Summary
En teknik er beskrevet for bredt åbning af blod-hjerne-barrieren hos mus ved hjælp af mikrobobler og ultralyd. Anvendelse af denne teknik, kan mangan indgives til musehjerne. Fordi mangan er en MRI-kontrastmiddel, der ophobes i depolariserede neuroner, denne tilgang gør det muligt billeder af neuronal aktivitet.
Abstract
Selv mus er den dominerende model for at studere de genetiske og molekylære fundament for neurovidenskab, funktionel Neuroimaging i mus er stadig teknisk udfordrende. Én fremgangsmåde, aktiverings-induceret mangan-MRI (AIM MRI) er blevet anvendt med succes til at kortlægge neuronal aktivitet i gnavere 1-5. I AIM MRI, + Mn 2 virker som en calcium analog og akkumuleres i depolariserede neuroner 6,7. Fordi Mn 2 + forkorter T 1 vævet ejendom, vil regionerne i forhøjet neuronal aktivitet styrke i MRI. Endvidere Mn2 + fjerner langsomt fra aktiverede regioner, og derfor kan stimulation udføres uden magneten før billeddannelse, hvilket muliggør større eksperimentel fleksibilitet. Men fordi Mn2 +, ikke let krydser blod-hjerne-barrieren (BBB), behovet for at åbne BBB har begrænset anvendelsen af AIM MRI, især i mus.
Et redskab til at åbne BBB er ULTrasound. Selvom potentielt skadelig, hvis ultralyd administreres i kombination med gasfyldte mikrobobler (dvs. ultralydskontrastmidler), den akustiske tryk, der kræves for BBB åbning er betydeligt lavere. Denne kombination af ultralyd og mikrobobler kan anvendes til pålideligt at åbne BBB uden at forårsage vævsbeskadigelse 8-11.
Her, er en fremgangsmåde præsenteres til udførelse AIM MRI ved hjælp mikrobobler og ultralyd til at åbne BBB. Efter en intravenøs injektion af perflutren mikrobobler er en ufokuseret pulserende ultralydsstrålen påføres barberede muse hovedet i 3 minutter. For nemheds skyld henviser vi til denne teknik på BBB Åbning med Mikrobobler og ultralyd som BOMUS 12. Anvendelse BOMUS at åbne BBB hele begge cerebrale hemisfærer, er mangan administreres til hele musehjerne. Efter eksperimentel stimulering af let sederede mus, AIM MRI anvendt til at kortlægge den neuronale respons.
Tildemonstrere denne fremgangsmåde, er heri BOMUS og AIM MRI anvendt til at kortlægge ensidig mekanisk stimulering af vibrissae i let sederede mus 13. Fordi BOMUS kan åbne BBB hele begge halvkugler, er den ustimulerede side af hjernen, der anvendes til at kontrollere for ikke-specifik baggrund stimulering. Den resulterende 3D aktiveringskort stemmer godt overens med offentliggjorte repræsentationer vibrissae regioner cylinderen felt cortex 14. Ultralyd åbning BBB er hurtig, ikke-invasiv, og reversibel, og derfor er denne fremgangsmåde egnet til high-throughput og / eller langsgående undersøgelser i vågne mus.
Protocol
1. Saml og Kalibrer Ultralyd System
- Ultralydssystemet begynder med en enkelt-element ultralydtransducer med en diameter bred nok til at dække musehjerne og en centerfrekvens i intervallet på 2 MHz. Transduceren drives af en 50 dB-forstærker, som er forbundet til en signalgenerator, der frembringer ultralydsimpulsen sekvens.
- At kalibrere akustiske tryk ultralyd-systemet, anvendes en hydrofon til at relatere den påtrykte spænding til den resulterende akustiske tryk. Placere transduceren i en vandtank med hydrofonen. Anvende en enkel puls (fx en 10-cyklus sinusoiden på transducerens frekvens pulsrepetitionsfrekvens 10 Hz) til transduceren. Anvende en tre-akset translation stage til at finde den maksimale reaktion, som bør være i centrum af ultralydsstrålen på transducerens naturlige fokusering (ca. 60 mm i vores 13 mm diameter 2,15 MHz transducer).
- Foretage flere målinger over en klange af indgangsspændinger (f.eks 50-400 mV pp) for at kontrollere linearitet af systemet. Anvende en simpel lineær regression til at estimere forholdet mellem indgangsspændingen og akustiske tryk. I vores system, svarede input spændinger på 258 og 167 mV pp til peak-negative akustiske pres på 0,52 og 0,36 MPa.
- Program signal generator til at producere en ultralydsimpuls sekvens bestående af byger af sinusformede impulser på transducerfrekvens med 50000 cykler pr burst og en burst periode på 64 ms. Baseret på de kalibreringsmålinger den pulsamplitude indstillet til at generere spids-negative akustiske tryk på 0,36 MPa ved midten af transduceren naturlige fokus.
2. Forberede Reagenser
- Opløs manganchlorid tetrahydrat (MnCl2 · 4H 2 O) i sterilt vand ved en koncentration på 100 mM (300 mOsm) og filtreres steriliseres.
- Frembringe perflutren lipidmikrosfærer med "activating "hætteglasset i producentleveret omrører i 45 sek. for en dag eksperimenter, kan et enkelt hætteglas aktiveres en gang ved begyndelsen af dagen og anvendt uden reaktivering af resten af dagen.
- Umiddelbart før mikrosfære indgivelse bevæge hætteglasset med hånden i 1 minut for at resuspendere mikrosfærerne. Når trække mikrobobler fra hætteglasset, må du ikke injicere rumluft ind i hætteglasset, da det nedbryder de resterende mikrobobler. Lad hætteglasset, indtil den sidste brug af dagen, og derefter gemme det i et køleskab. Opretholdes på denne måde, kan et enkelt hætteglas vare flere dage. Genaktivere den lagrede hætteglasset i omrøreren, før den første anvendelse på efterfølgende dage.
3. Animal Forberedelse
- Bedøve dyrene med isofluran, leveret af næsekeglen. Næsekeglen Apparatet bør være designet til at fastsætte dyrets hoved præcist og pålideligt i den samme position hver gang. Vores enhed 15 fastholder hovedet i the "skull-flad" position (dvs. den dorsale kraniet overfladen er vandret), der anvendes i Paxinos hjernen atlas 16. Titrere anæstetikum for at opretholde en respirationsfrekvens på mellem 85 og 125 vejrtrækninger pr minut. Opretholde kroppens temperatur ved hjælp af en varmelampe eller blæst luft. Beskyt øjnene med smøremiddel.
- Fjerne hår fra muse hovedbunden med en elektrisk trimmer.
- Placere en halevene kateter og en intraperitoneal (IP) kateter. For overlevelse undersøgelser, sørg for at bruge passende steril teknik, IP kateteranbringelse demonstreret i videoen til denne artikel kun er egnet for ikke-overlevelse eksperimenter.
- Foretag eventuelle yderligere nødvendige forberedelser til neuronal stimulation eksperimentet. Til kortlægning af vibrissae stimulering af cylinderen felt cortex, anvender et dissektionsmikroskop og mikrokirurgiske saks til at klippe den vibrissae så tæt som muligt på hudoverfladen uden at irritere follikel eller omgivende hud.
- Sted ultralyd gel påhovedbunden, og sænk derefter en vandsøjle indeholdt i en tynd plastfolie (fx en 7,6 um trash bin liner) på hovedet. Nå igennem med vandsøjlen med en bomulds-spids vatpind til at skubbe eventuelle luftbobler der bliver fanget i ultralyd gel. Placer ultralydstransducer på sin naturlige fokus afstand (58 mm) direkte over musen hjernen i kolonnen af vand, og tør transduceren med en fingerspids for at fjerne eventuelle luftbobler.
4. Blod-hjerne barrieren Åbning med Mikrobobler og Ultra Sound (BOMUS)
- Giver en intraperitoneal injektion af mangan opløsningen ved en dosis på 0,5 mmol / kg IP. Hætten intraperitoneal kateteret, så mangan ikke strømmer ud, og vent 10 minutter for at gøre det muligt at distribuere (figur 1).
- At åbne BBB, administrerer 30 pi perflutren lipidmikrosfærer (aktiveret DEFINITY) gennem halevenen kateteret, og samtidig initiere ultralyd pulssekvens. Continue insonification i 3 minutter.
5. Neuronal Stimulation
- Lad cirka 40 minutter for hjernen niveauer af Mn 2 + til at stabilisere, før du begynder neuronal stimulation. På denne måde + diffusion over BBB den dramatiske basislinie forøgelse skyldes Mn2 kan skelnes fra den diskrete forskellen forbedring som følge af stimulering. Derefter begynder stimulation med dit paradigme valg (figur 1).
- For vibrissae stimulering, skal du slukke for isofluran og fjern næsekeglen. Bevæger en blød kunstnerens malerpenslen manuelt i en cirkulær bevægelse (1-5 Hz) gennem vibrissae arrayet i en afstand af ca 2-5 mm fra huden. Fortsæt stimulering i 90 min. Mangan har en sedativ virkning, som tillader ubegrænset stimulering af dyret. Hvis dyret bliver rastløse, administrerer 5% isofluran via næsekeglen i cirka 15 sekunder.
6. Magnetic resonansbilleddannelse
- Efter stimulering, genoptage anæstesi via næse kegle. Fortsætte opretholdelse af kropstemperaturen og titrere isofluran niveau til en respirationsfrekvens på 85 til 125 vejrtrækninger pr minut.
- Placer musen i en MR-scanning spole og overføre til MRI-systemet. Anskaf høj opløsning 3D-T 1-vægtede MR-billeder. For eksempel bruger en 3D forkælet gradient mindes ekko (SPGR) sekvens med følgende parametre: gentagelse tid på 25 ms ekko på 2 ms, flip vinkel på 30 grader, båndbredde på 15,63 kHz; synsfelt på 20 × 20 × 12 mm matrix 128 x 128 x 60.
7. Image Analysis
- Billedanalyse er specifik for stimulering anvendte paradigme. For vibrissae stimulering eksperiment (figur 2), importere billeder fra forskellige dyr i en egnet analyse miljø. Hvis nogle dyr blev stimuleret til højre, mens andre blev stimuleret til venstre, flip nogle så at alle billeder effektivt "venstre-stimuleret." Så at sammenligne den stimulerede side af hver hjerne til sin kontralaterale ustimulerede side, skabe en duplikeret og spejles venstre ustimuleret billede sæt oprettet. Registrer alle billeder til et fælles rum og derefter glatte dem med en 3 × 3 × 3 pixel Gaussian kerne.
- Eksportere data til en matematisk analyse af miljø, såsom MATLAB. Eventuelt maskere irrelevant anatomi i datasæt. Intensitet-normalisere de billeder, ved iterativ metode til Venot et al. 17,18.
- Anvender en parret, enkelt-tailed t-test for at sammenligne hver voxel af stimulerede sider af hver hjerne til den tilsvarende kontralaterale voxel på ustimulerede sider af hver hjerne.
- Vist resulterende p-værdi kort til at identificere regioner forskellen aktivitet (figur 3).
8. Repræsentative resultater
Fremgangsmåden præsenteres her har to fond amental trin: (1) BBB åbning med Mikrobobler og ultralyd (BOMUS) og (2) Aktivering-induceret Mangan-forstærket MRI (AIM MRI). Fordi sidstnævnte trin afhænger af førstnævnte, er det vigtigt at kontrollere vellykkede implementering BOMUS.
Afbrydelse af blod-hjerne-barrieren efter indgivelse af en T 1-shortening kontrastmiddel (såsom mangan eller gadolinium-baseret middel) resulterer i et signal stigning i hjerneparenkymet på T 1-vægtede billeddannelse sammenlignet med hjerner, som BOMUS Der blev ikke udført (fig. 4). Distributionen af denne mangan forøgelse ikke er helt ens, selv om det er forholdsvis ensartet mellem dyr. Fordelingen afspejler ikke blot inhomogenitet i BBB åbning, men også er iboende ikke-ensartet fordeling af Mn i hjernen 19. De rumlige og tidsmæssige dynamik BBB åbningen er yderligere beskrevet tidligere 12.
ent "> Når BOMUS er gennemført med succes, er næste skridt at foretage AIM MRI mange eksperimentelle paradigmer er muligt.. skal dog fordi der er mange potentielle forvirrer de kontroller og analyser bør udformes omhyggeligt Konfunderende virkninger omfatter uensartet BBB åbning, inhomogen akkumulering af Mn i hjernen, tidsmæssige dynamik Mn diffusion, og non-specifik neuronal aktivitet. denne demonstration blev neuronal respons på ensidig stimulering af vibrissae kortlagt. at tage højde for ujævnheder og Mn flux, den ustimulerede side af hver hjerne blev anvendt som en intern kontrol. at tage højde for ikke-specifik neuronal aktivitet, der kan variere mellem dyr, analyse anvendes statistiske test til at identificere regioner, der var konsistent forskellig blandt de dyr (fig. 2). Resultaterne var en tre-dimensional forskel kort og en tredimensionale p-værdi kort (figur 3), den højre side af hvilket indikerede regionerhøjere signal kontralateralt til den stimulerede vibrissae. Den venstre side af kortet er angivet, hvilke regioner havde signifikant højere signal ipsilateralt til stimulerede vibrissae. P-værdien kort identificeret et bredt område af forhøjet signal kontralateralt til den stimulerede vibrissae svarende til cylinderen inden for den primære sensoriske cortex, hvis reaktion på vibrissae stimulation er blevet grundigt dokumenteret ved elektrofysiologi 20,21 og 2-deoxyglucose undersøgelser. En mere fuldstændig diskussion af disse resultater er blevet offentliggjort tidligere 13.
Figur 1. Protokol tidsplan for funktionel Neuroimaging med BOMUS og AIM MR (Tilpasset fra Howles et al. 13).
Figur 2. Analyse ordning for at identificere regioner of forskellig intensitet mellem stimulerede og ustimulerede sider af hver hjerne. At sammenligne den stimulerede side af hver hjerne til kontralaterale ustimulerede side, en duplikeret og spejlet venstre ustimulerede billede set dannes. Disse billeder registreres, filtreret og normaliseret. Endelig, ved test sammenligner venstre stimuleret og venstre-ustimulerede billeder. T-test er "parres", således at den stimulerede side af hver hjerne kun sammenlignet med den ustimulerede side af samme hjernen. T-testen er "single-tailed", således at den ene side af p-værdien kort indikerer signifikant højere signal på den stimulerede side af hjernen, medens den anden side af p-værdien kort indikerer signifikant højere signal på ustimulerede side af hjerne (Tilpasset fra Howles et al. 13).
Figur 3. Resultater af samlede analyse af 7 dyr i to forskellige aksiale positioner. T han første søjle viser middelværdien af alle registrerede justerede billeder, så der effektivt alle mus havde deres venstre vibrissae stimuleret. Disse billeder er overlejret med et farvekort angiver den gennemsnitlige procentvise forøgelse i signal ved hver voxel i forhold til den kontralaterale hemisfære, som angivet ved farvestang. Farvede områder på højre side af billedet vise, hvor hemisfære kontralateralt til stimulering havde højere signal. Farvede områder på den venstre side af billedet vise, hvor hemisfære ipsilateralt til stimulering havde højere signal. Den anden kolonne viser de samme billeder overlejret med p-værdi kort, der viser den statistiske signifikans af stigningen i signalet. Den tredje kolonne viser den samme p-værdi kort oven på de tilsvarende tal fra Paxinos stereotaksiske atlas 16 med tønde inden for den sensoriske cortex skygge (Tilpasset fra Howles et al. 13).
/ 4055/4055fig4.jpg "/>
Figur 4. Rumlige fordeling af Mn2 + i hjernen. Billeder blev erhvervet 170 minutter efter 0,5 mmol / kg IP MnCl2 fra BOMUS-behandlede (n = 5) og kontrol (n = 4) mus. Efter normalisering, middel-og standardafvigelse kort blev beregnet (venstre panel). Forbedring var større i BOMUS-behandlede mus. Men denne forøgelse var ikke ensartet over hele hjernen, var det forholdsvis ensartet, undtagen nær kanterne af hjernen og ventriklerne. Anvendelse områder af interesse (ROI'er) trækkes omkring forskellige strukturer, var den gennemsnitlige SNR (+ 1 SD) beregnes på tværs af hver gruppe (højre panel). BOMUS-behandlede dyr viste større SNR, men også større varians mellem strukturer og mellem dyr (Tilpasset fra Howles et al. 13).
Figur 5. At undersøge væv virkninger BOMUS blev hjerner fra BOMUS-behandlede mus fast, selvctioned ved 500 - um intervaller, og farvet med hematoxylin og eosin. Det gennemsnitlige antal røde blodlegemer ekstravasation set i hver sektion af hjernen er vist for akustiske tryk på 0,36 MPa (n = 3), 0,52 MPa (n = 4), og 5,0 MPa (n = 1). Fejlbjælker viser standardafvigelser. Det andet panel viser et eksempel på kraftig røde blodlegemer ekstravasation fra hjernen udsat for 5,0 MPa (tilpasset fra Howles et al. 12).
Figur 6. Kvantitativ adfærdsmæssig testning blev anvendt til at vurdere aktiviteten, ophidselse og reaktionsevne før anæstesi, og 3 og 24 timer efter genvinding fra anæstesien. Pointsystemet, beskrevet tidligere 12, var baseret på veletablerede kvantitativ mus adfærdsmæssige vurdering udvikleed af Irwin i 1968 22. Den gennemsnitlige adfærd (± SEM) score for kontrol (n = 3) og BOMUS (0,36 MPa) behandlet (n = 8) dyr er vist. Forhold til præ-anæstesi basislinie, alle dyr udviser en reduktion i opførsel score 3 timer efter anæstesi, men hovedsagelig dækket af den næste dag. På hvert tidspunkt blev ikke observeret nogen forskel mellem de to grupper, hvilket indikerer, at BOMUS ikke måleligt påvirker dyrenes adfærd (tilpasset fra Howles et al. 12).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her blev en metode præsenteret for invasiv åbne BBB hele musen hjernen med ultralyd og mikrobobler (BOMUS). Med BBB åben + Mn 2 blev administreret, og aktiverings-induceret mangan-MRI (AIM MRI) blev anvendt til at afbilde neuronal respons på kortvarig stimulering let sederede mus.
Passende BBB åbning blev opnået med en spids-negativ akustisk tryk på 0,36 MPa. Bemærk, er trykket ved hovedbunden overflade ved midten af ultralydsstrålen. Målinger af en enkelt-element transducerens stråle profil viser, at det akustiske tryk i strålen kant er kun ca 0,12 MPa. Efterfølgende dæmpningen gennem kraniet reducerer trykket nå hjernen ved en anslået 25% (effektreduktion baseret på Choi et al. 23 og indstilles til frekvens). Dette indikerer, at BBB forstyrrelse skete på peak-negative akustiske tryk på 0,09 MPa (i midten af vores stråle) Til 0,03 MPa (ved kanten). Disse tryk er lavere end de niveauer (typisk 0,4-0,5 MPa) rapporteret andetsteds 24. Dette reducerede tryk tærskel kan være på grund af den højere dosis af lipid mikrobobler, der anvendes i dette arbejde (ca. 1,2 ml / kg) sammenlignet med andre. Medens dosen af brugte mikrobobler var højere end den anbefalede diagnostiske humane dosis (10 uL / kg) blev negative virkninger ikke observeret.
Som angivet her, BOMUS teknikken er noninvasive og reversibel, men det har potentiale til at forårsage skader. I tidligere arbejde 12 blev mus behandlet med BOMUS evalueret histologisk beskadigelse (figur 5) og adfærdsmæssige ændringer (figur 6). Top-negative akustiske tryk på 0,36 MPa var forbundet med nogen observerede negative virkninger (figur 6). Imidlertid blev 0,52-MPa BOMUS forbundet med et lille antal intracerebrale røde blodlegemer ekstravasation i en delmængde af dyrene ( Ligesom BOMUS teknik er potentielt skadelige, mangan også kendt toksicitet 25. Mn2 + vides at have toksiske virkninger på det neuromuskulære forbindelsespunkt 26 og nervesystemet 27. Dette toksicitet er sandsynligvis ansvarlig for somnolens af musene efter indgivelse, men mekanismen for denne virkning er ukendt. Til ca de første 60 minutters stimulering forbliver mus noget søvndyssende men stadig reagerer smertefulde stimuli, såsom en tå klemme. Dette tillader musen til at tolerere stimulering uden behovet for fysisk begrænsning. Det er vores erfaring, er dette somnolens tilstrækkelig til omkring 60 minutter, hvorefter dyret kan blive rastløs. Yderligere kemisk begrænsning kan være enchieved efter behov med cirka 15 sekunder med 5% isofluran via næsekegle. I denne demonstration lettet somnolens stimulering af vibrissae, men kan også have reduceret neuronal respons i cylinderen cortex. Ud over blot at administrere Mn2 + kan BOMUS teknik anvendes til globalt administrere andre diagnostiske eller terapeutiske midler. I tidligere arbejde har BOMUS blevet anvendt til administration af Gd-DTPA, et MRI-kontrastmiddel, til hjernen. 12 imidlertid mange ubesvarede spørgsmål om arten af BBB-permeabilitet opnået med BOMUS. Første er det ikke klart, hvilken størrelse midler er i stand til at passere BBB efter BOMUS. Begge Mn2 + og Gd-DTPA (500 Da) er forholdsvis små molekyler. Sekund, er det ikke klart, hvor meget af permeabiliteten af BBB varierer over hjernen. Tredje er det ikke klart, om BBB åbningen er en relativt binær kraft eller hvis visse åbning parametre kan påvirke størrelsen og hastigheden af materialegennemtrængning. Selvom Gd-DTPA fordeles nogenlunde jævnt gennem hjernen i ovennævnte undersøgelse, kan det have været for lille og for diffusible at afsløre eventuelle forskelle i permeabilitet. Trods disse usikkerheder med hensyn til BOMUS, er fremgangsmåden effektiv til hurtig indgivelse Mn2 + for at AIM-MRI. AIM-MR har været anvendt i mus til at kortlægge neuronal respons på lang sigt (1-2 dage) stimulation hos mus 28-30, men med denne nye tilgang, er kortfristede stimulering eksperimenter nu muligt. Tidligere hurtig administration af Mn2 + var kun muligt med osmotisk BBB forstyrrelser ved hjælp af en intracarotid infusion af hypertoniske mannitol. Denne fremgangsmåde var kun praktisk i rotter og større dyremodeller, men også i rotter, blev disse undersøgelser begrænset af invasivitet og unilaterality af teknikken. Fordi BOMUS kan udføres invasiv, bør vågen stimulation og longitudinelle studier nu være muligt. Endvidere becaanvendes Mn2 + kan administreres til begge cerebrale hemisfærer, en bredere vifte af stimulering paradigmer er mulige. I ovennævnte demonstration bilateralt administration Mn2 + tillod ustimulerede halvkugle at virke som en intern kontrol, således at neuronal respons på ikke-specifik baggrund stimulering kunne adskilles fra indsatsen mod ensidig vibrissae stimulering. Ud over at styre ikke-specifik baggrund stimulation også ustimulerede hemisfære blev anvendt til at kontrollere for ensartetheden af mangan administration. Som det ses i andre mangan MR-scanning eksperimenter 19, fordelingen data (fig. 4) indikerer, at BOMUS teknik ikke giver en homogen forøgelse af hjernen. Således, uden tilstrækkelig kontrol (kontrol-dyr eller en ustimuleret halvkugle), er regioner med højere baseline forbedring vanskelig at skelne fra regioner, hvis elementerdyrkede signal skyldes neuronal aktivitet. Selvom udgangspunktet Mn 2 + ekstraudstyr er ikke homogen, mønstret er ret konsekvent mellem individer. Ikke desto mindre, kunne mindre variationer i denne baseline forbedring tilsløre AIM-MRI-signal. I denne demonstration, behandlede vi dette potentielle problem som gennemsnittet af AIM-MRI signal over flere dyr. Alternativt, kunne forskelle i baseline forbedring tages højde for ved at købe pre-stimulering billeder. Metoden præsenteres her kræver en betydelig statistisk billedanalyse, hvilket igen kræver high-fidelity billede registrering. Selvfølgelig er en sådan registrering kun mening, hvis kilden data bliver registreret med en opløsning (i alle tre dimensioner), som er tilstrækkeligt finere end de strukturer af interesse. I denne demonstration, blev 3D-billeder erhvervet med næsten isotrope voxels omkring 160 mikrometer i hver dimension, som er tilladt for fremragendeanatomiske registrering. Ikke desto mindre kan billedet registrering begrænse den rumlige opløsning af denne metode, en lille fejlregistrering kunne gennemsnit-out meget små områder af ekstraudstyr. Lillehjernen og olfaktoriske pærer kan være særdeles vanskeligt at registrere, fordi de har et fint lag forbedring og er ofte ude af trit med cerebrum. Her har vi præsenteret en metode til kortlægning af neuronal reaktion på kortvarige stimuli i vågne mus. Selv om det ikke simpel, er metoden relativt praktiske og tilgængelige. Denne detaljerede diskussion af de begrænsninger og finesser skulle forhåbentlig gøre det muligt for læseren at anvende teknikken til deres egne eksperimentelle spørgsmål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Alt arbejde blev udført på Duke Center for In Vivo Microscopy, en NIH / NIBIB National Biomedical Technology Resource Center (P41 EB015897) og NCI Mindre Husdyrs Imaging Resource Program (U24 CA092656). Yderligere støtte blev givet fra NSF Graduate Research Fellowship (2003014921).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hydrophone | Sonora Medical Systems, Longmont, CA | SN S4-251 | |
| Translation stage | Newport Corporation, Irvine, CA | ||
| Ultrasound transducer | Olympus NDT, Inc., Waltham MA | A306S-SU | Review the manufacturer's test sheet that accompanies the transducer to find the exact center frequency of that particular transducer, which may differ from the nominal frequency listed in the catalog. (e.g., the nominal frequency of our transducer was 2.25 MHz, but the actual center frequency was 2.15 MHz.) |
| Vevo Imaging Station | VisualSonics, Inc. Toronto, Canada | ||
| 50 dB power amplifier | E&I, Rochester, NY | model 240L | |
| Signal generator | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | model 33220A | |
| MnCl2-(H2O)4 | Sigma | Molecular weight varies by batch, call manufacturer for exact measurement | |
| Perflutren lipid microspheres | Lantheus Medical Imaging, N. Billerica, MA | DEFINITY | |
| Microsphere agitator | Lantheus Medical Imaging, N. Billerica, MA | VIALMIX | |
| MR imaging coil | m2m Imaging Corp., Hillcrest, OH | 35 mm diameter quadrature transmit/receive volume coil | |
| MRI system | GE Healthcare, Milwaukee, WI | GE EXCITE console operating a 7-T horizontal bore magnet | |
| Image analysis environment | Visage Imaging, San Diego, CA, MathWorks, Natick MA | Amira MATLAB |
References
- Aoki, I. Detection of the anoxic depolarization of focal ischemia using manganese-enhanced MRI. Magnet. Reson. Med. 50, 7-12 (2003).
- Aoki, I. Dynamic activity-induced manganese-dependent contrast magnetic resonance imaging. DAIM MRI). Magnet. Reson. Med. 48, 927-933 (2002).
- Duong, T. Q., Silva, A. C., Lee, S. P., Kim, S. G. Functional MRI of calcium-dependent synaptic activity: Cross correlation with CBF and BOLD measurements. Magnet. Reson. Med. 43, 383-392 (2000).
- Lin, Y. J., Koretsky, A. P. Manganese ion enhances T-1-weighted MRI during brain activation: An approach to direct imaging of brain function. Magnet. Reson. Med. 38, 378-388 (1997).
- Lu, H. B. Cocaine-induced brain activation detected by dynamic manganese-enhanced magnetic resonance imaging (MEMRI). P. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 2489-2494 (2007).
- Drapeau, P., Nachshen, D. A. Manganese fluxes and manganese-dependent neurotransmitter release in presynaptic nerve-endings isolated from rat-brain. J. Physiol-London. 348, 493-510 (1984).
- Narita, K., Kawasaki, F., Kita, H. Mn and Mg influxes through Ca channels of motor-nerve Terminals are prevented by verapamil in Frogs. Brain Res. 510, 289-295 (1990).
- Hynynen, K., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F. A. Noninvasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits. Radiology. 220, 640-644 (2001).
- Sheikov, N., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F., Hynynen, K. Cellular mechanisms of the blood-brain barrier opening induced by ultrasound in presence of microbubbles. Ultrasound Med. Biol. 30, 979-989 (2004).
- McDannold, N., Vykhodtseva, N., Raymond, S., Jolesz, F. A., Hynynen, K. MRI-guided targeted blood-brain barrier disruption with focused ultrasound: Histological findings in rabbits. Ultrasound Med. Biol. 31, 1527-1537 (2005).
- McDannold, N., Vykhodtseva, N., Hynynen, K. Targeted disruption of the blood-brain barrier with focused ultrasound: association with cavitation activity. Phys. Med. Biol. 51, 793-807 (2006).
- Howles, G. P. Contrast-enhanced in vivo magnetic resonance microscopy of the mouse brain enabled by noninvasive opening of the blood-brain barrier with ultrasound. Magnet. Reson. Med. 64, 995-1004 (2010).
- Howles, G. P., Qi, Y., Johnson, G. A. Ultrasonic disruption of the blood-brain barrier enables in vivo functional mapping of the mouse barrel field cortex with manganese-enhanced MRI. Neuroimage. 50, 1464-1471 (2010).
- Woolsey, T. A., Welker, C., Schwartz, R. H. Comparative anatomical studies of sml face cortex with special reference to occurrence of barrels in layer-4. J. Comp. Neurol. 164, 79-94 (1975).
- Howles, G. P., Nouls, J. C., Qi, Y., Johnson, G. A. Rapid production of specialized animal handling devices using computer-aided design and solid freeform fabrication. J. Magnet. Reson. Imag. 30, 466-471 (2009).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , 2nd edn, Academic Press. (2001).
- Cross, D. J. Statistical mapping of functional olfactory connections of the rat brain in vivo. Neuroimage. 23, 1326-1335 (2004).
- Venot, A., Lebruchec, J. F., Golmard, J. L., Roucayrol, J. C. An automated-method for the normalization of scintigraphic images. J. Nucl. Med. 24, 529-531 (1983).
- Aoki, I., Naruse, S., Tanaka, C. Manganese-enhanced magnetic resonance imaging (MEMRI) of brain activity and applications to early detection of brain ischemia. Nmr. Biomed. 17, 569-580 (2004).
- Welker, E., Vanderloos, H. Quantitative correlation between barrel-field size and the sensory innervation of the whiskerpad - a comparative-study in 6 strains of mice bred for different patterns of mystacial vibrissae. J. Neurosci. 6, 3355-3373 (1986).
- McCasland, J. S., Woolsey, T. A. High-resolution 2-deoxyglucose mapping of functional cortical columns in mouse barrel cortex. J. Comp. Neurol. 278, 555-569 (1988).
- Irwin, S. Comprehensive observational assessment : A systematic quantitative procedure for assessing behavioral and physiologic state of mouse. Psychopharmacologia. 13, 222-257 (1968).
- Choi, J. J., Pernot, M., Small, S. A., Konofagou, E. E. Noninvasive, transcranial and localized opening of the blood-brain barrier using focused ultrasound in mice. Ultrasound Med. Biol. 33, 95-104 (2007).
- McDannold, N., Vykhodtseva, N., Hynynen, K. Use of ultrasound pulses combined with definity for targeted blood-brain barrier disruption: A feasibility study. Ultrasound Med. Biol. 33, 584-590 (2007).
- Silva, A. C., Lee, J. H., Aoki, L., Koretsky, A. R. Manganese-enhanced magnetic resonance imaging (MEMRI): methodological and practical considerations. Nmr. Biomed. 17, 532-543 (2004).
- Meiri, U., Rahamimoff, R. Neuromuscular transmission - inhibition by manganese ions. Science. 176, 308 (1972).
- Aschner, M., Guilarte, T. R., Schneider, J. S., Zheng, W. Manganese: Recent advances in understanding its transport and neurotoxicity. Toxicol. Appl. Pharm. 221, 131-147 (2007).
- Watanabe, T., Frahm, J., Michaelis, T. Manganese-enhanced MRI of the mouse auditory pathway. Magnet. Reson. Med. 60, 210-212 (2008).
- Yu, X., Wadghiri, Y. Z., Sanes, D. H., Turnbull, D. H. In vivo auditory brain mapping in mice with Mn-enhanced MRI. Nat. Neurosci. 8, 961-968 (2005).
- Yu, X. Statistical mapping of sound-evoked activity in the mouse auditory midbrain using Mn-enhanced MRI. Neuroimage. 39, 223-230 (2008).
