Summary
En parasitt-redning og transformasjon analysen med THP1 celler infisert
Abstract
Leishmaniasis er en av verdens mest forsømte sykdommer, hovedsakelig påvirker de fattigste av de fattige, hovedsakelig i utviklingsland. Over 350 millioner mennesker regnes i fare for å pådra leishmaniasis, og ca 2 millioner nye tilfeller forekommer årlig en. Leishmania donovani er den utløsende agent for visceral leishmaniasis (VL), den mest dødelige formen av sykdommen. Valget av stoffer tilgjengelig for å behandle leishmaniasis er begrenset 2; nåværende behandlinger gir begrenset effekt og mange er giftige ved terapeutiske doser. I tillegg har de fleste av de første linje behandling narkotika allerede mistet deres nytte på grunn av økende multippel legemiddelresistens 3. Den nåværende portefølje av anti-leishmanial legemidler er også sterkt redusert. Vedvarende innsats for å berike en ny anti-leishmanial medisiner rørledning, og dette arbeidet er avhengig av tilgjengeligheten av egnede in vitro screening modeller.
In vitro promastigotes 4 og axenic amastigotes analyser 5 er primært brukes til anti-leishmanial narkotika screening imidlertid ikke kan være hensiktsmessig på grunn av betydelige mobilnettet, fysiologiske, biokjemiske og molekylære forskjeller i forhold til intracellulære amastigotes. Analyser med makrofag-amastigotes modeller anses nærmest de patofysiologiske betingelser for leishmaniasis, og er derfor den mest hensiktsmessige for in vitro screening. Differensierte, ikke-delende humane akutte monocyttisk leukemi celler (THP1) (gjøre en attraktiv) alternativ til isolerte primære makrofager og kan brukes for analysering anti-leishmanial aktivitet av forskjellige forbindelser mot intracellulære amastigotes.
Her presenterer vi en parasitt-redning og transformasjon analysen med differensierte THP1 celler infisert in vitro med Leishmania donovani for screening rene forbindelser og naturlig proddukter ekstrakter og bestemme effekten mot intracellulære Leishmania amastigotes. Analysen omfatter følgende trinn: (1) differensiering av THP1 celler til ikke-delende makrofager, (2) infeksjon av makrofager med L. donovani metacyclic promastigotes, (3) behandling av infiserte celler med test narkotika, (4) kontrollert lysis av infiserte makrofager, (5) release / redning av amastigotes og (6) transformasjon av levende amastigotes til promastigotes. Analysen ble optimalisert med vaskemiddel behandling for kontrollert lysis av Leishmania-infiserte THP1 celler for å oppnå tilnærmet komplett redning av levedyktige intracellulære amastigotes med minimal effekt på deres evne til å transformere til promastigotes. Forskjellig macrophage: promastigotes forholdstall ble testet for å oppnå maksimal infeksjon. Kvantifisering av infeksjon ble utført gjennom transformasjon av levende, amastigotes reddet Leishmania til promastigotes og evaluering av deres vekst av en alamarBlue fluorometrisk analyse i 96-brønners mikroplater. Denne analysen kan sammenlignes med det for tiden brukes mikroskopiske, transgen reporter gen og digital-bildeanalyse analyser. Denne analysen er robust og måler bare live intracellulære amastigotes sammenlignet med reporter gen og bildeanalyse analyser, som kanskje ikke skille mellom levende og døde amastigotes. I tillegg har analysen blitt validert med en gjeldende panel av anti-leishmanial narkotika og har blitt brukt i stor skala screening av rene forbindelser og et bibliotek av naturlige produkter fraksjoner (Tekwani et al. Upublisert).
Protocol
1. Vedlikeholde og Subculture THP1 Cell Culture
- Oppretthold THP1 celler i RPMI-1640-medium (med 10% FBS og pH 7,4) ved 37 ° C i en 5% CO 2 inkubator.
- Subkulturen celler to ganger i uken for å hindre celletall overstiger 1x10 6 celler / ml. Dette er viktig for å opprettholde sin transformasjon evne.
2. Vedlikeholde og Subculture Leishmania donovani promastigotes Kultur
- Opprettholde L. donovani promastigotes (S1, Sudan stamme) i RPMI-1640 medium (uten natriumbikarbonat og Sodium Pyruvat) med 10% FBS ved 26 ° C.
- Subkultur L. donovani promastigotes to ganger i uken, med høyest celler konsentrasjon i området 20-25x10 6 promastigotes / ml.Caution: Alle media og løsninger bør bringes til romtemperatur før bruk.
3. Såing og differensiering av THP1 celler i en 96-vel Microplate og 16-kammer Glass Kultur Slide.
- Utarbeide en utvannet THP1 kultur med celletall av 2.5x10 5 celler / ml fra en fire dager gamle cellekultur (celletall bør ikke overstige 10 6 celler / ml) i RPMI-1640 med 10% varme-inaktivert FBS. Forberedt 20 ml kultur for hver 96-brønns plate og 4 ml kultur for hver 16-brønn kammer lysbilde.
- Legg forbol 12-myristat 13-acetat (PMA) (for differensiering av THP1) til fortynnet cellekultur suspensjon (10 μl/20 ml kultur fra lager av 50 ug / ml i DMSO) (endelig konsentrasjon PMA i fortynnet celler kulturen skal være 25 ng / ml).
- Å sammenligne Digital-Image-Analyse-Direct-Counting-Assay og Parasite-Rescue-Transformation-analyse, sette opp analysene samtidig i klar, flat bunn, 96-brønners plate og 16-kammer, glass, mikroskopisk kultur lysbilde.
- Dispenser 200 ul THP1-PMA-behandlede celler til hver brønn eller kammer.
- Inkuber 96-brønn PSENESTESVA og 16-brønners kammer lysbilder i et 37 ° C, 5% CO 2 inkubator over natten for å tillate nesten fullstendig differensiering av cellene.
Merk: THP1 celler, som normalt vokser i suspensjon, er differensiert i tilhenger makrofager.
4. Infeksjon i Transformerte THP1 Celler med Leishmania donovani promastigotes
- For infeksjon av differensiert THP1 cellekultur med Leishmania donovani promastigotes, bør flertallet av parasitter være i infeksiøs metacyclic scenen (lange sylindriske former, ~ 5-6 dag gamle kultur).
- En 01:10 THP1 celle til parasitt forholdet er optimalt for infeksjon i både Digital-Image-Analyse-Direct-Counting-Assay og Promastigote-Rescue-Transformation-analysen.
- Forbered en utvannet kultur L. donovani promastigotes med en parasitt telling av 2.5x10 6 parasitt / ml (for THP1 celler: parasitter ratio = 01:10) fraen 5 til 6-dagers gammel kultur i RPMI-1640 medium med 2% FBS.
- Fra trinnet 3,5 (etter overnatter differensiering av THP1 cellekultur) ta ut platene og kammeret lysbilder, fjern mediet og vask cellekulturer gang med serumfritt RPMI-1640-medium.
- Etter nøye vasking av PMA-behandlede THP1 celler med serumfritt, varm RPMI-1640 (~ 37 ° C) medium, erstatte serumfritt medium med 200 pl av den fortynnede kultur av L. donovani promastigotes (2.5x10 6 parasitter / ml) fra trinn 4.3. Sett opp kontroll brønner THP1 celler uten parasitten og parasitter uten THP1 celler i hver plate og 16-brønners kammer lysbilder.
- Etter tilsetning til den parasitt THP1 cellekultur, inkuber platen og lysbilder ved 37 ° C, 5% CO 2 i 24 timer for å tillate parasittene å infisere de differensierte THP1 celler.
5. Behandling av infiserte makrofager med Test narkotika / forbindelser
- TestAmfotericin B, Pentamidin og Miltefosine som standard anti-leishmanial legemidler for screening. Forbered stamløsninger av legemidler / testforbindelsene i vann eller DMSO som nevnt i reagens tabell. Test hvert legemiddel sammensatt på 6 konsentrasjoner.
- Serielt fortynnet (1:5) standard legemidler og testforbindelser i en fersk 96-brønns plate eller 2 ml rør (for kammeret lysbilder) med RPMI-1640 medium med 2% FBS. Narkotika / test sammensatte konsentrasjoner i denne platen er 2X av sluttkonsentrasjoner.
- Vask kultur plater og kammer lysbilder infisert med L. donovani promastigotes (fra trinn 4.5) minst 5 ganger med serumfritt, RPMI-1640 medium. Tilsett 100 pl kulturmedium (RPMI-1640 med 2% FBS) i hver brønn / kammer. De multiple vaskinger er nødvendig for å sikre fullstendig fjerning av ikke-internaliserte promastigotes.
- Tilsett 100 pl medium fra serielt utvannet standard anti-leishmanial legemidler eller testforbindelsene til hver brønn eller kammer. Sett opp smitteted THP1 celler styrer uten rusmidler samtidig i hver plate / kammer lysbilde.
- Inkuber platene og kammeret lysbilder ved 37 ° C, 5% CO 2 i 48 timer.
6. Chamber Slide Staining, fluoriserende mikroskop Imaging and Image Analysis for kvantifisering av infeksjon og virkning av medikamentell behandling
- Etter en 48 timers inkubering, vaske kammeret lysbildet 3 ganger med serumfritt RPMI-1640-medium. Skrelle av plast kamre fra lysbildene og fikser cellene ved å dyppe lysbildene i metanol i 30 sek. La lysbildene i bio-hette henhold luftstrøm for tørking.
- Utarbeide en SYBR Grønn jeg flekker løsning (5X) ved å fortynne (1:2,000) aksjen (10.000 X) med vann.
- Stain lysbildene under mørke forhold med fortynnet SYBR Grønn jeg flekken løsning i 15 min ved romtemperatur, vaskes én gang med vann og la lysbildene under luftstrøm for tørking.
- Plasser et fullt glass dekkglass over Stained lysbilde med hjelp av montering medium.
- Fang de digitale bilder av THP1 celler: uten infeksjon (blank), med infeksjon (kontroll), infiserte celler behandlet med ulike standard narkotika eller teste forbindelser i ulike fortynninger (figur 3, 5 og 6)) ved hjelp av en Nikon Eclipse 90i fluorescerende mikroskop ledsaget av NIS element AR 3,2 programvare.
- Telle makrofag kjerner (stor) og parasitten kjerner (liten med kinetoplast) med ImageJ (figur 7), som er en offentlig-tilgjengelig, Java-basert bildebehandling program utviklet ved National Institutes of Health ( http://rsb. info.nih.gov / ij / download.html ). Uttrykke dataene som antall amastigotes per 100 transformert THP1 celler.
7. Parasitten-Rescue-Transformation-Assay: Kontrollert lysis av L. donovani Amastigotes-infiserte Makrofager
- Vask 96-brønns mikroplate fra trinn 5,5 tre ganger med serum-fritt RPMI-1640 kulturmedium.
- Blant forskjellige vaskemidler testet ved forskjellige konsentrasjoner, 0,05% SDS behandling i 30 sek er optimal for kontrollert lysering (maksimal cellelyse med minimalt reddet parasitter 'levedyktighet).
- Fjern serumfritt medium fra hver brønn etter siste vask og tilsett 20 pl RPMI-1640 (med 0,05% SDS) til hver brønn. Rist platen i 30 sek og legge 180 pl komplett RPMI-1640 (med 10% FBS) i hver brønn.
- Inkuber platene ved 26 ° C i 48 t for transformasjon av reddet amastigotes til promastigotes.
8. Kvantitativ analyse av Transformed Promastigote (alamarBlue analyse)
- Etter en 48 timers inkubering ved 26 ° C, er alle de reddet levende amastigotes forvandlet til promastigotes (figur 1D). Tilsett 10 pl alamarBlue i hver brønn av 96-brønns pLates.
- Inkuber platene ved 26 ° C over natten.
- Etter inkubering over natten, lese plater for standard fluorescens på en Fluostar Galaxy fluorimeter (BMG Lab Technologies) på 544 nm eksitasjon, 590nm utslipp.
- Klargjør doseresponseffekter kurver (prosent vekst vs konsentrasjonen av medikamentet eller testforbindelse) med ExcelFit (figurene 7-9) og beregn IC 50 / IC 90 verdier fra disse kurver (tabell 1).
9. Standardisering av THP1 Cells til Parasitter forhold
- Standardisere THP1 celler til parasitter ratio å fastslå sensitivitet. Merk: Lav / høy parasitter tall / infeksjon kan kompromittere med følsomhet og selektivitet av screening.
- Standardisere THP1 celler til parasitter ratio ved å følge protokollen beskrevet ovenfor for THP1 celler seeding og Leishmania promastigote infeksjon (§ 3 og 4), bortsett bruk different forholdstall på THP1 celler til parasitter som 1:1.25, 1:2.5, 1:5 og 1:10.
- Sett opp forsøket både i 16-kammer lysbildet (for bildeanalyse) og 96-brønners plate (for parasitt-redning analyse) formater å sammenligne parasitten redning og bildeanalyse analyser.
10. Standardisering av ulike vaskemidler for kontrollert cellelyse
- Det primære målet for dette eksperimentet er å optimalisere protokollen for kontrollert lyse av de THP1 celler for å oppnå maksimal / komplett THP1 celler lysis uten vesentlig påvirker levedyktigheten til de reddet amastigote parasitter.
- Teste forskjellige vaskemidler som Tween 20, Tween 80, Triton X-100, NP-40 og SDS i forskjellige konsentrasjoner og forskjellige varigheter behandling (figur 2).
- THP1 celler til parasitter forholdet er 1:10 og andre forhold er like som ovennevnte punkter 1-8.
- Test 0,05% SDS behandling videre for ulik behandling tids til ytterligere optimalisere kontrollert cellelyse.
Representative Results
En kvantitativ analyse ble gjort for både Digital-Image-Analyse-Direct-Counting-Assay og Parasite-Rescue-Transformation-Assay for 24, 48, 72 og 96 timer etter behandling
I den direkte metoden telling, infeksjon i L. donovani-infiserte makrofager (THP1 celler) ble beregnet ved følgende ligning:
De amastigotes (bestemmes ved å telle amastigotes kjerner) / 100 transformert THP1 celler (bestemmes ved å telle telles på THP1 cellekjerner) (figur 7) er en mer nøyaktig måling for å analysere effekten av ulike standard eller testforbindelser enn andelen infiserte THP1 celler , som rapportert i noen tidligere papirer, fordi dette tallet er direkte relatert til samlet effekt av forbindelser, enten gjennom en nedgangi parasitter i macrophage celler eller total fjerning av parasitten fra makrofag cells.Infection ble beregnet ut fra digitale bilder av infiserte THP1 celler behandlet med forskjellige standard medikamenter ved forskjellige fortynninger for ulike tidsintervaller (figur 10 og tabell 1). Lese-out for den digitale-Image-Analyse-Direct-Counting-analysen ble amastigotes infection/100 forvandlet THP1 celler, mens lese-out for Parasite-Rescue-Transformation-analysen ble relative fluorescens enheter (RFU), som er direkte proporsjonal med antall levende Leishmania amastigotes reddet fra den infiserte makrofager og forvandle promastigotes. Den alamarBlue analysen er rutinemessig brukes for Leishmania promastigotes anti-leishmanial narkotika screening.
Analysen var opprinnelig standardisert og optimalisert for kontrollert lysis av Leishmania-infiserte THP1 celler. Målet var å optimalisere forholdene for vaskemiddel treatment, som gir nesten fullstendig lysis av THP1 celler med minimal effekt på levedyktigheten av de reddede amastigotes. Figur 1 viser et mikroskopisk visning av fullstendig assay protokollen. Intakte THP1 celler infisert med Leishmania amastigotes kan sees i figur 1A. Figur 1B viser lyse av de THP1 celler etter vaskemiddel behandling. Figur 1C viser reddet Leishmania amastigotes, som har blitt delvis omdannet til promastigotes og Figur 1D viser nesten fullstendig forvandling av amastigotes inn promastigotes og deres påfølgende spredning. Veksten av disse transformerte promastigotes kvantitativt kan overvåkes med tilsetning av alamarBlue og måling av fluorescens på en mikroplateleser. Behandling med NP-40 (figur 2A) og Triton X-100 (figur 2B) lysert de infiserte THP1 celler, men det også påvirket levedyktigheten ogtransformasjon av reddet amastigotes. Behandling med Tween 20 (figur 2C) og Tween 80 (figur 2D) ikke forårsake optimal lysis av THP1 celler resulterer i en ufullstendig redning av amastigotes som indikert av lavt antall transformerte promastigotes. Behandling med 0,05% SDS i 30 sek (figur 2E) ga nesten komplett lysis av Leishmania-infiserte THP1 celler og ikke påvirke levedyktigheten og transformasjon av reddet amastigotes. Ytterligere optimalisering viste at behandling av celler med 0,05% SDS for 20-30 sek ga høyest redning av levedyktige Leishmania amastigotes (figur 2F). I etterfølgende eksperimenter, behandling med 0,05% SDS i 30 sek ble brukt. Prosedyre for SDS behandling er den samme for en eller flere plater. I flere plater, ble SDS behandling gjennomført kolonne for kolonne med en flerkanals pipette. Serumfritt medium ble fjernet fra alle 8 brønner av en kolonne av platen og 20 & mu; L av 0,05% SDS ble tilsatt i 8 brønner av samme kolonne og fortynnet etter 30 sek med RPMI-1640 med 10% FBS. Under innledende standardisering av analysen, ble platene sjekket under mikroskop for ikke-internaliserte promastigotes. Et minimum av fem vaskinger var nødvendig for fjerning av parasitter før trinn 5 av behandling av infiserte celler med macrophage standard forbindelser og tre vaskevæsker ble nødvendig før trinn 7 av SDS behandling. Således, ble cellene vasket 8 ganger og ingen synlige ikke-internaliserte promastigotes forble før kontroll lysis av infiserte THP1 celler.
Digital bildeanalyse og direkte Counting
De digitale bilder av Leishmania-infiserte THP1 celler ble tatt på Nikon Eclipse 90i fluorescerende mikroskop etter farging med SYBR Grønn I. Både makrofag kjerner og intracellulær Leishmania kjerner med karakteristisk kinetoplast DNA ble observert under fluorescerende filtre (Figur 3). Videre ble bilder av infiserte THP1 celler også fanget opp under DIC. Når begge bildene ble slått sammen, ble konturene av THP1 celler med intracellulære amastigotes sett mer tydelig (figur 4). Den ImageJ programmet ble brukt til å analysere disse bildene. ImageJ er et offentlig tilgjengelig, Java-basert, bilde-prosessering program utviklet ved National Institutes of Health ( http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html ). ImageJ har blitt designet med en åpen arkitektur som gir utvidelsesmuligheter via Java plugins og skrivbare makroer. Custom oppkjøp, analyse og behandling plugins kan utvikles ved hjelp ImageJ innebygde editoren og Java. For differensial telling av THP1 celler kjerner og parasitt kjerner av ImageJ, ble bildet åpnet i ImageJ. Celleteller ble funnet i Analyser alternativ i plugin av programvaren. Bildet ble initialisert og celleteller type 1 ble valgt for THP1 cell kjerner og celleteller type 2 ble valgt for parasitten atomkjerner (figur 3). Differensiell opptelling ble gjort for minst 200 THP1 cellekjerner og de intracellulære amastigotes tilstede i disse THP1 cellekjerner. En sammenligning av parasitt-redning analysen og bildeanalyse metoden ble gjort for å evaluere smittsomhet av THP1 celler med forskjellig macrophage:. Promastigotes forholdstall (figur 4) Figur 5 er den differensial smittsomhet i THP1 celler på ulike macrophage: promastigote forholdstall. Begge metodene viste sammenlignbare resultater og macrophage: promastigote forholdet 1:10 ga optimal og reproduserbar smittsomhet.
Når betingelsene for parasite-rescue/transformation analysen og digitale bildeanalyse ble optimalisert, ble anvendeligheten av disse analysene evaluert for anti-leishmanial narkotika screening. De Leishmania-infiserte THP1 celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av standard enNTI-leishmanial narkotika nemlig amfotericin B, pentamidin og Miltefosine for ulike tidsintervaller spenner 24-96 hr. Eksperimentet for parasitten berges / transformasjon analysen ble gjort i triplikat og eksperimentet for direkte celler telling metoden ble gjort i duplikat. Figur 6 viser mikroskopiske bilder av kontrollen infisert, kontroll infisert ubehandlet og Leishmania-infiserte, behandlet THP1 celler. Dosen responskurver ble fremstilt fra parasitt-redning og transformasjon assay (konsentrasjon av medikamentet g. transformerte parasitter) og bildeanalyse assay (antall amastigotes/100 THP1 celler) (figurene 7-9). IC 50 av stoffene ble beregnet ved ExcelFit og er presentert i tabell 1. Digital-Image-Analyse-Direct-Counting-Assay og Parasite-Rescue-Transformation-Assay viste sammenlignbare resultater. Digital-Image-Analyse-Direct-Counting-analysen ble mindre optimal i de tidlige tidspunkter på 24 og 48-timers narkotika treatments, mens Parasite-Rescue-Transformation-Assay viste resultater mer i samsvar med de rapporterte verdier på alle tidspunkter i løpet av 24-96 timer etter medikamentell behandling. Denne forskjellen i resultater med digital-Image-Analyse-Direct-Counting-Assay og Parasite-Rescue-Transformation-analysen kan skyldes tilstedeværelse av ikke-levedyktige amastigotes under tidlige perioder med medikamentell behandling i Digital-Image-Analyse-Direct-telling -analysen.
Figur 1. En mikroskopisk visning av Leishmania donovani amastigotes redning og transformasjon til promastigotes. A - tilhenger THP1 celler infisert med Leishmania amastigotes, B - tilhenger, infiserte THP1 celler etter kontrollert lysis C - Transformert Leishmania donovani promastigotes fra amastigotes reddet fra infiserte THP1 macrophage celler D - Vekst og spredning av transformed Leishmania donovani promastigotes.
Figur 2. Optimalisering av kontrollert lysis av infiserte THP1 celler for å oppnå maksimal redning av levende Leishmania donovani amastigotes og deres transformasjon til promastigotes. Analyse av lysis av THP1 celler og redning av amastigotes fra Leishmania-infiserte THP1 celler med ulike vaskemidler. To konsentrasjoner (0,05% og 0,1%) av vaskemiddel og to tidsperioder (30 sek og 60 sek) for behandling ble testet. RFU = relative fluorescens enheter. Hver stolpe representerer gjennomsnittet av dupliserte observasjoner. [A] NP-40 behandling forårsaket lysis av THP1 celler og også påvirket levedyktigheten til de reddet amastigote parasitter. [B] Triton X-100 treatment forårsaket lysis av THP1 celler og også påvirket levedyktigheten til de reddet amastigote parasitter [C] Tween 80 forårsaket delvis lysis av THP1 celler for å redde de amastigotes. [D] Tween 80 forårsaket delvis lysis av THP1 celler for å redde de amastigotes. [E ] SDS behandling forårsaket nesten komplett lysis av THP1 celler og ikke påvirke levedyktigheten til de reddet amastigotes på 0,05% / 30 sek. [F] Behandling med 0,05% SDS for 20-30 sek forårsaket nesten komplett lysis av THP1 celler og reddet levedyktig parasitt amastigotes å forvandle promastigotes. Klikk her for å se større figur .
Figur 3. Fluoriserende digitalt bilde av en differensiert THP1 celle infisert in vitro med Leishmanien donovani amastigotes. Den karakteristiske kDNA kan også sees med hver parasitt kjerne. Macrophage nucleus (mN) (1) og parasitten kjerner (pN) (2) kan være forskjellig merket og differensielt telles av ImageJ analyse programvare for kvantitativ evaluering av infeksjonen. Kvantifisering ble gjort som antall amastigotes/100 THP1 celler.
Figur 4. Sammenligning mellom Digital-Image-Analyse-Direct-Counting-analyse (nedre panel) og Parasite-Rescue-Transformation-analyse (øvre panel). Macrophage: promastigote forholdet 1:10 ga optimal infeksjon. Begge viste sammenlignbare resultater. Parasitten-redning analysen viste noen bakgrunnsverdier. Hver bar viser normalen dupliserte verdier.
Figur 5 THP1 celler infisert med Leishmania promastigotes av ulike THP1:. Promastigote forhold. De kvantitative resultater som antall amastigotes/100 THP1 celler er presentert i figur 4..
Figur 6. Digitale bilder (Fluorescent + DIC) av THP1 celler infisert med Leishmania donovani amastigotes etter behandling med standard anti-leishmanial legemidler for ulike tidsperioder. Resultatene ble kvantifisert som antall amastigotes/100 THP1 celler og brukes til å beregne prosent vekst sammenlignet med ubehandlede kontroller og bestemme IC 50 verdier.
Figur 7. Sammenligning av Digital-Image-Analyse-Direct-Counting-Assay og Parasite-Rescue-Transformation-analyse for anti-leishmanial narkotika screening (Amophotericin B). De infiserte makrofager ble behandlet med ulike konsentrasjoner av standard anti-leishmanial narkotika for ulike perioder. IC 50 (ug / ml)-verdier ble beregnet fra dose-respons kurve av Excelfit. Klikk her for å vise større figur .
Figur 8. Sammenligning av Digital-Image-Analyse-Direct-Counting-Assay og Parasite-Rescue-Transformation-analyse for enNTI-leishmanial narkotika screening (Pentamidin). De infiserte makrofager ble behandlet med ulike konsentrasjoner av standard anti-leishmanial narkotika for ulike perioder. IC 50 (mikrogram / ml) verdier ble beregnet fra doseresponseffekter kurver ved Excelfit. Klikk her for å se større figur .
Figur 9. Sammenligning av Digital-Image-Analyse-Direct-Counting-Assay og Parasite-Rescue-Transformation-analyse for anti-leishmanial narkotika screening (Mitefosine). De infiserte makrofager ble behandlet med ulike konsentrasjoner av standard anti-leishmanial medikament for forskjellige tidsperioder. IC 50 (ug / ml)-verdier ble beregnet fra dose-responskurver ved Excelfit.Klikk her for å se større figur .
| Test Drug | 24-timers en | 48 hr en | 72 timer en | 96 timer a | ||||
| IACA b | PRTA c | IACA b | PRTA c | IACA b | PRTA c | IACA b | PRTA c | |
| Amfotericin B | 0.24 ± 0.03 | 0,17 ± 0,01 * | 0,12 ± 0,04 | 0,20 ± 0,07 | 0,06 ± 0,01 | 0,06 ± 0,01 | 0,11 ± 0,03 | 0,10 ± 0,03 |
| Pentamidin | > 10 | 2,55 ± 1,16 * | 2,88 & plusmn; 0,58 | 1,43 ± 0,91 | 1,24 ± 0,35 | 1,52 ± 0,16 | 0,71 ± 0,63 | 0,98 ± 0,33 |
| Miltefosine | 0,38 ± 0,02 | 0,19 ± 0,08 * | 0.24 ± 0.06 | 0,30 ± 0,08 | 0,36 ± 0,02 | 0,16 ± 0,06 | 0,21 ± 0,15 | 0,17 ± 0,10 |
Tabell 1. Sammenligning av Digital-Image-Analyse-Direct-Counting-Assay og Parasite-Rescue-Transformation-analyse for anti-leishmanial narkotika screening. De infiserte makrofager ble behandlet med ulike konsentrasjoner av standard anti-leishmanial narkotika for ulike perioder. IC 50 (mikrogram / ml) verdier ble beregnet fra doseresponseffekter kurver ved Excelfit (Tall 7-9) en timer etter behandling,. B IACA = bildeanalyse og direkte CountingAssay, c PRTA = Parasite-Rescue and Transformation analysen. Oppgitte verdiene er IC 50 (konsentrasjon av medikamentet forårsaker 50% inhibisjon i parasitt vekst) som ug / ml, og er middelverdien ± SD av minst tre forsøk. * Statistisk forskjellig (<0,05) sammenlignet med IC 50 verdier med IACA.
Discussion
Det er flere metoder tilgjengelig for anti-leishmanial narkotika screening basert på makrofag-amastigote modeller. Analyser kan gjøres med makrofager samlet fra vertsdyr nemlig peritoneal eksudat celler (PEC), perifert blod monocytter celler (PBMC) 6 eller benmarg-avledet makrofager (BMM) eller i monocyttisk cellelinjer som mus (J774 og RAW264.7 ) 7 og human (THP1, U937, HL-60) 8 monocyttisk celler. Analysene, som bruker å dele vertsceller, må sørge for at de konfunderende effekter av narkotika aktivitet på både parasitt og vert celler nummer er vurdert. Differensiert primære makrofager innsamlet fra forskjellige kilder slik som mus og rotter er ikke-delende i naturen, men disse cellepreparater har kanskje ikke homogene cellepopulasjoner. Monocyttisk celler-avledet cellelinjer er homogene i naturen og er en bedre modell for makrofag-amastigote-basert screening. Ut av ulike monocyttisk cellelinjer, differentiated THP1 celler (humant akutt monocyttisk leukemi cellelinje) kan danne en ikke-delende monolayer og tilby et attraktivt alternativ til primære isolerte makrofager.
Macrophage-amastigote-basert screening kan gjøres på flere måter. Klassisk mikroskopisk vurdering basert på direkte celle og parasitt telle 9 er arbeidskrevende. Fraværet av automatisering begrenser nytten av denne analysen. Telling av celler er tidkrevende og kan gi unøyaktig bestemmelse av IC 50 verdier siden bestemmelse av parasitten levedyktighet gjennom en farging prosedyre er vanskelig. Mange fluorescerende fargestoffer og monoklonale antistoffer kan benyttes for flowcytometrisk analyser 10, 11, men disse analysene er også begrenset på grunn av mindre følsomhet og begrensning av tidsintervallet av medikament-behandling til bare en dag. Det er flere rapportørgen analyser tilgjengelig for kvantifisering veksten av intracellulære amastigotes 12,13,14. En automated screening kan være mulig ved hjelp av rapportørgrupper gener, men disse analysene har også visse ulemper. Først fleste av disse analysene krever narkotika valg for å opprettholde episomal uttrykk for reporter gener, som kanskje ikke er ideelt for en narkotika screening eksperiment. Måten hvorved rapportørgen introduseres kunne også påvirke de fysiologiske egenskapene til parasitten og har en innvirkning på screening. Hvis reporteren genet er den delen av en episomal plasmid, kan den relative effekt av reporter avhenge kopitall av den transfekterte plasmid (som varierer fra celle til celle) i stedet for på aktiviteten til stoffet 14. Noen reporter parasitter som er transformert parasitter trenger ikke selektiv trykk til å holde rapportørgen; imidlertid kan det være biologiske konsekvenser enten ved å forstyrre genomisk arkitektur eller bare ved tilstedeværelsen av de utenlandske reporter proteiner 15. I noen rapportørgen baserte analyser, er detspørsmål om følsomhet og bakgrunn aktivitet 16. Viktigst, kan mange av de reporter genuttrykk analyser, spesielt en med GFP reporter gene15, ikke skille mellom de levende og døde intracellulære amastigotes. Assays basert på luciferase reporter gen kan skjelne mellom levende og døde intracellulære amastigotes, men underlaget og cellelyse buffer for disse analysene er dyrt for storskala screening 17. For å overvinne disse demerits og begrensninger av tidligere makrofag-amastigote-baserte screening-analyser, har vi utviklet og optimalisert denne parasitten-redning og transformasjon analysen. Denne analysen er basert på THP1 celler, som har god homogenitet og er ikke-delende i naturen, som vertsceller.
Parasitten-Rescue-Transformation-Assay analysen beskrevet her kan sammenlignes med analysen er basert på Digital-Image-Analyse-Direct-Opptelling av den intracellulære amastigotes. Fluoriserende og DIC mikroskopi, digital image analyser av ImageJ for differensial telling av macrophage kjerner og parasitten kjerner har videreutviklet den mikroskopiske telling analysen. Fange bilder under fluorescerende lys filtre og differensial interferens kontrast (DIC) filtre har forbedret kvaliteten av det digitale bildet for mer nøyaktig telling av de intracellulære parasitter. Både lysstoffrør og DIC bilder kan bli slått sammen for å oppnå de digitale bildene med klare macrophage celle skisserer og fluorescerende intracellulær kjerner. Macrophage kjerner og parasitten kjerner kan forskjellig anerkjent med ImageJ. Derfor både Digital-Image-Analyse-Direct-Counting-Assay og Parasite-Rescue-Transformation-analysen har potensial for automatisering og søknad til storskala screening. De kritiske trinnene i parasitt-Rescue-Transformasjon-Assay er: (a) gjentatte vask av THP1 cellekulturer etter eksponering for Leishmania promastigotes, for å sikre nesten fullstendig fjerning av den ikke-internalized promastigotes og (b) kontrollert lyse av de infiserte THP1 celler med SDS. Begge trinnene kan også styres med automatisering og bør ikke gå på akkord med gjennomstrømming av analysen. Det andre trinnet av vaskinger, etter eksponering av Leishmania infiserte THP1 celler til test legemidler / forbindelser fjerner de gjenværende ikke-internaliserte parasitter, hvis noen. Parasitten-Rescue-Transformation-analysen gir betydelige fordeler fremfor eksisterende mikroskopisk, reporter gen og bildeanalyse analyser. Analysen er enkel, robust, og reproduserbar, kan automatiseres for storskala screening og derfor bør ha viktig anvendelse i screening av store forbindelser biblioteker for nye anti-leishmanial medisiner. Videre kan analysen også anvendes for å evaluere smittsomhet av klinisk, så vel som, laboratorie isolater av Leishmania in vitro.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Den NCNPR-USDA-ARS Scientific avtale No 58-6408-2-0009, CDMRP stipend Award # W81XWH-09-2-0093 av US Army Medical Research og forsyningskommando Command.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) | Sigma-Aldrich USA | P1585 | Required for differentiation of THP1 cells. |
| RPMI-1640 Medium | Invitrogen | 23400021 | |
| Lab-TeK Chamber Slide System (16 Chamber) | Thermo Scientific Nunc | 178599 | |
| Clear, Flat-Bottom, 96-Well Plates | BD Falcon | 353075 | Plates to perform 96-well plate assay |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich USA | A4888 | Standard anti-leishmanial drug dissolve in DMSO (2 mg/ml) |
| Pentamidine Isothionate Salt | Sigma-Aldrich USA | P 0547 | Standard anti-leishmanial drug dissolve in DMSO (2 mg/ml) |
| Miltefosine | EMD Biosciences USA | 475841 | Standard anti-leishmanial drug dissolve in serum-free RPMI-1640 medium (prepare fresh) (2 mg/ml) |
| Sodium Stibogluconate | EMD Biosciences USA | 567565 | Standard anti-leishmanial drug prepare in RPMI-1640 with 4% FBS. (1 mg/ml) |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich USA | L 5750 | |
| Fluorescence Microscope | NIKON | ECLIPSE 90i | |
| Fluorescence Microplate Reader | BMG | Polar Star Galaxy | |
| Mounting Medium | Sigma-Aldrich USA | M 1289 | |
| alamarBlue | AbD Serotec | BUF012 B | |
| SYBR Green I | Sigma-Aldrich USA | S 9430 | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Sci. | 523500 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich USA | P2256 | |
| 2-Mercapt–thanol | Sigma-Aldrich USA | M6250 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11050H | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich USA | P9416 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich USA | P6474 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich USA | T8787 | |
| NP-40 | Calbiochem | 492016 |
References
- WHO. Control of the leishmaniasis: report of a meeting of the WHO Expert Committee on the Control of Leishmaniasis. Xii, Geneva. 22-26 (2010).
- Croft, S. L., Seifert, K., Yardley, V. Current scenario of drug development for leishmaniasis. Indian J. Med. Res. 123 (3), 399-410 (2006).
- Croft, S. L., Sundar, S., Fairlamb, A. H. Drug Resistance in Leishmaniasis. Clinical Microbiology reviews. 19 (1), 111-126 (2006).
- Mikus, J., Steverding, D. A simple colorimetric method to screen drug cytotoxicity against Leishmania using the dye AlamarBlue. Parasitology International. 48 (3), 265-269 (2000).
- Callahan, H. L., Portal, A. C., Devereaux, R., Grogl, M. An Axenic Amastigote System for Drug Screening. Antimicrob. Agents Chemother. 41 (4), 818-822 (1997).
- Seifert, K., Escobar, P., Croft, S. L. In vitro activity of anti-leishmanial drugs against Leishmania donovani is host cell dependent. J. Antimicrob. Chemother. 65 (3), 508-511 (2010).
- Kolodziej, H., Kiderlen, A. F. Antileishmanial activity and immune modulatory effects of tannins and related compounds on Leishmania parasitized RAW 264.7 cells. Phytochemistry. 66 (17), 2056-2071 (2005).
- Maia, C., et al. Infectivity of five different types of macrophages by Leishmania infantum. Acta Tropica. 103 (2), 150-155 (2007).
- Neal, R. A., Croft, S. L. An in vitro system for determining the activity of compounds against the intracellular amastigote form of Leishmania donovani. J. Antimicrob. Chemother. 14, 463-475 (1984).
- Abdullah, S. M., Flath, B., Presber, H. W. Comparison of different staining procedures for the flow cytometric analysis of U-937 cells infected with different Leishmania-species. J. Microbiol Methods. 37 (2), 123-138 (1999).
- Giorgio, C. D., et al. Flow Cytometric Detection of Leishmania Parasites in Human Monocyte-Derived Macrophages: Application to Antileishmanial-Drug Testing. Antimicrob Agents Chemother. 44 (11), 3074-3078 (2000).
- Mandal, S., et al. High throughput screening of Leishmania donovani clinical isolates against drug using a colorimetric β Lactamase assay. Indian J. Exp. Biol. 47 (6), 475-479 (2009).
- Chan, M. M. Y., Bulinski, J. C., Chang, K. P., Fong, D. A. Microplate assay for Leishmania amazonensis promastigotes expressing multimeric green fluorescent protein. Parasitol. Res. 89 (4), 266-271 (2003).
- Buckner, F. S., Wilson, A. J. Colorimetric assay for screening compounds against Leishmania Amastigote Grown in macrophages. Am. J. Trop. Med. 72 (5), 600-605 (2005).
- Sereno, D., et al. Advances and perspectives in Leishmania cell based drug-screening procedures. Parasitol. Int. 56 (1), 3-7 (2007).
- Gupta, S., Nishi, Visceral leishmaniasis: experimental models for drug discovery. Indian J. Med. Res. 133, 27-39 (2011).
- Roy, G., et al. Episomal and stable expression of the luciferase reporter gene for quantifying Leishmania spp. Infections in macrophages and in animal models. Mol. Biochem. Parasitol. 110 (2), 195-206 (2000).
