Summary
Wordt een techniek beschreven voor het in grote lijnen het openen van de bloed-hersen barrière in de muis met behulp van microbellen en ultrageluid. Met deze techniek kan mangaan worden toegediend aan de hersenen van muizen. Omdat mangaan is een MRI-contrastmiddel dat zich ophoopt in gedepolariseerd neuronen, deze aanpak maakt beeldvorming van neuronale activiteit.
Abstract
Hoewel muizen zijn het dominante modelsysteem voor het bestuderen van de genetische en moleculaire onderbouwing van de neurowetenschappen, functionele neuroimaging bij muizen blijft technisch uitdagend. Een benadering, activatie geïnduceerde Mangaan-versterkte MRI (AIM MRI), is met succes gebruikt om de neuronale activiteit in knaagdieren 1-5 in kaart te brengen. In AIM MRI, Mn 2 + werkt een calcium-analoog en hoopt zich op in neuronen gedepolariseerd 6,7. Omdat Mn 2 + verkort de T 1 weefsel eigendom, zal de regio's van verhoogde neuronale activiteit versterken in MRI. Bovendien Mn 2 + gewist langzaam uit de geactiveerde gebieden en daarom stimulatie dan buiten de magneet voor beeldvorming, waardoor een grotere flexibiliteit experimentele. Echter, omdat Mn 2 + passeert niet gemakkelijk de bloed-hersen barrière (BBB), de noodzaak het openen van de BBB is het gebruik van AIM MRI beperkt, met name bij muizen.
Een tool voor het openen van de BBB is ULTrasound. Hoewel potentieel schadelijke, als echografie wordt toegediend in combinatie met gas gevulde microbolletjes (dat wil zeggen, ultrageluid contrastmiddelen), de akoestische druk die nodig is voor BBB opening is aanzienlijk lager. Deze combinatie van ultrageluid en microbolletjes worden gebruikt om betrouwbaar de BBB openen weefselschade zonder dat 8-11.
Hier wordt een methode gepresenteerd voor het uitvoeren van AIM MRI met behulp van microbellen en ultrageluid om de BBB te openen. Na een intraveneuze injectie van perflutren microbellen, wordt een ongericht gepulste ultrasoonbundel toegepast op de geschoren muis hoofd voor 3 minuten. Voor de eenvoud, verwijzen we naar deze techniek van BBB Opening met Microbelletjes en echografie als BOMUS 12. Met behulp van BOMUS om de BBB te openen in beide hersenhelften, is mangaan toegediend aan de hele hersenen van muizen. Na het experimentele stimulatie van de licht verdoofde muizen, wordt AIM MRI gebruikt om de neuronale respons in kaart te brengen.
Naartonen deze benadering worden hierin BOMUS en AIM MRI gebruikt om eenzijdige mechanische stimulatie van de vibrissae in licht verdoofd muizen 13 in kaart te brengen. Omdat BOMUS kan de BBB openen in beide halfronden, wordt de niet-gestimuleerde kant van de hersenen gebruikt om te bepalen voor het niet-specifieke achtergrond stimulatie. De resulterende 3D-activering kaart komt goed overeen met de gepubliceerde voorstellingen van de vibrissae regio's van het vat veld cortex 14. De ultrasone opening van de BBB is snel, niet-invasieve en reversibele, en dus deze aanpak geschikt is voor high-throughput en / of longitudinale studies in wakkere muizen.
Protocol
1. Monteer en Kalibreren Ultrasound System
- De ultrasone systeem begint met een element ultrageluidtransducent met een diameter breed genoeg muizenhersenen en een centrale frequentie in het bereik van 2 MHz dekken. De omzetter wordt aangedreven door een 50 dB-eindversterker, die verbonden is met een signaalgenerator dat de ultrasone pulssequentie produceert.
- Om de geluidsdruk van de ultrasone kalibreren Gebruik een hydrofoon van de aangelegde spanning betrekking op de verkregen geluidsdruk. Plaats de transducer in een watertank op de hydrofoon. Breng een eenvoudige puls (bijvoorbeeld een 10-cyclus sinusoïde bij frequentie de transducer met pulsherhalingsfrequentie van 10 Hz) naar de transducer. Gebruik een 3-as vertaling fase van de grootste gevoeligheid, die moet worden in het midden van de geluidsbundel van natuurlijke transducer focus (ongeveer 60 mm voor de 13 mm diameter 2,15 MHz transducer) vinden.
- Maak meerdere metingen over een beldee ingangsspanningen (bijvoorbeeld 50 tot 400 mV pp) de lineariteit van het systeem te controleren. Gebruik een eenvoudige lineaire regressie naar de relatie tussen de ingangsspanning en de geluidsdruk te schatten. In ons systeem, ingangsspanningen van 258 en 167 mV pp overeen met piek-negatieve akoestische druk van 0,52 en 0,36 MPa.
- Programmeer de signaalgenerator aan een echo pulssequentie bestaande uit uitbarstingen van sinusvormige pulsen op de transducer frequentie 50.000 cycli per burst en een burst periode van 64 ms te produceren. Gebaseerd op de ijkmetingen stelt de pulsamplitude-tot-piek-negatieve akoestische druk van 0,36 MPa in het midden van de natuurlijke transducer focus genereren.
2. Bereid de reagentia
- Los mangaanchloride tetrahydraat (MnCl2 · 4H 2 O) in steriel water in een concentratie van 100 mM (300 mOsm) en filter steriliseren.
- Maak de perflutren lipide microsferen door "activating "de flacon in de fabrikant geleverde roerder 45 s. Een dag experimenten kan een flacon eenmaal geactiveerd bij het begin van de dag en gebruikt zonder reactivering de rest van de dag.
- Direct voorafgaand aan microsfeer administratie, schud de flacon met de hand gedurende 1 minuut aan de microsferen kunnen mengen. Bij het intrekken van microbellen uit de flacon, geen ruimte geen lucht in de injectieflacon, omdat dit degradeert de rest van microbellen. Laat de flacon uit tot het laatste gebruik van de dag, en dan te bewaren in een koelkast. Onderhouden op deze manier, kan een enkele flacon duren meerdere dagen. Re-activeren opgeslagen flacon in de roerder, voor het eerste gebruik de volgende dagen.
3. Toebereiding van dieren
- Verdoof de dieren met isofluraan, geleverd door neuskegel. De neuskegel inrichting moet worden ontworpen om het dier hoofd te nauwkeurig en betrouwbaar in dezelfde positie telkens. Ons apparaat 15 houdt het hoofd in the "skull-flat" positie (dat wil zeggen, de dorsale schedel oppervlak is horizontaal) gebruikt in de Paxinos hersenen atlas 16. Titreer de verdoving van een ademfrequentie tussen 85 en 125 ademhalingen per minuut te houden. Houd de lichaamstemperatuur met behulp van een warmtelamp of geblazen lucht. Bescherm de ogen met smeermiddel.
- Verwijder het haar van de muis hoofdhuid met behulp van een elektrische trimmer.
- Plaats een staartader katheter en een intraperitoneale (IP) katheter. Om te overleven studies, moet u geschikte steriele techniek te gebruiken; IP-katheter aangetoond in de video voor dit artikel is alleen geschikt voor niet-survival experimenten.
- Maak geen extra voorbereidingen nodig zijn voor de neuronale stimulatie experiment. Voor in kaart brengen van vibrissae stimulatie van het vat veld cortex, gebruik maken van een dissectie microscoop en microchirurgische schaar om de vibrissae zo dicht mogelijk bij de huid snijden zonder irritatie van de follikel of de omliggende huid.
- Plaats echografie gel op dehoofdhuid, en daarna een lagere een waterkolom die door een dunne plastic vel (bijvoorbeeld een 7,6 micrometer vuilnisbak liner) op het hoofd. Te bereiken door met water kolom met een wattenstaafje te duwen eventuele luchtbellen weg die vast komen te zitten in de echografie gel. Plaats de ultrasone transducer op zijn natuurlijke brandpuntsafstand (58 mm) direct over de hersenen van muizen in de kolom van water, en veeg de transducer met een vinger tip om eventuele luchtbellen te verwijderen.
4. Bloed-hersen barrière Opening met Microbelletjes en Ultra Sound (BOMUS)
- Geven een intraperitonale injectie van mangaan oplossing bij een dosis van 0,5 mmol / kg IP. Cap de intraperitoneale catheter, zodat de mangaan niet weg te stromen, en wacht 10 minuten om deze te verspreiden (figuur 1).
- Om de BBB te openen, beheren 30 ul van perflutren lipide microsferen (geactiveerd DEFINITY) door de staartader katheter, en tegelijkertijd, het initiatief tot de echo pulssequentie. Continue insonification gedurende 3 minuten.
5. Neuronale Stimulatie
- Laat ongeveer 40 minuten voor de hersenen niveaus van Mn 2 + te stabiliseren voor het begin van neuronale stimulatie. Op deze wijze de dramatische verhoging basislijn door Mn2 + diffusie over de BBB kan worden onderscheiden van de subtiele verschil verbetering door de stimulatie. Dan beginnen stimulatie met uw paradigma naar keuze (Figuur 1).
- Voor vibrissae stimulatie, schakelt u de isofluraan en verwijder de neuskegel. Handmatig verplaatsen met een zachte penseel in een cirkelvormige beweging (1-5 Hz) door de vibrissae array op een afstand van ongeveer 2-5 mm van de huid. Ga door met de stimulatie voor 90 min. Het mangaan heeft een kalmerend effect, die ongebreidelde stimulatie van het dier laat. Als het dier wordt onrustig, het beheren van 5% isofluraan via de neus ongeveer 15 seconden.
6. Magnetic Resonance Imaging
- Na stimulatie, hervatten verdoving via neuskegel. Ga door het handhaven van de lichaamstemperatuur en titreren van de isofluraan niveau om een ademhalingsfrequentie van 85 tot 125 ademhalingen per minuut.
- Plaats de muis in een MRI spoel en over te dragen aan het MRI-systeem. Acquire hoge-resolutie 3D T 1-gewogen MR beelden. Gebruik bijvoorbeeld een 3D-verwende gradiënt herinnerd echo (SPGR) sequentie met de volgende parameters: herhaling tijd van 25 ms; echo van 2 ms, flip hoek van 30 graden; bandbreedte van 15,63 kHz; gezichtsveld van 20 × 20 × 12 mm matrix van 128 x 128 x 60.
7. Image Analysis
- Beeldanalyse specifiek is voor de gebruikte stimulatie paradigma. Voor de vibrissae stimulatie experiment (figuur 2), importeert u de beelden van verschillende dieren in een geschikte analyse-omgeving. Als sommige dieren gestimuleerd rechts terwijl andere zijn gestimuleerd links flip sommige zodat alle beelden effectief zijn "links gestimuleerd." Dan, om de gestimuleerde zijde van elke hersenen vergelijken met de contralaterale ongestimuleerde kant, maak een gedupliceerd en gespiegeld links ongestimuleerde beeld set is gemaakt. Registreer alle foto's naar een gemeenschappelijke ruimte en glad ze met een 3 × 3 × 3 pixels Gaussiaanse kernel.
- Exporteer de gegevens naar een wiskundige analyse omgeving, zoals MATLAB. Optioneel maskeren irrelevant anatomie in de datasets. Intensiteit-normaliseren van de beelden door de iteratieve methode van Venot et al.. 17,18.
- Gebruik gekoppelde, een eenzijdige t test elke voxel van de gestimuleerde zijden van elke hersenen te vergelijken met de overeenkomstige contralaterale voxel de ongestimuleerde zijden van elke hersenen.
- Geef de resulterende p-waarde om de gebieden van differentiële activiteit (figuur 3) te identificeren.
8. Representatieve resultaten
De methode hier gepresenteerd heeft twee fondsen amental stappen: (1) BBB Opening met Microbelletjes en echografie (BOMUS) en (2) activatie geïnduceerde Mangaan-versterkte MRI (AIM MRI). Omdat de laatste stap hangt af van de eerstgenoemde is belangrijk om te verifiëren succesvolle toepassing BOMUS.
Verstoring van de bloed-hersen barrière na toediening van een T 1-verkorting contrastmiddel (zoals mangaan of een gadolinium-gebaseerde agent) resulteert in een signaal toename in de hersenen parenchym op T 1-gewogen beeldvorming ten opzichte van hersenen waarin BOMUS werd niet uitgevoerd (figuur 4). De verdeling van deze mangaan verbetering niet volledig uniform, maar is vrij consistent tussen dieren. De verdeling geeft niet alleen inhomogeniteit in BBB opening, maar ook de intrinsieke niet gelijkmatige verdeling van Mn in de hersenen 19. De ruimtelijke en temporele dynamiek van de BBB opening verder zijn eerder 12 beschreven.
ENT "> Als BOMUS met succes is uitgevoerd, is de volgende stap uit te voeren AIM MRI Veel experimentele paradigma's zijn mogelijk,.. maar omdat er veel storende variabelen, de controles en analyses moeten zorgvuldig worden ontworpen verstorende effecten zijn onder andere niet-homogene BBB opening, inhomogene accumulatie van Mn in de hersenen, temporele dynamiek van Mn verspreiding en niet-specifieke neuronale activiteit. In deze demonstratie werd de neuronale respons op eenzijdige stimulatie van de vibrissae in kaart gebracht. Om rekening te houden voor de inhomogeniteiten en Mn flux, de niet-gestimuleerde zijde van elke hersenen werd gebruikt als een interne controle. Om rekening te houden niet-specifieke neuronale activiteit die kunnen variëren tussen de dieren, de analyse gebruikte statistische testen om de regio's die steeds andere onder de dieren (figuur 2) te identificeren. De resultaten waren een drie-dimensionale verschil kaart en een drie-dimensionale p-waarde kaart (Figuur 3) de rechterzijde waarvan aangegeven gebiedenvan de hogere signaal contralateraal van de gestimuleerde vibrissae. De linkerkant van de kaart is aangegeven welke regio's veel hoger signaal ipsilaterale om de gestimuleerde vibrissae had. De p-waarde kaart een omvangrijke regio van verhoogde signaal contralateraal van de gestimuleerde vibrissae wat overeenkwam met de loop gebied van de primaire sensorische cortex, waarvan de respons op vibrissae stimulatie is uitvoerig gedocumenteerd door elektrofysiologie 20,21 en 2-deoxyglucose studies. Een uitgebreidere bespreking van deze resultaten is eerder 13 gepubliceerd.
Figuur 1. Protocol tijdlijn voor de functionele neuroimaging met BOMUS en AIM MRI (Bewerking van Howles et al.. 13).
Figuur 2. Analyse schema voor het aanduiden regio's of verschillende intensiteit tussen de gestimuleerde en gestimuleerde zijden van elke hersenen. Om de gestimuleerde zijde van elke hersenen vergelijken met de contralaterale ongestimuleerde kant, een gedupliceerd en gespiegeld links ongestimuleerde beeld set is gemaakt. Deze beelden worden geregistreerd, gefiltreerd en genormaliseerd. Tot slot, bij test vergelijkt de linker-gestimuleerde en links ongestimuleerde beelden. De t test "gekoppeld", zodat de gestimuleerde zijde van elke hersenen alleen in vergelijking met ongestimuleerde de kant van hetzelfde hersenen. De t test "single-tailed" zodat een zijde van de p-waarde kaart significant hoger signaal de gestimuleerde kant van de hersenen aangeeft, terwijl de andere zijde van de p-waarde kaart geeft significant hoger signaal ongestimuleerde zijde van de hersenen (Bewerking van Howles et al.. 13).
Figuur 3. Resultaten van de analyse van gepoolde 7 dieren op twee verschillende axiale posities. T hij voor het eerst kolom geeft het gemiddelde van alle geregistreerde beelden uitgelijnd, zodat effectief alle muizen hadden hun linker vibrissae gestimuleerd. Deze beelden worden bedekt met een kleur kaart waarin de gemiddelde percentage toename signaal voor elke voxel opzichte van de contralaterale halfrond, zoals aangegeven door de kleur bar. Gekleurde regio's aan de rechterkant van het beeld te laten zien waar de hemisfeer contralateraal van de stimulatie hadden een hogere signaal. Gekleurde regio's aan de linkerkant van het beeld te laten zien waar de hemisfeer ipsilateraal aan de stimulatie hadden een hogere signaal. De tweede kolom geeft de dezelfde beelden bedekt met een p-waarde kaart met daarop de statistische significantie van de toename van het signaal. De derde kolom toont dezelfde p-waarde kaart overlay op de overeenkomstige cijfers van de Paxinos stereotaxische atlas 16 met het vat gebied van de sensorische cortex schaduw (Bewerking van Howles et al.. 13).
/ 4055/4055fig4.jpg "/>
Figuur 4. Ruimtelijke verdeling van Mn2 + in de hersenen. Beelden werden verworven 170 min na 0,5 mmol / kg IP MnCl2 van BOMUS-behandelde (n = 5) en controlegroep (n = 4) muizen. Na normalisatie, gemiddelde en standaarddeviatie kaarten werden berekend (links paneel). Verbetering was groter in de BOMUS-behandelde muizen. Hoewel deze verbetering niet uniform over de hersenen was redelijk constant, behalve aan de randen van de hersenen en ventrikels. Met behulp van regio's van belang (ROI) getekend om de verschillende structuren, was de gemiddelde SNR (+ 1 SD) berekend over elke groep (rechter paneel). BOMUS behandelde dieren vertoonden een grotere SNR, maar ook een grotere variatie tussen structuren en tussen de dieren (Bewerking van Howles et al.. 13).
Figuur 5. Om weefsel effecten van BOMUS te onderzoeken, werden hersenen van BOMUS-behandelde muizen vast, sectioned 500 - um tussenpozen, en gekleurd met hematoxyline en eosine. Het gemiddelde aantal rode bloedcellen extravasatie gezien in elk deel van de hersenen wordt voor akoestische druk van 0,36 MPa (n = 3), 0,52 MPa (n = 4), en 5,0 MPa (n = 1). Foutbalken tonen standaard fout. De tweede paneel toont een voorbeeld van ernstige rode bloedcellen extravasatie van de hersenen blootgesteld aan 5,0 MPa (Bewerking van Howles et al.. 12).
Figuur 6. Kwantitatieve gedrags-test werd gebruikt om de activiteit, opwinding en het reactievermogen te beoordelen voorafgaand aan de narcose, en 3 en 24 uur na het herstel van de anesthesie. Het scoresysteem, eerder beschreven 12, was gebaseerd op de beproefde kwantitatieve muis gedrags-evaluatie te ontwikkelened door Irwin in 1968 22. De gemiddelde gedrag (± SEM) score controlegroep (n = 3) en BOMUS (0,36 MPa) behandeld (n = 8) dieren weergegeven. Ten opzichte van de pre-anesthesie baseline, alle dieren laten een daling zien in het gedrag score 3 uur na de anesthesie, maar ze grotendeels herstellen door de volgende dag. Op elk tijdstip, werd geen verschil gezien tussen de twee groepen, wat aangeeft dat BOMUS niet meetbaar gedrag van dieren (Bewerking van Howles et al.. 12) beïnvloeden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier werd een methode gepresenteerd voor niet-invasief het openen van de BBB in de hele hersenen van muizen met ultrageluid en microbellen (BOMUS). Met de BBB open, Mn 2 + werd toegediend en activering-geïnduceerde mangaan-versterkte MRI (AIM MRI) werd gebruikt om de afbeelding neuronale respons op kortdurende stimulatie in licht verdoofde muizen.
Adequate BBB opening werd bereikt met een piek-negatieve akoestische druk van 0,36 MPa. Opmerking is dit de druk hoofdhuid oppervlak in het midden van het ultrasone geluid. Metingen van de bundel een element transducer profiel geven aan dat de geluidsdruk van de balk rand slechts ongeveer 0,12 MPa. Vervolgens demping door de schedel vermindert de druk die in de hersenen van ongeveer 25% (gebaseerd op afstelling Choi et al. 23. Varieert frequentie). Dit geeft aan dat BBB verstoring zich op de piek-negatieve akoestische druk van 0,09 MPa (in het midden van onze bundel) 0,03 MPa (aan de rand). Deze drukken zijn lager dan de niveaus (meestal 0,4 tot 0,5 MPa) gemeld elders 24. Deze verminderde druk drempel kan door de hogere dosis van lipide microbelletjes in dit werk (ongeveer 1,2 ml / kg) in vergelijking met andere. Hoewel de dosis van het gebruikte microbolletjes hoger dan de aanbevolen diagnostische humane dosis (10 ul / kg) werden negatieve effecten waargenomen.
Zoals hier aangegeven, de BOMUS techniek is niet-invasieve en omkeerbaar, maar het heeft de potentie om schade te berokkenen. In eerder werk 12, werden de muizen behandeld met BOMUS geëvalueerd voor histologisch schade (figuur 5) en gedragsveranderingen (figuur 6). Peak-negatieve akoestische druk van 0,36 MPa werden in verband gebracht zonder waargenomen negatieve effecten (figuur 6). Echter, 0,52-MPa BOMUS verbonden met een klein aantal intracerebrale rode bloedcellen extravasatie in een deel van de dieren ( Zoals de BOMUS techniek mogelijk schadelijke, mangaan ook bekend toxiciteit 25. Mn2 + bekend toxische effecten op de neuromusculaire 26 en zenuwstelsel 27 hebben. Dit toxiciteit zal verantwoordelijk voor de slaperigheid van de muizen na toediening, hoewel het mechanisme voor dit effect is niet bekend. Voor ongeveer de eerste 60 minuten van de stimulatie, de muis blijft enigszins slaperig, maar nog steeds reageert op pijnprikkels, zoals een teen knijpen. Hierdoor kan de muis om de stimulatie tolereren zonder de noodzaak van fysieke fixatie. In onze ervaring, dit slaperigheid is voldoende voor ongeveer 60 minuten waarna het dier kan worden onrustig. Extra chemische terughoudendheid kan eenchieved als nodig is met ongeveer 15 seconden van 5% isofluraan via de neuskegel. In deze demonstratie, de slaperigheid vergemakkelijkt de stimulatie van de vibrissae, maar het kan ook een verminderde de neuronale reactie in het vat cortex. Behalve eenvoudig toediening Mn2 +, kan de BOMUS techniek worden toegepast om globaal toedienen andere diagnostische of therapeutische middelen. In voorgaande werk, BOMUS is gebruikt om Gd-DTPA, een MRI-contrastmiddel, toe te dienen aan de hersenen. 12 Toch zijn veel vragen blijven bestaan over de aard van de BBB permeabiliteit bereikt met BOMUS. Ten eerste is het niet duidelijk hoe groot agenten zijn in staat om de BBB na BOMUS over te steken. Beide Mn2 + en Gd-DTPA (500 Da) vrij kleine moleculen. Anderzijds is het niet duidelijk hoe de permeabiliteit van de BBB varieert in de hersenen. Ten derde is het niet duidelijk of de BBB opening is een relatief binaire effect, of als bepaalde opening parameters kunnen invloed op de grootte of de snelheid van het materiaalpermeatie. Hoewel Gd-DTPA gedistribueerd vrij gelijkmatig door de hersenen in het bovengenoemde onderzoek, kan het geweest zijn te klein en te diffundeerbare eventuele verschillen in permeabiliteit te onthullen. Ondanks deze onzekerheid omtrent het BOMUS de werkwijze effectief is voor het snel toedienen Mn2 + ter AIM-MRI. AIM-MRI is gebruikt bij muizen tot neuronale respons op de lange termijn (1-2 dagen) stimulatie bij muizen 28-30 in kaart te brengen, maar met deze nieuwe aanpak, op korte termijn stimulatie experimenten zijn nu mogelijk. Voorheen, snelle toediening van Mn 2 + was alleen mogelijk met osmotische verstoring van BBB met behulp van een intracarotide infusie van hypertone mannitol. Deze aanpak was alleen praktisch in ratten en grotere diermodellen, maar zelfs bij ratten, deze studies werden beperkt door de invasiviteit en de eenzijdigheid van de techniek. Omdat BOMUS kunnen niet-invasieve wijze worden uitgevoerd, moet wakker stimulatie en longitudinale studies nu mogelijk. Bovendien becagebruik maken van Mn 2 + kan worden toegediend aan beide hersenhelften, een breder scala aan stimulatie paradigma's zijn mogelijk. In het bovenstaande demonstratie bilaterale toediening Mn2 + kon de ongestimuleerde halfrond als een interne controle, zodat neuronale reactie op niet-specifieke achtergrond stimulatie kan worden gescheiden van het antwoord op de eenzijdige vibrissae stimulatie. Naast de correctie voor niet-specifieke achtergrond stimulatie, de ongestimuleerde halfrond ook werd gebruikt om te controleren voor homogeniteit en consistentie van het mangaan administratie. Zoals bij andere mangaan MRI experimenten 19 de verdeling data (figuur 4) blijkt dat de BOMUS techniek geen homogene verbetering van de hersenen voorzien. Zo, zonder voldoende controle (controle dieren of een niet-gestimuleerde halfrond), gebieden met een hoger uitgangswaarde verbetering zijn moeilijk te onderscheiden van regio's met een elekeld signaal is te wijten aan neuronale activiteit. Hoewel de basislijn Mn 2 + verbetering is niet homogeen, het beeld echter redelijk consistent tussen individuen. Niettemin kunnen kleine variaties in deze basislijn verbetering verdoezelen van de AIM-MRI-signaal. In deze demonstratie, we gericht op dit mogelijke probleem door het gemiddelde van de AIM-MRI-signaal over meerdere dieren. Als alternatief zou de verschillen in de uitgangssituatie verbetering worden verklaard door de overname van pre-stimulatie beelden. De methode hier beschreven vergt veel statistische beeldanalyse, die op hun beurt vereist hifi beeldregistratie. Natuurlijk is een dergelijke registratie is alleen zinvol als de bron van gegevens wordt verkregen met een resolutie (in alle drie dimensies) die voldoende fijner dan de structuren van belang. In deze demonstratie werden de 3D-beelden die met bijna isotrope voxels ongeveer 160 micron in elke dimensie, waardoor voor een uitstekendeanatomische registratie. Toch kan beeldregistratie beperking van de ruimtelijke resolutie van deze methode-een lichte verkeerde registratie kan gemiddeld-out zeer kleine regio's van toebehoren. De kleine hersenen en de olfactorische bollen kunnen bijzonder moeilijk om te registreren, omdat ze een fijn gelaagde verbetering en zijn vaak niet in de lijn met de grote hersenen. Hier hebben we voorgesteld een methode voor het toewijzen van neuronale reactie op de korte duur stimuli in wakkere muizen. Hoewel niet eenvoudig is de werkwijze relatief praktisch en toegankelijk. Deze gedetailleerde bespreking van de beperkingen en de subtiliteiten hopelijk in staat stellen de lezer om de techniek toe te passen op hun eigen experimentele vragen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Al het werk werd uitgevoerd bij de Hertog Centrum voor In Vivo Microscopy, een NIH / NIBIB nationale Biomedische Technologie Resource Center (P41 EB015897) en NCI Small Animal Imaging Resource Program (U24 CA092656). Aanvullende ondersteuning werd geleverd door NSF Graduate Research Fellowship (2003014921).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hydrophone | Sonora Medical Systems, Longmont, CA | SN S4-251 | |
| Translation stage | Newport Corporation, Irvine, CA | ||
| Ultrasound transducer | Olympus NDT, Inc., Waltham MA | A306S-SU | Review the manufacturer's test sheet that accompanies the transducer to find the exact center frequency of that particular transducer, which may differ from the nominal frequency listed in the catalog. (e.g., the nominal frequency of our transducer was 2.25 MHz, but the actual center frequency was 2.15 MHz.) |
| Vevo Imaging Station | VisualSonics, Inc. Toronto, Canada | ||
| 50 dB power amplifier | E&I, Rochester, NY | model 240L | |
| Signal generator | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | model 33220A | |
| MnCl2-(H2O)4 | Sigma | Molecular weight varies by batch, call manufacturer for exact measurement | |
| Perflutren lipid microspheres | Lantheus Medical Imaging, N. Billerica, MA | DEFINITY | |
| Microsphere agitator | Lantheus Medical Imaging, N. Billerica, MA | VIALMIX | |
| MR imaging coil | m2m Imaging Corp., Hillcrest, OH | 35 mm diameter quadrature transmit/receive volume coil | |
| MRI system | GE Healthcare, Milwaukee, WI | GE EXCITE console operating a 7-T horizontal bore magnet | |
| Image analysis environment | Visage Imaging, San Diego, CA, MathWorks, Natick MA | Amira MATLAB |
References
- Aoki, I. Detection of the anoxic depolarization of focal ischemia using manganese-enhanced MRI. Magnet. Reson. Med. 50, 7-12 (2003).
- Aoki, I. Dynamic activity-induced manganese-dependent contrast magnetic resonance imaging. DAIM MRI). Magnet. Reson. Med. 48, 927-933 (2002).
- Duong, T. Q., Silva, A. C., Lee, S. P., Kim, S. G. Functional MRI of calcium-dependent synaptic activity: Cross correlation with CBF and BOLD measurements. Magnet. Reson. Med. 43, 383-392 (2000).
- Lin, Y. J., Koretsky, A. P. Manganese ion enhances T-1-weighted MRI during brain activation: An approach to direct imaging of brain function. Magnet. Reson. Med. 38, 378-388 (1997).
- Lu, H. B. Cocaine-induced brain activation detected by dynamic manganese-enhanced magnetic resonance imaging (MEMRI). P. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 2489-2494 (2007).
- Drapeau, P., Nachshen, D. A. Manganese fluxes and manganese-dependent neurotransmitter release in presynaptic nerve-endings isolated from rat-brain. J. Physiol-London. 348, 493-510 (1984).
- Narita, K., Kawasaki, F., Kita, H. Mn and Mg influxes through Ca channels of motor-nerve Terminals are prevented by verapamil in Frogs. Brain Res. 510, 289-295 (1990).
- Hynynen, K., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F. A. Noninvasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits. Radiology. 220, 640-644 (2001).
- Sheikov, N., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F., Hynynen, K. Cellular mechanisms of the blood-brain barrier opening induced by ultrasound in presence of microbubbles. Ultrasound Med. Biol. 30, 979-989 (2004).
- McDannold, N., Vykhodtseva, N., Raymond, S., Jolesz, F. A., Hynynen, K. MRI-guided targeted blood-brain barrier disruption with focused ultrasound: Histological findings in rabbits. Ultrasound Med. Biol. 31, 1527-1537 (2005).
- McDannold, N., Vykhodtseva, N., Hynynen, K. Targeted disruption of the blood-brain barrier with focused ultrasound: association with cavitation activity. Phys. Med. Biol. 51, 793-807 (2006).
- Howles, G. P. Contrast-enhanced in vivo magnetic resonance microscopy of the mouse brain enabled by noninvasive opening of the blood-brain barrier with ultrasound. Magnet. Reson. Med. 64, 995-1004 (2010).
- Howles, G. P., Qi, Y., Johnson, G. A. Ultrasonic disruption of the blood-brain barrier enables in vivo functional mapping of the mouse barrel field cortex with manganese-enhanced MRI. Neuroimage. 50, 1464-1471 (2010).
- Woolsey, T. A., Welker, C., Schwartz, R. H. Comparative anatomical studies of sml face cortex with special reference to occurrence of barrels in layer-4. J. Comp. Neurol. 164, 79-94 (1975).
- Howles, G. P., Nouls, J. C., Qi, Y., Johnson, G. A. Rapid production of specialized animal handling devices using computer-aided design and solid freeform fabrication. J. Magnet. Reson. Imag. 30, 466-471 (2009).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , 2nd edn, Academic Press. (2001).
- Cross, D. J. Statistical mapping of functional olfactory connections of the rat brain in vivo. Neuroimage. 23, 1326-1335 (2004).
- Venot, A., Lebruchec, J. F., Golmard, J. L., Roucayrol, J. C. An automated-method for the normalization of scintigraphic images. J. Nucl. Med. 24, 529-531 (1983).
- Aoki, I., Naruse, S., Tanaka, C. Manganese-enhanced magnetic resonance imaging (MEMRI) of brain activity and applications to early detection of brain ischemia. Nmr. Biomed. 17, 569-580 (2004).
- Welker, E., Vanderloos, H. Quantitative correlation between barrel-field size and the sensory innervation of the whiskerpad - a comparative-study in 6 strains of mice bred for different patterns of mystacial vibrissae. J. Neurosci. 6, 3355-3373 (1986).
- McCasland, J. S., Woolsey, T. A. High-resolution 2-deoxyglucose mapping of functional cortical columns in mouse barrel cortex. J. Comp. Neurol. 278, 555-569 (1988).
- Irwin, S. Comprehensive observational assessment : A systematic quantitative procedure for assessing behavioral and physiologic state of mouse. Psychopharmacologia. 13, 222-257 (1968).
- Choi, J. J., Pernot, M., Small, S. A., Konofagou, E. E. Noninvasive, transcranial and localized opening of the blood-brain barrier using focused ultrasound in mice. Ultrasound Med. Biol. 33, 95-104 (2007).
- McDannold, N., Vykhodtseva, N., Hynynen, K. Use of ultrasound pulses combined with definity for targeted blood-brain barrier disruption: A feasibility study. Ultrasound Med. Biol. 33, 584-590 (2007).
- Silva, A. C., Lee, J. H., Aoki, L., Koretsky, A. R. Manganese-enhanced magnetic resonance imaging (MEMRI): methodological and practical considerations. Nmr. Biomed. 17, 532-543 (2004).
- Meiri, U., Rahamimoff, R. Neuromuscular transmission - inhibition by manganese ions. Science. 176, 308 (1972).
- Aschner, M., Guilarte, T. R., Schneider, J. S., Zheng, W. Manganese: Recent advances in understanding its transport and neurotoxicity. Toxicol. Appl. Pharm. 221, 131-147 (2007).
- Watanabe, T., Frahm, J., Michaelis, T. Manganese-enhanced MRI of the mouse auditory pathway. Magnet. Reson. Med. 60, 210-212 (2008).
- Yu, X., Wadghiri, Y. Z., Sanes, D. H., Turnbull, D. H. In vivo auditory brain mapping in mice with Mn-enhanced MRI. Nat. Neurosci. 8, 961-968 (2005).
- Yu, X. Statistical mapping of sound-evoked activity in the mouse auditory midbrain using Mn-enhanced MRI. Neuroimage. 39, 223-230 (2008).
