspunkter af 24 og 48 timer lægemiddel treatments, mens Parasite-Rescue-Transformation-assay viste resultater mere i overensstemmelse med de indberettede værdier på alle de tidspunkter i løbet af 24-96 timer efter medicinsk behandling. Denne forskel i resultaterne med Digital-Image-Analyse-Direct-Optælling-analysen og Parasite-Rescue-Transformation-Assay kan skyldes tilstedeværelsen af ikke-levedygtige amastigotes i de tidlige perioder med narkotikabehandling i digital-Image-Analyse-Direct-Counting -assay.
Figur 1. En mikroskopisk billede af Leishmania donovani amastigoter rednings-og transformation til promastigoter. A - Adhærente THP1-celler inficeret med Leishmania amastigoter, B - Adhærente, inficerede THP1-celler efter kontrolleret lysis C - Transformerede Leishmania donovani promastigoter fra amastigoter reddet fra inficerede THP1 makrofag celler D - vækst og proliferation af transformed Leishmania donovani promastigoter.
Figur 2. Optimering af kontrolleret lysis af inficerede THP1 celler for at opnå maksimal redning af levende Leishmania donovani amastigotes og deres omdannelse til promastigoter. Analyse af lyse af THP1 celler og redning af amastigotes fra Leishmania-inficerede THP1 celler med forskellige rengøringsmidler. To koncentrationer (0,05% og 0,1%) af detergent og to tidsperioder (30 sek og 60 sek) for behandling blev testet. RFU = Relativ fluorescensenheder. Hver søjle repræsenterer middelværdien af dobbeltbestemmelser observationer. [A] NP-40 behandling forårsagede lysering af THP1-celler og også påvirkede levedygtigheden af de reddede amastigote parasitter. [B] Triton X-100 treatment forårsagede lysering af THP1-celler og også påvirkede levedygtigheden af de reddede amastigote parasitter [C] Tween 80 forårsagede delvis lysis af THP1-celler for at redde amastigoter. [D] Tween 80 forårsagede delvis lysis af THP1-celler for at redde amastigoter. [E ] SDS-behandling forårsagede næsten fuldstændig lysis af THP1-celler og ikke påvirkede levedygtigheden for de reddede amastigoter ved 0,05% / 30 sek. [F] Behandling med 0,05% SDS i 20-30 sek forårsagede næsten fuldstændig lysis af THP1-celler og reddede levedygtige parasit amastigotes at omdanne promastigoter. Klik her for at se større figur .
Figur 3. Fluorescerende digitalt billede af et differentieret THP1 celle inficeret in vitro med Leishmanien donovani amastigotes. Den karakteristiske kDNA kan også ses med hver parasit kerne. The makrofag nucleus (mN) (1) og parasitten kerner (PN) (2) kan være differentielt mærket og differentielt talt ved ImageJ analyse software til kvantitativ evaluering af infektionen. Kvantificeringen blev udført som antallet af amastigotes/100 THP1 celler.
Figur 4. Sammenligning mellem Digital-Image-Analyse-Direct-Optælling-Assay (nederste panel) og Parasite-Rescue-Transformation-Assay (øverste panel). Makrofagen: promastigote forhold på 1:10 gav optimal infektion. Begge viste sammenlignelige resultater. Parasitten-redning assay viste nogle baggrundsværdierne. Hver søjle viser gennemsnit af dublerede værdier.
Figur 5 THP1-celler inficeret med Leishmania promastigoter af forskellige THP1:. Promastigote forhold. De kvantitative resultater udtrykt som antal amastigotes/100 THP1-celler er vist i figur 4.
Figur 6. Digitale billeder (Fluorescent + DIC) af THP1 celler inficeret med Leishmania donovani amastigoter efter behandling med standard anti-leishmanial lægemidler til forskellige tidsperioder. Resultater blev kvantificeret som antallet af amastigotes/100 THP1-celler og anvendt til at beregne procent vækst sammenlignet med ubehandlede kontroller og bestemme IC50-værdierne.
Figur 7. Sammenligning af digital-Image-Analyse-Direct-Optælling-analysen og Parasite-Rescue-Transformation-analyse for anti-leishmanial lægemiddel screening (Amophotericin B). De inficerede makrofager blev behandlet med forskellige koncentrationer af standard anti-leishmanial lægemiddel for forskellige perioder. IC50 (ug / ml) værdier blev beregnet ud fra dosisresponskurven af Excelfit. se større tal .
Figur 8. Sammenligning af digital-Image-Analyse-Direct-Optælling-analysen og Parasite-Rescue-Transformation-analyse for enNTI-leishmanial lægemiddelscreening (Pentamidin). De inficerede makrofager blev behandlet med forskellige koncentrationer af standard anti-leishmanial lægemiddel for forskellige perioder. IC 50 (mg / ml) værdier blev beregnet ud fra de dosisresponskurver ved Excelfit. Klik her for at se større figur .
Figur 9. Sammenligning af digital-Image-Analyse-Direct-tælling-analysen og Parasite-Rescue-Transformation-analyse for anti-leishmanial lægemiddel screening (Mitefosine). De inficerede makrofager blev behandlet med forskellige koncentrationer af standard anti-leishmanial lægemiddel for forskellige tidsrum. IC50 (ug / ml) værdier blev beregnet fra dosisresponskurver ved Excelfit.Klik her for at se større figur .
| Testlægemiddel | 24 hr a | 48 timer a | 72 timer a | 96 timer a | ||||
| IACA b | PRTA c | IACA b | PRTA c | IACA b | PRTA c | IACA b | PRTA c | |
| Amphotericin B | 0,24 ± 0,03 | 0,17 ± 0,01 * | 0,12 ± 0,04 | 0,20 ± 0,07 | 0,06 ± 0,01 | 0,06 ± 0,01 | 0,11 ± 0,03 | 0,10 ± 0,03 |
| Pentamidin | > 10 | 2,55 ± 1,16 * | 2,88 & plusmn; 0,58 | 1,43 ± 0,91 | 1,24 ± 0,35 | 1,52 ± 0,16 | 0,71 ± 0,63 | 0,98 ± 0,33 |
| Miltefosin | 0,38 ± 0,02 | 0,19 ± 0,08 * | 0,24 ± 0,06 | 0,30 ± 0,08 | 0,36 ± 0,02 | 0,16 ± 0,06 | 0,21 ± 0,15 | 0,17 ± 0,10 |
Tabel 1. Sammenligning af digital-Image-Analyse-Direct-Optælling-analysen og Parasite-Rescue-Transformation-analyse for anti-leishmanial lægemiddel screening. De inficerede makrofager blev behandlet med forskellige koncentrationer af standard anti-leishmanial lægemiddel for forskellige perioder. IC50 (ug / ml) værdier blev beregnet fra dosisresponskurver ved Excelfit (figur 7-9) a timer efter lægemiddelbehandling. B IACA = Billedanalyse og direkte tællingAssay c PRTA = Parasite-Rescue og Transformation Assay. Værdierne er IC50 (koncentration af lægemidlet forårsager 50% inhibering i parasittens vækst) som pg / ml og er den gennemsnitlige ± standardafvigelse af mindst tre forsøg. * Statistisk forskellig (<0,05) sammenlignet med IC50-værdier med IACA.
Discussion
Der er flere metoder til rådighed for anti-leishmanial lægemiddelscreening baseret på makrofag-amastigote modeller. Assays kan udføres med makrofagerne indsamlet fra værtsdyr nemlig peritoneale eksudatceller (PEC), perifert blod monocyt-celler (PBMC) 6 eller knoglemarv-afledte makrofager (BMM) eller i monocytiske cellelinjer, såsom mus (J774 og RAW264.7 ) 7 og human (THP1, U937, HL-60) 8 monocytiske celler. Analyserne, der anvender dividere værtsceller, skal sikre, at forstyrrende virkninger af narkotika aktivitet på både parasit og vært celler nummer betragtes. De differentierede primære makrofager indsamlet fra forskellige kilder, såsom mus og rotter er ikke-delende i naturen, men disse cellepræparater måske ikke homogene cellepopulationer. Monocytiske celler-afledte cellelinier er homogene i natur og er en bedre model for makrofag-amastigote-baseret screening. Af forskellige monocytiske cellelinier, forskelrentiated THP1-celler (human akut monocytisk leukæmi cellelinje) kan danne en ikke-delende monolag og tilbyde et attraktivt alternativ til primære isolerede makrofager.
Den makrofag-amastigote-baseret screening kan gøres på flere måder. Klassisk mikroskopisk evaluering baseret på direkte celle og parasit tælle 9 er arbejdskrævende. Fraværet af automatisering begrænser anvendeligheden af dette assay. Tælling er tidskrævende og kan give unøjagtige bestemmelse af IC50-værdier, da bestemmelse af parasit levedygtighed gennem en farvningsprocedure er vanskelig. Mange fluorescerende farvestoffer og monoklonale antistoffer kan anvendes til flow-cytometriske assays 10, 11, men disse assays er også begrænset på grund af mindre følsomhed og begrænsning af tidsinterval af lægemiddel-behandling til kun én dag. Der er flere reportergenassays rådighed til at kvantificere væksten af intracellulære amastigoter 12,13,14. En automated screening kan være muligt ved hjælp af reportergener, men disse assays også visse ulemper. Dels fleste af disse assays kræver lægemiddelselektion til bevarelse episomal ekspression af reportergener, som ikke kan være ideelle til en lægemiddelscreening eksperiment. Den måde, hvorved reporter-gen indføres også kan påvirke de fysiologiske egenskaber af parasitten og påvirke screeningen. Hvis reportergenet er den del af et episomalt plasmid, kan den relative produktion af reporter afhænger af kopiantallet af det transficerede plasmid (som varierer fra celle til celle) end på aktiviteten af lægemidlet 14. Nogle reporter parasitter, der omdannes parasitter behøver ikke selektivt tryk for at bevare reportergenet, men kan der være biologiske konsekvenser enten ved at forstyrre den genomiske struktur eller blot ved tilstedeværelsen af de fremmede reporter-proteiner 15. I nogle reportergen-assays, er derspørgsmål om følsomhed og baggrund aktivitet 16. Vigtigst af alt kan mange af de reportergenekspression assays, specielt den ene med GFP reporter gene15, ikke skelne mellem de levende og døde intracellulære amastigotes. Assays baseret på luciferase-reportergen kan skelne mellem levende og døde intracellulære amastigoter, men substrat og cellelyse-puffer for disse assays er dyre til omfattende screening 17. For at overvinde disse skadevirkningen og begrænsninger af tidligere makrofag-amastigote-baserede screeningsassays, har vi udviklet og optimeret denne parasit-rednings-og transformationsassay. Dette assay er baseret på THP1-celler, som har en god homogenitet og er ikke-delende i naturen, som værtsceller.
Parasitten-Rescue-Transformation-Assay assay beskrevet her er sammenlignelig med assay baseret på digital-Image-Analyse-Direct-Optælling af de intracellulære amastigotes. Fluorescerende og DIC mikroskopi, digital image analyser ved ImageJ for differentieret optælling af makrofagen kerner og parasitten kerner har yderligere forfinet mikroskopisk tælling assay. Indfange billeder under fluorescerende lys filtre og differential interferens kontrast (DIC) filtre har forbedret kvaliteten af det digitale billede for mere nøjagtig optælling af de intracellulære parasitter. Både fluorescerende og DIC billeder kan flettes for at opnå de digitale billeder med klare makrofagcellelinier konturer og fluorescerende intracellulær kerner. Makrofagen kerner og parasitten kerner kan differentielt genkendes med ImageJ. Derfor er både digital-Image-Analyse-Direct-Optælling-analysen og Parasite-Rescue-Transformation-Assay har potentiale for automatisering og anvendelse i stor målestok screening. De kritiske trin i Parasite-Rescue-transformation-assay, er: (a) gentagne vaskninger af THP1 cellekulturer efter udsættelse for Leishmania promastigoter, for at sikre næsten fuldstændig fjernelse af ikke-praktikantenalized promastigoter og (b) kontrolleret lysis af inficerede THP1-celler med SDS. Begge trinnene kan også styres med automatisering og bør ikke på kompromis med gennemløb af assayet. Det andet trin af skyllevand efter eksponering af Leishmania-inficerede THP1-celler til testlægemidlerne / forbindelser fjerner de resterende ikke-internaliserede parasitter, hvis nogen. Parasitten-Rescue-Transformation-Assay byder på betydelige fordele i forhold til eksisterende mikroskopisk, reportergen og billedanalyse assays. Analysen er enkel, robust og reproducerbar, kan automatiseres for storstilet screening og derfor bør have vigtig anvendelse i screening af store forbindelser biblioteker til nye anti-leishmanial lægemiddelforskning. Endvidere kan assayet også anvendes til evaluering af infektiviteten af klinisk, samt, laboratorie-isolater af Leishmania in vitro.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Den NCNPR-USDA-ARS Scientific aftale No 58-6408-2-0009, CDMRP tilskud Award # W81XWH-09-2-0093 af US Army Medical forskning og Materiel Kommando.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) | Sigma-Aldrich USA | P1585 | Required for differentiation of THP1 cells. |
| RPMI-1640 Medium | Invitrogen | 23400021 | |
| Lab-TeK Chamber Slide System (16 Chamber) | Thermo Scientific Nunc | 178599 | |
| Clear, Flat-Bottom, 96-Well Plates | BD Falcon | 353075 | Plates to perform 96-well plate assay |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich USA | A4888 | Standard anti-leishmanial drug dissolve in DMSO (2 mg/ml) |
| Pentamidine Isothionate Salt | Sigma-Aldrich USA | P 0547 | Standard anti-leishmanial drug dissolve in DMSO (2 mg/ml) |
| Miltefosine | EMD Biosciences USA | 475841 | Standard anti-leishmanial drug dissolve in serum-free RPMI-1640 medium (prepare fresh) (2 mg/ml) |
| Sodium Stibogluconate | EMD Biosciences USA | 567565 | Standard anti-leishmanial drug prepare in RPMI-1640 with 4% FBS. (1 mg/ml) |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich USA | L 5750 | |
| Fluorescence Microscope | NIKON | ECLIPSE 90i | |
| Fluorescence Microplate Reader | BMG | Polar Star Galaxy | |
| Mounting Medium | Sigma-Aldrich USA | M 1289 | |
| alamarBlue | AbD Serotec | BUF012 B | |
| SYBR Green I | Sigma-Aldrich USA | S 9430 | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Sci. | 523500 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich USA | P2256 | |
| 2-Mercapt–thanol | Sigma-Aldrich USA | M6250 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11050H | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich USA | P9416 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich USA | P6474 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich USA | T8787 | |
| NP-40 | Calbiochem | 492016 |
References
- WHO. Control of the leishmaniasis: report of a meeting of the WHO Expert Committee on the Control of Leishmaniasis. Xii, Geneva. 22-26 (2010).
- Croft, S. L., Seifert, K., Yardley, V. Current scenario of drug development for leishmaniasis. Indian J. Med. Res. 123 (3), 399-410 (2006).
- Croft, S. L., Sundar, S., Fairlamb, A. H. Drug Resistance in Leishmaniasis. Clinical Microbiology reviews. 19 (1), 111-126 (2006).
- Mikus, J., Steverding, D. A simple colorimetric method to screen drug cytotoxicity against Leishmania using the dye AlamarBlue. Parasitology International. 48 (3), 265-269 (2000).
- Callahan, H. L., Portal, A. C., Devereaux, R., Grogl, M. An Axenic Amastigote System for Drug Screening. Antimicrob. Agents Chemother. 41 (4), 818-822 (1997).
- Seifert, K., Escobar, P., Croft, S. L. In vitro activity of anti-leishmanial drugs against Leishmania donovani is host cell dependent. J. Antimicrob. Chemother. 65 (3), 508-511 (2010).
- Kolodziej, H., Kiderlen, A. F. Antileishmanial activity and immune modulatory effects of tannins and related compounds on Leishmania parasitized RAW 264.7 cells. Phytochemistry. 66 (17), 2056-2071 (2005).
- Maia, C., et al. Infectivity of five different types of macrophages by Leishmania infantum. Acta Tropica. 103 (2), 150-155 (2007).
- Neal, R. A., Croft, S. L. An in vitro system for determining the activity of compounds against the intracellular amastigote form of Leishmania donovani. J. Antimicrob. Chemother. 14, 463-475 (1984).
- Abdullah, S. M., Flath, B., Presber, H. W. Comparison of different staining procedures for the flow cytometric analysis of U-937 cells infected with different Leishmania-species. J. Microbiol Methods. 37 (2), 123-138 (1999).
- Giorgio, C. D., et al. Flow Cytometric Detection of Leishmania Parasites in Human Monocyte-Derived Macrophages: Application to Antileishmanial-Drug Testing. Antimicrob Agents Chemother. 44 (11), 3074-3078 (2000).
- Mandal, S., et al. High throughput screening of Leishmania donovani clinical isolates against drug using a colorimetric β Lactamase assay. Indian J. Exp. Biol. 47 (6), 475-479 (2009).
- Chan, M. M. Y., Bulinski, J. C., Chang, K. P., Fong, D. A. Microplate assay for Leishmania amazonensis promastigotes expressing multimeric green fluorescent protein. Parasitol. Res. 89 (4), 266-271 (2003).
- Buckner, F. S., Wilson, A. J. Colorimetric assay for screening compounds against Leishmania Amastigote Grown in macrophages. Am. J. Trop. Med. 72 (5), 600-605 (2005).
- Sereno, D., et al. Advances and perspectives in Leishmania cell based drug-screening procedures. Parasitol. Int. 56 (1), 3-7 (2007).
- Gupta, S., Nishi, Visceral leishmaniasis: experimental models for drug discovery. Indian J. Med. Res. 133, 27-39 (2011).
- Roy, G., et al. Episomal and stable expression of the luciferase reporter gene for quantifying Leishmania spp. Infections in macrophages and in animal models. Mol. Biochem. Parasitol. 110 (2), 195-206 (2000).
