Summary
A yöntemi genel mikro-kabarcıkların ve ultrason ile fare kan-beyin bariyerini açılması için tarif edilmiştir. Bu teknik kullanılarak, manganez fare beyin için uygulanabilir. Manganez depolarize nöronlarda birikerek bir MR kontrast madde olduğundan, bu yaklaşım nöronal aktivitenin görüntüleme sağlar.
Abstract
Fareler nörobilim, farelerde işlevsel beyin görüntüleme genetik ve moleküler temelleri incelemek için egemen model sistem olmasına rağmen teknik açıdan zor kalır. Bir yaklaşım, Aktivasyon Bağlı Manganez kontrastlı MRG (AIM MRG), kemirgenler 1-5 nöronal aktivitenin eşleştirmek için başarıyla kullanılmaktadır. AIM MRG yılında, Mn 2 + kalsiyum analog davranır ve depolarize nöronlarda 6,7 birikir. Mn 2 + T 1 doku özelliğini kısaltır Çünkü, artmış nöronal aktivitenin bölgelerinde MRG'de artıracaktır. Dahası, Mn 2 + aktifleştirilmiş bölgelerden yavaş temizlenir ve bu nedenle, uyarılması daha deneysel bir esneklik sağlayan, önceden görüntüleme için mıknatıs dışında gerçekleştirilebilir. Ancak, Mn 2 + kolaylıkla özellikle farelerde kan-beyin bariyeri (KBB), BBB AIM MRG kullanımı sınırlı olan açmaya gerek, çapraz değil çünkü.
BBB açılması için tek araç olduğunu Ultrasound. Zararlı olsa ultrason gazlı kabarcıkların (yani, ultrason kontrast ajanlar) ile birlikte uygulandığında ise, BBB açılması için gerekli akustik basınç oldukça düşüktür. Ultrason ve kabarcıkların Bu kombinasyon güvenilir bir şekilde doku hasarının yol açmadan 8-11 bbb açmak için kullanılabilir.
Burada bir yöntem BBB açmak için mikro kabarcıklar ve ultrason kullanılarak MRG AIM gerçekleştirmek için sunulmuştur. Perflutren kabarcıkların intravenöz enjeksiyonu takiben, bir Odaksız darbeli ultrason dalgaları 3 dakika boyunca traş fare kafası için uygulanır. Kolaylık için, biz Mikrobaloncuklar ve BOMUS 12 olarak Ultrasound ile BBB Açılış bu tekniği bakın. Her iki serebral hemisfer boyunca BBB açmak için BOMUS kullanarak, manganez tüm fare beyin uygulanır. Hafif sedasyon farelerde deneysel stimülasyon sonra, AIM MRG nöronal yanıtı eşlemek için kullanılır.
IçinBu yaklaşım göstermek, burada BOMUS ve AIM MRG 13 hafif sedasyon farelerin burun kılı tek taraflı mekanik stimülasyonu eşleştirmek için kullanılır. BOMUS iki beyin yarı küresine boyunca bbb açabilir, çünkü, beyin unstimulated yan spesifik olmayan arka uyarılması için kontrol etmek için kullanılır. Elde edilen 3D aktivasyon haritası varil alan korteksin 14 burun kılı bölgelerinin yayınlanan temsilcilikleri ile de kabul eder. Bbb bir ultrasonik açılması, hızlı invaziv olmayan ve tersine çevrilebilir ve bu nedenle bu yaklaşım uyanık farelerde yüksek verim ve / veya uzunlamasına çalışmalar için uygundur.
Protocol
1. Ultrason Sistemi kurma ve kalibre
- Ultrason sistemi 2 MHz aralığında farenin beyin ve merkezi frekans kapsayacak kadar geniş bir çapa sahip tek bir eleman ultrason probu ile başlar. Transdüser ultrason darbe dizisi üreten bir sinyal jeneratörüne bağlı olan bir 50 dB-güç amplifikatörü tarafından tahrik edilir.
- Ultrason sisteminin akustik basınç kalibre edilmesi, sonuçta meydana gelen akustik basınç uygulanan gerilim ilişkili bir hidrofon kullanabilir. Hidrofon üzerinde bir su tankına transdüktör yerleştirin. Dönüştürücü basit bir darbe (örneğin, 10 Hz darbe tekrarlama frekansı ile transdüserin frekansta 10 döngüsü sinüzoidin) uygulayın. Transdüserin doğal odak (bizim 13 mm çapında 2.15 MHz transduser için yaklaşık 60 mm) ultrason demetinin merkezinde olmalıdır pik yanıtı bulmak için, 3-eksenli çeviri aşamasında kullanın.
- Çaldı üzerinde çeşitli ölçümler olunSistemin doğrusallık doğrulamak için girdi voltajı e (örn., 50-400 mV s). Giriş gerilimi ve akustik basıncı arasındaki ilişkiyi tahmin etmek için basit lineer regresyon kullanın. Bizim sistemde, 258 ve 167 mV pp giriş gerilimleri 0.52 ve 0.36 MPa pik negatif akustik baskılara karşılık geldi.
- Program sinyal jeneratörü 50000 patlama başına döngü ve 64 ms bir patlama dönemi ile transdüser frekansta sinüzoidal darbe patlamaları oluşan bir ultrason darbe dizisi üretmek için. Kalibrasyon ölçümleri dayanarak, dönüştürücü doğal odak merkezinde 0.36 MPa pik negatif akustik basınçları oluşturmak için darbe genlik ayarlayın.
2. Reaktifler hazırlayın
- 100 mM (300 mOsm) ve filtre sterilize bir konsantrasyonda steril suda manganez klorid tetrahidrat (MnCl 2 · 4H 2 O) içinde çözülür.
- "Activatin tarafından Perflutren Lipid mikroküreler üreting "45 s için üretici tarafından sağlanan karıştırıcı içinde flakon. deneylerin bir gün için tek bir şişe günün başlangıcında bir kez aktif ve günün geri kalanı için reaktivasyonu olmadan kullanılabilir.
- Mikroküre uygulamadan hemen önce mikroküreler tekrar süspansiyon için 1 dakika elle flakon çalkalayın. Bu kalan kabarcıkların alçaltır olarak tüpten kabarcıkların Geri çekerken, flakon içine oda hava enjekte etmemektedir. Günün son kullanıma kadar flakon dışarı bırakın ve sonra buzdolabında saklayın. Bu şekilde sürdürdü, tek bir şişe birkaç gün sürebilir. Önceki sonraki günlerde ilk kullanımdan, karıştırıcı saklı flakon yeniden etkinleştirin.
3. Hayvan Hazırlık
- Burun konisi tarafından teslim, izofluran ile hayvanları uyutmak. Burun konisi aparat aynı konumda her zaman hassas ve güvenilir hayvanın başını düzeltmek için dizayn edilmelidir. Bizim cihaz 15 th kafa tutare Paxinos beyin atlası 16 kullanılan "kafatası-düz" pozisyonu (yani, dorsal kafatası yüzeyi yatay). 85 ve 125 nefesleri dakika başına arasında bir solunum hızı korumak için anestezik titre edilir. Isı lambası veya hava üflemeli kullanarak vücut ısısını korumak. Yağ ile gözleri koruyun.
- Elektrikli bir düzeltici kullanarak fare derisi saç çıkarın.
- Bir kuyruk ven kateter ve intraperitoneal (IP) kateter yerleştirin. Sağkalım çalışmalar için, uygun steril tekniği kullanmak emin olun; Bu yazı için videomuzda IP kateter yerleştirilmesi sadece sivil hayatta deneyler için uygundur.
- Nöronal stimülasyon deney için gerekli olan tüm ek hazırlıkları yapmak. Namlu alan korteksin burun kılı stimülasyon haritalama için, tahriş folikül veya çevresindeki deri olmadan mümkün olduğunca yakın deri yüzeyine burun kılı kesmek için bir mikroskop ve mikrocerrahi makas kullanın.
- Yerleştirin ultrason jelisaçlı deri ve sonra baş üstüne ince bir plastik levha (örneğin, 7.6 mikron çöp çöp torbası) tarafından bulunan düşük bir su sütunu. Ultrason jeli içinde sıkışıp olsun hava kabarcığı dışarı itmek için bir pamuk uçlu çubuk ile su sütunu ile ulaşın. Fareyi doğrudan beyin üstü su sütununda doğal odak mesafesi (58 mm) ve ultrason probu yerleştirin ve herhangi bir hava kabarcığı kaldırmak için bir parmak ucu ile transdüser silin.
4. Mikrobaloncuklar ve Ultra Sound (BOMUS) ile kan-beyin bariyeri Açılış
- 0,5 mmol / kg IP dozunda manganez çözeltinin bir intraperitonal enjeksiyon verir. Manganez akmaya ve (Şekil 1) dağıtmak için izin 10 dakika beklemez yani periton kateteri kap.
- BBB açmak için kuyruk damarından kateter ile Perflutren Lipid mikroküreler (aktive DEFINITY) 30 uL yönetmek ve aynı anda, ultrason darbe dizisi başlatabilir. C3 dakika boyunca insonification ontinue.
5.. Nöronal Stimülasyon
- Mn 2 beyin düzeyleri için yaklaşık 40 dakika bekleyin + sinirsel uyarılma başlamadan önce stabilize etmek. Bu şekilde, Mn 2 nedeniyle donanımın dramatik bir baz bbb boyunca + difüzyon uyarılması sonucu ince bir ayırıcı geliştirme ayırt edilebilir. Daha sonra, seçtiğiniz paradigma (Şekil 1) ile stimülasyon başlar.
- Burun kılı uyarılması için, izofluran kapatın ve burun konisi kaldırın. Deriye yaklaşık 2-5 mm uzaklıkta burun kılı dizi boyunca dairesel bir hareket (1-5 Hz) elle yumuşak bir sanatçının fırça taşıyın. 90 dakika süre ile uyarılması devam etmektedir. Manganez hayvan sınırsız stimülasyon sağlayan bir sakinleştirici etkisi vardır. Hayvan huzursuz olursa, yaklaşık 15 saniye süreyle burun konisi ile izofluran% 5 yönetmek.
6. Magnetic Rezonans Görüntüleme
- Stimülasyon sonra, burun konisi ile anestezi devam. Vücut ısısını korumak ve 85-125 nefesleri dakika başına bir solunum hızı için izofluran düzeyini titre devam edin.
- Bir MR bobin fare yerleştirin ve MRG sistemine aktarabilirsiniz. Yüksek çözünürlüklü 3D T 1 ağırlıklı MR görüntüleri elde edin. Örneğin, aşağıdaki parametreleri ile eko (SPGR) dizisini hatırlattı 3D spoiled gradient kullanın:; 2 ms eko zaman; 30 derecelik çevirme açısı; 15.63 kHz bant genişliği; 25 ms tekrarlama süresi 20 bakış × 20 × alanı 12 mm, 128 × 128 × 60 matrisi.
7. Image Analysis
- Görüntü analizi, kullanılan uyarı paradigma özgüdür. Burun kılı stimülasyon deneme için (Şekil 2), uygun bir analiz ortamı içine birkaç hayvanların görüntüleri aktarmak. Diğerleri sol, fl ile motive ederken, bazı hayvanların sağ uyarılmış olsaydıip tüm görüntüleri etkili bir "sol-uyarılmış." olduğunu bu nedenle bazı Sonra, onun kontralateral unstimulated tarafına her beynin uyarılan tarafı karşılaştırmak için, bir çoğaltılamaz ve sola unstimulated görüntü kümesi oluşturulur yansıtılmış oluşturun. Ortak bir alana tüm görüntüleri kayıt ve daha sonra bir 3 × 3 × 3 piksel Gauss çekirdek onları düzeltmek.
- Böyle MATLAB gibi bir matematiksel analiz çevre, veri verir. İsteğe bağlı olarak, veri setleri alakasız anatomi maskeleyebilir. Venot ark iteratif yöntemi ile görüntülerin yoğunluğu-normalize. 17,18.
- Her beyin unstimulated tarafta karşılık gelen karşı voksel her beyin uyarılmış kenarlarının her voksel karşılaştırmak için bir eşleştirilmiş, tek-yönlü t testi kullanabilir.
- Diferansiyel faaliyet bölgeleri (Şekil 3) tanımlamak için sonuç p-değeri haritasını görüntüleyin.
8. Temsilcisi Sonuçlar
Burada sunulan yöntemi iki fonu var amental adımları: Mikrobaloncuklar ve Ultrasound (BOMUS) ile (1) BBB Açılış ve (2) Aktivasyon Bağlı Manganez kontrastlı MRG (AIM MRG). Sonraki aşamanın eski bağlıdır, bunun nedeni başarılı bir şekilde uygulanması BOMUS doğrulamak için önemlidir.
T 1-kısalma kontrast madde (örneğin manganez veya gadolinyum bazlı ajan olarak) T beyin dokusunda bir sinyal artışı 1-ağırlıklı görüntüleme sonuçlarının uygulanmasından sonra kan-beyin bariyerinin bozulması beyinleri göre hangi BOMUS içinde (Şekil 4) yapılmadı. Bu hayvanlar arasında oldukça tutarlı olmasına rağmen, bu manganez donanımın dağıtımı, tamamen aynı değildir. Bbb dağıtım deliğine sadece homojen olmayan yansıtır, fakat, aynı zamanda beyin içindeki 19 Mn intrinsik düzgün olmayan bir dağıtımdır. BBB açılış zamansal ve mekansal dinamikleri daha önce 12 tarif edilmiştir.
ent "> BOMUS başarıyla uygulanmaktadır edildikten sonra, bir sonraki adım AIM MRG gerçekleştirmek için pek çok deneysel paradigmalar mümkündür;.. Ancak, birçok potansiyel karıştırıcı etkileri, kontrol ve analiz olduğundan dikkatle tasarlanmış olmalıdır Karıştırma etkisi homojen BBB açılması dahil, beyin, Mn difüzyon zamansal dinamiği ve nonspesifik nöronal aktivitedeki Mn homojen olmayan bir birikimi. Bu gösteri de, burun kılı tek taraflı uyarılması nöronal yanıt haritası çizilmiştir. homojen olmayan düzensizlikleri ve Mn akı, her beynin unstimulated tarafı dikkate almak için Dahili bir kontrol olarak kullanılmıştır. hayvanlar arasında değişebilir spesifik olmayan nöronal aktivitenin dikkate almak için, hayvanlar analizi (Şekil 2) arasında sürekli farklı olduğu bölgelerin tanımlanması için istatistiksel test kullanılabilir. sonuçlar, üç boyutlu bir farklılık haritası ve bir edildi , üç boyutlu bir p-haritası değerine (Şekil 3), bölgeler belirtildiği üzere sağ tarafındauyarılmış burun kılı kontralateral yüksek sinyal. Haritanın sol tarafında bölgeleri uyarılmış burun kılı ipsilateral anlamlı derecede yüksek sinyal içinde olduğu belirtilir. P-değeri haritası yanıt stimülasyon yoğun elektrofizyoloji 20,21 ve 2-deoksiglukoz çalışmalarla belgelenmiştir burun kılı için primer duyusal kortekste, varil alanına tekabül uyarılmış burun kılı kontralateral yüksek sinyal geniş bir bölgeyi belirledi. Bu sonuçlar daha kapsamlı bir tartışma daha önce 13 yayımlanmıştır.
Şekil 1. BOMUS ve AIM MRG (Howles ark uyarlanmıştır. 13) ile fonksiyonel beyin görüntüleme için protokol zaman çizelgesi.
Bölgeler o belirlenmesi için Şekil 2. Analiz şemasıHer beyin uyarılır ve unstimulated taraf arasındaki f farklı yoğunluk. Onun kontralateral unstimulated tarafına her beynin uyarılan tarafı karşılaştırmak için, çoğaltılamaz ve sola unstimulated görüntü kümesi oluşturulur yansıyor. Bu görüntüler, kayıtlı filtre ve normalize edilir. Son olarak, testinde sol uyarılmış ve sola unstimulated görüntüleri karşılaştırır. Her beyin uyarılmış yan yalnızca aynı beyin unstimulated yan göre, böylece t testi "eşleştirilmiş" edilir. T testi p değeri haritanın diğer tarafında bir unstimulated tarafında daha yüksek sinyal gösterir iken p-değeri haritası bir tarafında, beynin uyarılan tarafında daha yüksek sinyal gösterir ve böylece "tek kuyruklu" dir beyin (Howles ark uyarlanmıştır. 13).
Şekil 3. Iki farklı pozisyonlarda eksenel 7 hayvanların havuzlanmış analizi sonuçları. T O ilk sütun etkili tüm farelerin sol burun kılı uyarılan vardı, böylece hizalanmış tüm kayıtlı görüntülerin ortalama gösterir. Bu görüntüler, kontralateral hemisferde her voksel göreceli sinyal ortalama yüzde artış gösteren bir renk haritası ile overlaid olarak renk çubuğu ile gösterilir. Uyarılmasına kontralateral hemisferde yüksek sinyal vardı burada görüntünün sağ tarafında renkli bölgeleri göstermektedir. Stimülasyonu ipsilateral hemisferde yüksek sinyal vardı burada görüntünün sol tarafında renkli bölgeleri göstermektedir. İkinci sütun sinyali artışın istatistiksel anlamlılık gösteren p-değeri haritası ile kaplanmış aynı görüntüleri gösterilmektedir. Üçüncü sütun (Howles ark uyarlanmıştır. 13) gölgeli duyusal korteksin varil alanları ile Paxinos stereotaksik atlas 16 karşılık gelen rakamlar üzerine işlenmiş aynı p-değeri haritasını gösterir.
/ 4055/4055fig4.jpg "/>
Şekil 4. + Beyin Mn 2 mekansal dağılımı. Görüntüler (n = 5) ve kontrol (n = 4) farelerin BOMUS muamele 0.5 mmol / kg IP MnCl 2 sonra 170 dakika satın alındı. Normalleşme sonra, ortalama ve standart sapma haritaları (sol panel) hesaplandı. Geliştirme BOMUS ile tedavi edilen farelerde daha fazlaydı. Bu geliştirme beyin boyunca tek değildi rağmen, beyin ve ventriküllerin kenarlarına yakın dışında, oldukça uyumlu idi. Çeşitli yapılar etrafında çizilen ilgi alanları (ROI) kullanarak, ortalama SNR (+ 1 SD) Her grup (sağ panel) üzerinden hesaplandı. BOMUS tedavi edilen hayvanların büyük SNR gösterdi ama aynı zamanda yapılar arasında ve hayvanlar arasındaki büyük farkı (Howles ark uyarlanmıştır. 13).
Şekil 5. BOMUS doku etkilerini incelemek için, BOMUS tedavi edilen farelerin beyinlerinde tespit edildi, se500 ctioned - mikron aralıklarla ve hematoksilen ve eosin ile boyandı. Beynin, her bölümde görülen kırmızı kan hücresi Ekstravazasyon ortalama sayısına 0.36 MPa (n = 3), 0.52 MPa (n = 4), ve 5,0 MPa (n = 1) akustik basınçlar için gösterilmiştir. Hata çubukları standart hata gösteriyor. İkinci panel 5.0 MPa (Howles ark uyarlanmıştır. 12) maruz beyinden gelen ağır kırmızı kan hücresi tahliyesini bir örneğini göstermektedir.
Şekil 6.. Kantitatif davranış testi anestezi öncesi aktivite, uyarılma ve reaksiyonunu değerlendirmek için kullanılan, 3 ve 24 saat Anesteziden sonra oldu. Skorlama sistemi, daha önce 12 açıklanan köklü kantitatif fare davranışsal değerlendirme geliştirmeye dayanmaktadır1968 22 Irwin tarafından ed. Ortalama davranış (± SEM) kontrolü için skor (n = 3) ve BOMUS (0.36 MPa) tedavi edilen (n = 8) hayvanlara gösterilmiştir. Öncesi anestezi taban göre, bütün hayvanlar 3 saat sonra anestezi Davranış puanı bir düşüş gösterir, ancak büyük ölçüde sonraki gün kurtarabilirsiniz. Her zaman noktasında, hiçbir fark BOMUS ölçülebilir hayvan davranışları (Howles ark uyarlanmıştır. 12) üzerinde etkili olmadığını belirten, iki grup arasında görüldü.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada bir yöntem noninvaziv ultrason ve kabarcıkların (BOMUS) ile tüm fare beyin boyunca BBB açılması için sunuldu. BBB açıkken, Mn 2 + uygulandı ve aktivasyon bağlı manganez kontrastlı MRG (AIM MRG) hafif sedasyon farelerde kısa süreli stimülasyon görüntü nöronal yanıtı için kullanıldı.
Yeterli BBB açılış 0.36 MPa pik negatif akustik basınç elde edildi. Not, bu ultrason ışının merkezinde derisi yüzeyinde basıncıdır. Tek eleman transdüserin profil kiriş ölçümleri demeti kenarında akustik basınç sadece 0.12 MPa olduğunu göstermektedir. Daha sonra, kafa tası içine zayıflatma yaklaşık% 25 oranında beyne basıncını azaltır (23. Choi ve ark dayalı düşürme ve frekans için düzeltilmiş). Bu durum, bbb bozulması (bizim kirişlerin merkezinde 0,09 MPa pik-negatif akustik basınçlarda meydana gösterir) 0.03 MPa (kenarında) için. Bu baskılar başka bir yerde 24 rapor düzeyleri (genellikle 0,4-0,5 MPa) daha düşüktür. Bu düşük basınç eşik diğerlerine göre bu işi (yaklaşık 1.2 ml / kg) kullanılan lipid kabarcıkların yüksek doz nedeniyle olabilir. Kullanılan mikro kabarcık dozu önerilen tanı insan dozunun (10 uL / kg) daha yüksek iken, olumsuz etkileri görülmedi.
Burada belirtildiği gibi, BOMUS tekniği noninvaziv ve geri dönüşümlü olan, fakat zarar potansiyeline sahiptir. Önceki iş 12 yılında, BOMUS ile tedavi edilen farelerde histolojik hasarı (Şekil 5) ve davranış değişiklikleri (Şekil 6) değerlendirildi. 0.36 MPa Tepe-negatif akustik basınçları hiçbir gözlenen olumsuz etkileri (Şekil 6) ile ilişkili bulunmuştur. Ancak, 0.52-MPa BOMUS hayvanların bir alt kümesi intraserebral kırmızı kan hücresi ekstravazasyonlar küçük bir sayı ile ilişkili bulunmuştur ( BOMUS tekniği zararlı olduğu gibi, manganez de toksisite 25 tanınmış bulunmaktadır. Mn 2 +, nöromüsküler kavşağın 26 ve sinir sistemi 27 üzerinde toksik etkileri olduğu bilinmektedir. Bu etki mekanizması bilinmemektedir olsa Bu toksisite, uygulamadan sonra farelerin uyku hali için muhtemel sorumludur. Stimülasyon yaklaşık ilk 60 dakika için, fare biraz uyuklamak ama böyle bir ayak tutam olarak ağrılı uyaranlara karşı hala duyarlı kalır. Bu, fare fiziksel kısıtlama için gerek kalmadan uyarılması tolere sağlar. Deneyimlerimiz, bu uyuklama hayvan huzursuz olabilir bundan sonra yaklaşık 60 dakika yeterlidir. Ek kimyasal bir kısıtlama olabilirroket ucu konisi ile izofluran% 5 15 saniye ile gerektiği gibi chieved. Bu gösterilmesinde, uyku hali burun kılı ile uyarılması kolaylaştırılmaktadır, fakat, aynı zamanda varil kortekste nöronal yanıt azaltılmış olabilir. Basitçe Mn 2 + tatbik ek olarak, genel yöntem BOMUS diğer teşhis ya da tedavi edici ajanlar yönetmek için kullanılabilir. Önceki çalışmada, BOMUS beyne Gd-DTPA, bir MR kontrast madde, yönetmek için kullanılır olmuştur. Yine 12, birçok soru BOMUS ile elde KBB geçirgenliğinin doğası hakkında kalır. Birincisi, boyut ajanlar BOMUS sonra BBB geçememişti ne belli değil. Mn 2 + ve Gd-DTPA (500 Da) oldukça küçük moleküllerdir. İkincisi, KBB geçirgenliği beyin üzerinden değişir ne kadar açık değildir. Üçüncüsü, BBB açılış nispeten ikili etkisi olup olmadığı açık değildir, ya da bazı açılış parametrelerinin malzemenin boyut veya oranını etkiler eğergeçirgenlik. Gd-DTPA Yukarıdaki çalışmada beyin aracılığıyla oldukça eşit dağıtılmış olsa da, geçirgenlik tüm farklılıkları ortaya çıkarmak için çok küçük ve çok difüze olabilir. BOMUS ile ilgili olarak, bu belirsizlikler rağmen, yöntem hızlı + AMACI-MR amacı için Mn 2 verilmesi için etkindir. AIM-MR 28-30 farelerde uzun süreli (1-2 gün) uyarılması nöronal yanıtı eşlemek için farelerde kullanılan, ancak bu yeni yaklaşım ile, kısa süreli stimülasyon deneyler yapmak mümkün olmuştur. Daha önce, Mn 2 hızlı uygulama + hipertonik mannitol bir intracarotid infüzyon kullanarak osmotik BBB kesinti ile mümkün oldu. Bu yaklaşım, sıçanlar ve büyük hayvan modellerinde sadece pratik, ama bile sıçanlarda, bu çalışmalar teknik invaziv ve tek taraflılık ile sınırlı kalmıştır. BOMUS noninvaziv yapılabilir Çünkü, uyanık uyarılması ve uzunlamasına çalışmalar artık mümkün olmalıdır. Dahası, becaMn 2 + kullanabilirsiniz hem hemisferdeki için uygulanabilir, stimülasyon paradigmalar daha geniş mümkündür. Yukarıdaki gösteriye, ikili yönetim Mn 2 + unstimulated yarımküre spesifik olmayan arka plan uyarılması nöronal yanıtı tek taraflı burun kılı uyarılmasına tepki ayrılmış olabilir, böylece bir iç kontrol gibi davranmasını sağladı. Spesifik olmayan arka uyarılması için kontrol etmenin yanı sıra, unstimulated hemisferin de mangan idaresi homojenliği ve kıvamı için kontrol etmek için kullanıldı. Diğer mangan-geliştirilmiş MRI deneyler 19 'de görüldüğü gibi, dağıtım verileri (Şekil 4) BOMUS tekniğin beyin homojen bir iyileştirme sağlamaz göstermektedir. Böylece, yeterli denetim (kontrol hayvanlarına veya unstimulated yarımkürede) olmadan, daha yüksek başlangıç donanım ile bölgeler olan ele bölgelerden ayırt etmek zordurcihaz kendisi sinyali nöronal aktivitenin kaynaklanmaktadır. Temel Mn 2 + geliştirme homojen değildir, desen bireyler arasında oldukça tutarlı olmasına rağmen. Bununla birlikte, bu temel geliştirme yılında küçük değişiklerle AIM-MRG sinyal gizleyebilecek. Bu gösteri, biz çeşitli hayvanlar üzerinde AIM-MRG sinyal ortalamasının Bu olası sorunu ele aldı. Alternatif olarak, temel donanım farklılıkları ön-uyarı görüntüler alarak sorumluydu olabilir. Burada sunulan yöntem sırayla, yüksek kalitede görüntü kaydı gerektiren önemli bir istatistik görüntü analizi gerektirir. Kaynak veri ilgi yapılara göre yeterince ince bir çözünürlük (üç boyutlu) ile alınmış ise Tabii ki, böyle kaydı anlamlıdır. Bu gösteride, 3D görüntüleri yaklaşık izotropik vokseller ile mükemmel için izin verilen her boyut yaklaşık 160 mikron elde edildianatomik kaydı. Bununla birlikte, görüntü kaydı donanımın bu yöntem-hafif bir yanlış ayar olabilir ortalama-out çok küçük bölgelerin uzaysal çözünürlüğü sınırlayabilir. Bir ince katmanlı geliştirme var ve beyin ile uyum genellikle çünkü beyincik ve koku ampuller, kayıt olmak için özellikle zor olabilir. Burada, uyanık farelerde kısa süreli uyaranlara nöronal yanıtı eşlemek için bir yöntem sunduk. Basit olmasa da, yöntem nispeten pratik ve ulaşılabilir. Sınırlamalar ve inceliklerini bu ayrıntılı tartışma umarım okuyucunun kendi deneysel sorulara tekniği uygulamak için imkan vermelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Tüm çalışmalar Vivo Mikroskopi olarak için Duke Center, NIH / NIBIB yapıldı Ulusal Biyomedikal Teknoloji Kaynak Merkezi (P41 EB015897) ve NCI Küçük Hayvan Görüntüleme Kaynak Programı (U24 CA092656). Ek destek NSF Yüksek Lisans Araştırma Bursu (2003014921) temin edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hydrophone | Sonora Medical Systems, Longmont, CA | SN S4-251 | |
| Translation stage | Newport Corporation, Irvine, CA | ||
| Ultrasound transducer | Olympus NDT, Inc., Waltham MA | A306S-SU | Review the manufacturer's test sheet that accompanies the transducer to find the exact center frequency of that particular transducer, which may differ from the nominal frequency listed in the catalog. (e.g., the nominal frequency of our transducer was 2.25 MHz, but the actual center frequency was 2.15 MHz.) |
| Vevo Imaging Station | VisualSonics, Inc. Toronto, Canada | ||
| 50 dB power amplifier | E&I, Rochester, NY | model 240L | |
| Signal generator | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | model 33220A | |
| MnCl2-(H2O)4 | Sigma | Molecular weight varies by batch, call manufacturer for exact measurement | |
| Perflutren lipid microspheres | Lantheus Medical Imaging, N. Billerica, MA | DEFINITY | |
| Microsphere agitator | Lantheus Medical Imaging, N. Billerica, MA | VIALMIX | |
| MR imaging coil | m2m Imaging Corp., Hillcrest, OH | 35 mm diameter quadrature transmit/receive volume coil | |
| MRI system | GE Healthcare, Milwaukee, WI | GE EXCITE console operating a 7-T horizontal bore magnet | |
| Image analysis environment | Visage Imaging, San Diego, CA, MathWorks, Natick MA | Amira MATLAB |
References
- Aoki, I. Detection of the anoxic depolarization of focal ischemia using manganese-enhanced MRI. Magnet. Reson. Med. 50, 7-12 (2003).
- Aoki, I. Dynamic activity-induced manganese-dependent contrast magnetic resonance imaging. DAIM MRI). Magnet. Reson. Med. 48, 927-933 (2002).
- Duong, T. Q., Silva, A. C., Lee, S. P., Kim, S. G. Functional MRI of calcium-dependent synaptic activity: Cross correlation with CBF and BOLD measurements. Magnet. Reson. Med. 43, 383-392 (2000).
- Lin, Y. J., Koretsky, A. P. Manganese ion enhances T-1-weighted MRI during brain activation: An approach to direct imaging of brain function. Magnet. Reson. Med. 38, 378-388 (1997).
- Lu, H. B. Cocaine-induced brain activation detected by dynamic manganese-enhanced magnetic resonance imaging (MEMRI). P. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 2489-2494 (2007).
- Drapeau, P., Nachshen, D. A. Manganese fluxes and manganese-dependent neurotransmitter release in presynaptic nerve-endings isolated from rat-brain. J. Physiol-London. 348, 493-510 (1984).
- Narita, K., Kawasaki, F., Kita, H. Mn and Mg influxes through Ca channels of motor-nerve Terminals are prevented by verapamil in Frogs. Brain Res. 510, 289-295 (1990).
- Hynynen, K., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F. A. Noninvasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits. Radiology. 220, 640-644 (2001).
- Sheikov, N., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F., Hynynen, K. Cellular mechanisms of the blood-brain barrier opening induced by ultrasound in presence of microbubbles. Ultrasound Med. Biol. 30, 979-989 (2004).
- McDannold, N., Vykhodtseva, N., Raymond, S., Jolesz, F. A., Hynynen, K. MRI-guided targeted blood-brain barrier disruption with focused ultrasound: Histological findings in rabbits. Ultrasound Med. Biol. 31, 1527-1537 (2005).
- McDannold, N., Vykhodtseva, N., Hynynen, K. Targeted disruption of the blood-brain barrier with focused ultrasound: association with cavitation activity. Phys. Med. Biol. 51, 793-807 (2006).
- Howles, G. P. Contrast-enhanced in vivo magnetic resonance microscopy of the mouse brain enabled by noninvasive opening of the blood-brain barrier with ultrasound. Magnet. Reson. Med. 64, 995-1004 (2010).
- Howles, G. P., Qi, Y., Johnson, G. A. Ultrasonic disruption of the blood-brain barrier enables in vivo functional mapping of the mouse barrel field cortex with manganese-enhanced MRI. Neuroimage. 50, 1464-1471 (2010).
- Woolsey, T. A., Welker, C., Schwartz, R. H. Comparative anatomical studies of sml face cortex with special reference to occurrence of barrels in layer-4. J. Comp. Neurol. 164, 79-94 (1975).
- Howles, G. P., Nouls, J. C., Qi, Y., Johnson, G. A. Rapid production of specialized animal handling devices using computer-aided design and solid freeform fabrication. J. Magnet. Reson. Imag. 30, 466-471 (2009).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , 2nd edn, Academic Press. (2001).
- Cross, D. J. Statistical mapping of functional olfactory connections of the rat brain in vivo. Neuroimage. 23, 1326-1335 (2004).
- Venot, A., Lebruchec, J. F., Golmard, J. L., Roucayrol, J. C. An automated-method for the normalization of scintigraphic images. J. Nucl. Med. 24, 529-531 (1983).
- Aoki, I., Naruse, S., Tanaka, C. Manganese-enhanced magnetic resonance imaging (MEMRI) of brain activity and applications to early detection of brain ischemia. Nmr. Biomed. 17, 569-580 (2004).
- Welker, E., Vanderloos, H. Quantitative correlation between barrel-field size and the sensory innervation of the whiskerpad - a comparative-study in 6 strains of mice bred for different patterns of mystacial vibrissae. J. Neurosci. 6, 3355-3373 (1986).
- McCasland, J. S., Woolsey, T. A. High-resolution 2-deoxyglucose mapping of functional cortical columns in mouse barrel cortex. J. Comp. Neurol. 278, 555-569 (1988).
- Irwin, S. Comprehensive observational assessment : A systematic quantitative procedure for assessing behavioral and physiologic state of mouse. Psychopharmacologia. 13, 222-257 (1968).
- Choi, J. J., Pernot, M., Small, S. A., Konofagou, E. E. Noninvasive, transcranial and localized opening of the blood-brain barrier using focused ultrasound in mice. Ultrasound Med. Biol. 33, 95-104 (2007).
- McDannold, N., Vykhodtseva, N., Hynynen, K. Use of ultrasound pulses combined with definity for targeted blood-brain barrier disruption: A feasibility study. Ultrasound Med. Biol. 33, 584-590 (2007).
- Silva, A. C., Lee, J. H., Aoki, L., Koretsky, A. R. Manganese-enhanced magnetic resonance imaging (MEMRI): methodological and practical considerations. Nmr. Biomed. 17, 532-543 (2004).
- Meiri, U., Rahamimoff, R. Neuromuscular transmission - inhibition by manganese ions. Science. 176, 308 (1972).
- Aschner, M., Guilarte, T. R., Schneider, J. S., Zheng, W. Manganese: Recent advances in understanding its transport and neurotoxicity. Toxicol. Appl. Pharm. 221, 131-147 (2007).
- Watanabe, T., Frahm, J., Michaelis, T. Manganese-enhanced MRI of the mouse auditory pathway. Magnet. Reson. Med. 60, 210-212 (2008).
- Yu, X., Wadghiri, Y. Z., Sanes, D. H., Turnbull, D. H. In vivo auditory brain mapping in mice with Mn-enhanced MRI. Nat. Neurosci. 8, 961-968 (2005).
- Yu, X. Statistical mapping of sound-evoked activity in the mouse auditory midbrain using Mn-enhanced MRI. Neuroimage. 39, 223-230 (2008).
