Summary
Eine Technik ist für die breite Öffnung der Blut-Hirn-Schranke in der Maus mit Mikrobläschen und Ultraschall beschrieben. Mit dieser Technik können Mangan, um Gehirn der Maus verabreicht werden. Da Mangan ist ein MRT-Kontrastmittel, die in Neuronen depolarisiert ansammelt, erlaubt dieser Ansatz eine Bildgebung neuronaler Aktivität.
Abstract
Obwohl Mäuse sind das dominierende Modellsystem für die Erforschung der genetischen und molekularen Grundlagen der Neurowissenschaften, funktionelle Bildgebung bei Mäusen bleibt technisch anspruchsvoll. Ein Ansatz, activation-induced Mangan-MRT (AIM MRI), wurde erfolgreich auf die neuronale Aktivität bei Nagern 1-5 zuordnen können. In AIM MRT, Mn 2 + wirkt ein Calcium analoge und reichert sich in Neuronen depolarisiert 6,7. Da Mn 2 + verkürzt die T 1 Gewebe Eigentum, werden Bereiche erhöhter neuronaler Aktivität in der MRT zu verbessern. Ferner, Mn 2 + löscht langsam von den aktivierten Bereichen, daher Stimulation kann außerhalb des Magneten durchgeführt vor der Bebilderung werden, was eine höhere Flexibilität experimentellen. Da jedoch die Mn 2 + nicht leicht die Blut-Hirn-Schranke (BHS), die Notwendigkeit, öffnen Sie die BBB hat die Verwendung von AIM MRT begrenzt, vor allem bei Mäusen.
Ein Werkzeug zum Öffnen des BBB ist ultrasound. Obwohl möglicherweise Schaden entstehen, wenn Ultraschall in Kombination mit gasgefüllten Mikroblasen (dh Ultraschall-Kontrastmitteln) verabreicht wird, ist der Schalldruck für BBB Öffnung erforderlich deutlich niedriger. Diese Kombination von Ultraschall und Mikrobläschen können verwendet werden, um zuverlässig öffnen Sie die BBB, ohne dass Gewebeschäden 8-11 werden.
Hier wird ein Verfahren zum Durchführen AIM MRT durch Einsatz von Mikrobläschen und Ultraschall, um die BBB zu öffnen dargestellt. Nach einer intravenösen Injektion von Perflutren Mikrobläschen ist eine unscharf gepulsten Ultraschalls an den Kopf rasiert Maus für 3 Minuten angewendet werden. Der Einfachheit halber verweisen wir auf diese Technik von BBB Opening mit den Mikrobläschen und Ultraschall als BOMUS 12. Mit BOMUS die BBB über beiden Hemisphären zu öffnen, wird Mangan auf das gesamte Gehirn der Maus verabreicht. Nach experimenteller Stimulation der leicht sedierten Mäusen ist AIM MRI verwendet, um die neuronalen Reaktionen zuordnen.
Zudiesen Ansatz zu demonstrieren, sind hierin BOMUS und AIM MRI verwendet werden, um einseitige mechanische Stimulation der Tasthaare in leicht sediert Mäuse 13 Karte. Weil BOMUS können die BBB über beiden Hemisphären zu öffnen, wird der unstimulierten Seite des Gehirns verwendet, um für eine unspezifische Stimulation Hintergrund steuern. Das resultierende 3D-Aktivierung Karte stimmt gut mit den veröffentlichten Darstellungen der Vibrissen Regionen des Feldes Barrel Cortex 14. Das Ultraschall-Öffnung der BHS ist schnell, nicht-invasive und reversible, und so ist dieser Ansatz geeignet für High-Throughput-und / oder Längsschnittstudien in wach-Mäusen.
Protocol
1. Montieren und Kalibrieren Ultraschallsystem
- Das Ultraschallsystem beginnt mit einem Element Ultraschallwandler mit einem Durchmesser breit genug, um die Maus Gehirn und eine Mittenfrequenz im Bereich von 2 MHz abdecken. Der Wandler wird durch eine 50-dB-Leistungsverstärker, der mit einem Signalgenerator, der die Ultraschall-Impulsfolge erzeugt verbunden angetrieben wird.
- Um den akustischen Druck des Ultraschall-System zu kalibrieren, mit einem Hydrophon, die angelegte Spannung zu der resultierenden akustischen Druck beziehen. Setzen Sie den Schallkopf in einem Wassertank über dem Hydrophon. Anwenden einer einfachen Puls (z. B. ein 10-Zyklus Sinuskurve an dem Wandler die Häufigkeit, mit Impulsfolgefrequenz von 10 Hz) an den Wandler. Verwenden Sie ein 3-Achsen-Übersetzung Bühne, um die Peak-Ansprechen, die im Zentrum des Ultraschallstrahls an dem Wandler die natürliche Konzentration (etwa 60 mm für unsere 13 mm Durchmesser 2,15 MHz-Sonde) sein sollte, zu finden.
- Machen Sie mehrere Messungen über einen klingeltee von Eingangsspannungen (zB 50-400 mV pp), um die Linearität des Systems zu überprüfen. Verwenden Sie eine einfache lineare Regression, die Beziehung zwischen Eingangsspannung und Schalldruck zu schätzen. In unserem System entsprach Eingangsspannungen von 258 und 167 mV pp-Spitze-negativen Schalldruck von 0,52 und 0,36 MPa.
- Programm die Signalerzeuger, um ein Ultraschallimpuls Sequenz, bestehend aus Bursts von sinusförmigen Impulse am Ultraschall-Frequenz mit 50000 Zyklen pro Burst und einer Burst-Periode von 64 ms zu erzeugen. Basierend auf den Kalibriermessungen, stellen Sie die Pulsamplitude zu Peak-negativen akustischen Druck von 0,36 MPa in der Mitte des Wandlers den natürlichen Schwerpunkt zu generieren.
2. Bereiten Sie die Reagenzien
- Man löst Manganchloridtetrahydrat (MnCl 2 · 4H 2 O) in sterilem Wasser bei einer Konzentration von 100 mM (300 mosm) und Filter zu sterilisieren.
- Produzieren Sie das Perflutren Lipid-Mikrosphären von "activating "die Ampulle in der vom Hersteller gelieferten Rührer für 45 s. Für einen Tag von Experimenten kann ein einzelnes Gefäß einmal am Beginn des Tages aktiviert und verwendet werden, ohne dass die Aktivierung für den Rest des Tages.
- Unmittelbar vor der Mikrosphären-Verwaltung, beunruhigen Sie das Fläschchen mit der Hand für 1 Minute, um die Mikrosphären zu resuspendieren. Beim Herausziehen Mikrobläschen aus dem Fläschchen, injizieren Sie kein Zimmer Luft in die Flasche, da dies verschlechtert die restlichen Mikrobläschen. Lassen Sie das Fläschchen bis zum letzten Einsatz des Tages, und dann speichern Sie es im Kühlschrank aufbewahrt. Verwaltet auf diese Weise kann eine einzige Ampulle mehrere Tage dauern. Re-Aktivierung der gespeicherten Küvette in den Rührer, vor der ersten Verwendung an den folgenden Tagen.
3. Tierische Vorbereitung
- Betäuben die Tiere mit Isofluran, geliefert von Bugspitze. Der Nasenkegel Vorrichtung sollte so gestaltet werden, um den Kopf des Tieres genau und zuverlässig zu befestigen an der gleichen Position jedes Mal werden. Unsere Einrichtung 15 hält den Kopf in the "Schädel-Flat"-Position (dh die dorsalen Schädel Oberfläche ist horizontal) in der Paxinos Hirnatlas 16 verwendet. Daraufhin wird die Betäubung, eine Atemfrequenz von 85 bis 125 Atemzüge pro Minute aufrecht zu erhalten. Pflegen Sie die Körpertemperatur mit Hilfe eines Wärmelampe oder Blasluft. Schützen Sie die Augen mit Gleitmittel.
- Entfernen Sie die Haare aus der Kopfhaut Maus mit Hilfe eines elektrischen Trimmer.
- Legen Sie eine Schwanzvene Katheter und eine intraperitoneale (IP-) Katheter. Für das Überleben Studien, achten Sie darauf, geeignete sterile Technik zu verwenden; IP Katheterplatzierung in dem Video zu diesem Artikel gezeigt angemessen ist nur für Nicht-Überleben Experimente.
- Nehmen Sie ggf. weitere Vorbereitungen für die neuronale Stimulation Experiment erforderlich. Für das Mapping von Vibrissen Stimulation des Laufes Feld Kortex, verwenden Sie ein Binokular und mikrochirurgischen Schere, um die Tasthaare so nah wie möglich an die Hautoberfläche ohne zu reizen oder die Follikel umgebenden Haut zu schneiden.
- Ort Ultraschall-Gel auf dieKopfhaut, und senken Sie dann eine Wassersäule von einer dünnen Plastikfolie (z. B. eine 7,6 um Müll Müllsack) auf den Kopf enthielt. Erreichen Sie durch mit Wasser Spalte mit einem Wattestäbchen Wattestäbchen, Push-out alle Luftblasen, die in der Ultraschall-Gel verfangen. Positionieren Sie den Schallkopf in seiner natürlichen Brennweite (58 mm) direkt über das Gehirn der Maus in der Spalte von Wasser, und wischen Sie den Sensor mit der Fingerspitze, um eingeschlossene Luftblasen zu entfernen.
4. Blut-Hirnschranke Opening mit den Mikrobläschen und Ultra Sound (BOMUS)
- Wähle eine intraperitoneale Injektion von Mangan Lösung bei einer Dosis von 0,5 mmol / kg IP. Verschließen Sie die intraperitonealen Katheter so das Mangan nicht fließt, aus, und warten Sie 10 Minuten, damit es zu verteilen (Abbildung 1).
- Um die BBB zu öffnen, zu verwalten 30 ul Perflutren Lipid-Mikrosphären (aktiviert DEFINITY) über die Schwanzvene Katheter, und gleichzeitig, starten Sie die Ultraschall-Impulsfolge. Continue Beschallung für 3 Minuten.
5. Neuronale Stimulation
- Lassen Sie ca. 40 Minuten für Gehirn-Niveaus von Mn 2 +, der vor Beginn neuronale Stimulation zu stabilisieren. Auf diese Weise die dramatische Verbesserung Ausgangswert durch Mn 2 +-Diffusionsbereich durch die BHS aus dem feinen Differenz Verbesserung durch Stimulation unterschieden werden. Dann beginnt die Stimulation mit Ihrem Paradigma der Wahl (Abbildung 1).
- Für Vibrissen Stimulation, schalten Sie das Isofluran und entfernen Sie die Bugspitze. Bewegen eines weichen Pinsel Künstlers manuell in einer kreisförmigen Bewegung (1-5 Hz) durch die Vibrissen Array in einem Abstand von etwa 2-5 mm von der Haut. Fahren Sie mit der Stimulation für 90 min. Das Mangan hat eine beruhigende Wirkung, die hemmungslose Stimulation des Tieres ermöglicht. Wenn das Tier wird unruhig, verwalten 5% Isofluran via Nasenkonus für ca. 15 Sekunden.
6. Magnetic Resonance Imaging
- Nach der Stimulation wieder aufnehmen Anästhesie über Bugspitze. Weiter Aufrechterhaltung der Körpertemperatur und der Titration der Isofluran-Ebene zu einer Atemfrequenz von 85 bis 125 Atemzüge pro Minute.
- Platzieren Sie die Maus in einer MR-Bildgebung Spule und Transfer in das MRT-System. Erwerben Sie hochauflösende 3D-T 1-gewichteten MR-Bildern. Verwenden Sie z. B. eine 3D-Gradientenechobildern erinnerte Echo (SPGR) Sequenz mit folgenden Parametern: Wiederholung von 25 ms, Echozeit von 2 ms, Flip-Winkel von 30 Grad; Bandbreite von 15,63 kHz; Gesichtsfeld von 20 × 20 × 12 mm, Matrix von 128 × 128 × 60.
7. Bildanalyse
- Die Bildanalyse ist spezifisch für die Stimulationsparadigma verwendet. Für die Stimulation Vibrissen Experiment (Abbildung 2), importieren Sie die Bilder von mehreren Tieren in einen geeigneten Analyse-Umgebung. Wenn einige Tiere wurden auf der rechten Seite stimuliert, während andere auf der linken Seite, FL stimuliert wurdenIP manche so, dass alle Bilder wirksam sind "left-stimulierte." Dann, um die stimulierten Seite jedes Gehirn seine kontralateralen unstimulierten miteinander zu vergleichen, eine dupliziert und gespiegelt links unstimulierten Bildsatzsignal erzeugt wird. Registrieren Sie sich alle Bilder zu einem gemeinsamen Raum und dann glätten sie mit einem 3 × 3 × 3 Pixel Gauß-Kern.
- Exportieren Sie die Daten einer mathematischen Analyse-Umgebung, wie MATLAB. Optional maskieren irrelevant Anatomie in den Datensätzen. Intensity-normalisieren die Bilder durch die iterative Methode von Venot et al. 17,18.
- Verwenden Sie ein gekoppeltes, Einzel-tailed t-Test für jedes Voxel des stimulierten Seiten jedes Gehirn auf die entsprechende kontralaterale Voxel vergleichen auf den unstimulierten Seiten jedes Gehirn.
- Anzeigen des resultierenden p-Wert anzeigen, um Bereiche unterschiedlicher Aktivität (3) zu identifizieren.
8. Repräsentative Ergebnisse
Die hier vorgestellte Methode hat zwei Fonds amental Schritten: (1) BBB Eröffnung mit Mikrobläschen und Ultraschall (BOMUS) und (2) activation-induced Mangan-MRT (AIM MRI). Da der letztere Schritt hängt von der ehemaligen, ist es wichtig für eine erfolgreiche Umsetzung BOMUS überprüfen.
Störung der Blut-Hirn-Schranke nach der Verabreichung einer T 1-verkürzenden Kontrastmittels (wie Mangan oder eine Gadolinium-basierte Agent) führt zu einer Erhöhung des Signal Hirnparenchym auf T 1-gewichteter Bildgebung, wann Gehirne verglichen, in denen BOMUS wurde nicht durchgeführt (Abbildung 4). Die Verteilung dieser Mangan-Erhöhung ist nicht völlig einheitlich, obwohl es ziemlich konsistent zwischen den Tieren ist. Die Verteilung gibt nicht nur Inhomogenität in BBB Öffnung, sondern auch die intrinsische ungleichmäßige Verteilung von Mn im Gehirn 19. Die räumliche und zeitliche Dynamik der BBB Eröffnung wurden weiter oben beschrieben 12.
ENT "> Nachdem BOMUS erfolgreich umgesetzt wurde, ist der nächste Schritt zur Durchführung AIM MRI Viele experimentelle Paradigmen sind möglich;.. aber da gibt es viele potenzielle verwechselt, die Kontrollen und Analysen müssen sorgfältig entworfen werden Confounding Effekte beinhalten inhomogene BBB Eröffnung, inhomogenen Ansammlung von Mn im Gehirn, zeitliche Dynamik der Mn Diffusion und unspezifische neuronale Aktivität. In diesem Beispiel wurde die neuronale Antwort auf einseitige Stimulation der Vibrissen zugeordnet. Um den Inhomogenitäten und Mn Fluß, der nicht stimulierten Seite jedes Gehirn ausmachen wurde als interne Kontrolle verwendet. Um unspezifische neuronale Aktivität, die zwischen Tieren variieren könnte erklären, verwendet die Analyse statistischen Tests in Regionen, die immer wieder andere unter den Tieren (2) verantwortlich waren. Die Ergebnisse waren eine dreidimensionale Karte und ein Unterschied dreidimensionalen p-Wert Karte (Abbildung 3), die rechte Seite, von denen Regionen angegebenvon höheren Signal kontralateral zur stimulierten Tasthaare. Die linke Seite der Karte angezeigt, welche Regionen signifikant höheren Signal ipsilateral zur stimulierten Vibrissen hatte. Der p-Wert Karte identifiziert einen breiten Bereich erhöhter Signal kontralateral zur stimulierten Tasthaare, die mit dem Lauf-Feld der primären sensorischen Kortex, dessen Reaktion auf Vibrissen Stimulation wurde ausgiebig von 20,21 Elektrophysiologie und 2-Desoxyglucose Studien dokumentiert entsprach. Eine ausführlichere Diskussion dieser Ergebnisse wurde bereits 13 veröffentlicht.
Abbildung 1. Protokoll Zeitplan für die funktionelle Bildgebung mit MRI BOMUS und AIM (Übernommen aus Howles et al. 13).
Abbildung 2. Analysis Schema zur Identifizierung Regionen of unterschiedlicher Intensität zwischen den stimulierten und unstimulierten Seiten jedes Gehirn. Um den stimulierten Seite jedes Gehirn seine unstimulierten kontralateralen Seite zu vergleichen, dupliziert und gespiegelt ein links-unstimulierten Bildmenge wird erstellt. Diese Bilder werden registriert, filtriert, und normalisiert. Schließlich, am Test vergleicht die links-stimulierten und unstimulierten links-Bilder. Der t-Test wird "gekoppelt", so dass die angeregte Seite jedes Gehirn nur der nicht stimulierten Seite desselben Gehirns. Der t-Test "Single-tailed", so dass eine Seite der p-Wert anzeigen signifikant höheren Signal auf der stimulierten Seite des Gehirns anzeigt, während die andere Seite der p-Wert Karte zeigt einen signifikant höheren Signal auf Seite der unstimulierten Gehirn (Übernommen aus Howles et al. 13).
3. Ergebnisse der gepoolten Analyse von 7 Tieren an zwei verschiedenen axialen Positionen. T er erste Spalte zeigt den Mittelwert aller registrierten Bilder ausgerichtet, so dass effektiv alle Mäuse hatten ihre linke Vibrissen stimuliert. Diese Bilder mit einer Farbe Karte, welche die durchschnittliche prozentuale Zunahme des Signals in jedem Voxel relativ zu der kontralateralen Hemisphäre überlagert, wie dies durch die Farbbalken. Farbige Bereiche auf der rechten Seite des Bildes zeigen, wo die Hemisphäre kontralateral zur Stimulation hatten höhere Signal. Farbige Regionen auf der linken Seite des Bildes zeigen, wo die Halbkugel ipsilateral zur Stimulation hatten höhere Signal. Die zweite Spalte zeigt die gleichen Bilder mit der p-Wert Karte, welche die statistische Signifikanz der Zunahme des Signals überlagert. Die dritte Spalte zeigt den gleichen p-Wert Karte auf den entsprechenden Zahlen aus dem Paxinos stereotaxische Atlas 16 mit den Fass Felder des sensorischen Kortex schattiert (Übernommen aus Howles et al. 13) überlagert.
/ 4055/4055fig4.jpg "/>
4. Räumliche Verteilung von Mn 2 + im Gehirn. Bilder wurden 170 min nach 0,5 mmol / kg IP MnCl 2 erworben von BOMUS-behandelten (n = 5) und Kontrolle (n = 4)-Mäusen. Nach der Normalisierung, Mittelwert und Standardabweichung berechnet Karten wurden (linkes Bild). Enhancement war in den BOMUS-behandelten Mäusen. Obwohl diese Verstärkung nicht über das Gehirn einheitliche, war es ziemlich konstant, außer in der Nähe der Ränder des Gehirns und Ventrikel. Mit Regions of Interest (ROI) um verschiedene Strukturen gezeichnet, wurde die mittlere SNR (+ 1 SD) in jeder Gruppe (rechtes Bild) berechnet. BOMUS-behandelten Tiere zeigten eine größere SNR, sondern auch größere Varianz zwischen Strukturen und zwischen Tieren (Übernommen aus Howles et al. 13).
Abbildung 5. Um Gewebe Wirkungen von BOMUS zu untersuchen, wurden Gehirne von BOMUS-behandelten Mäusen fest, SEctioned bei 500 - um Intervalle, und gefärbt mit Hämatoxylin und Eosin. Die mittlere Anzahl der roten Blutkörperchen Extravasate in jedem Abschnitt des Gehirns zu sehen ist für akustische Druck von 0,36 MPa (n = 3), 0,52 MPa (n = 4) und 5,0 MPa (n = 1). Fehlerbalken zeigen Standardfehler. Die zweite Platte zeigt ein Beispiel einer schweren roten Blutkörperchen Extravasation aus dem Gehirn ausgesetzt 5,0 MPa (Aus Howles et al. 12).
Abbildung 6. Quantitative Verhaltenstests wurde verwendet, um Aktivität, Erregung, und Reaktionsfähigkeit vor der Narkose zu bewerten und 3 und 24 Stunden nach dem Erwachen aus der Narkose. Das Scoring-System, vorher beschriebenen 12, wurde auf der etablierten quantitativen Beurteilung Maus Verhaltensstörungen entwickeln, basierted von Irwin im Jahr 1968 22. Die durchschnittliche Verhalten (± SEM) des Gastes für die Kontrolle (n = 3) und BOMUS (0,36 MPa) behandelt wurden (n = 8) Tieren gezeigt. Bezogen auf die Pre-Narkose Grundlinie, zeigen alle Tiere eine Abnahme des Verhaltens der Gäste 3 Stunden nach der Narkose, aber sie weitgehend durch den nächsten Tag zu erholen. Zu jedem Zeitpunkt wurde kein Unterschied zwischen den beiden Gruppen zu sehen, was darauf hinweist, dass BOMUS nicht messbar beeinflussen das Verhalten von Tieren (Übernommen aus Howles et al. 12).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier wurde ein Verfahren zur nicht-invasiven Öffnen der BBB im gesamten Gehirn der Maus mit Ultraschall und Mikrobläschen (BOMUS) dargestellt. Mit dem BBB offen, Mn 2 + verabreicht wurde und activation-induced Mangan-MRT (AIM MRT) wurde auf Bild neuronale Reaktion auf kurzzeitige Stimulation in leicht sedierten Mäusen verwendet.
Angemessene BBB Öffnung wurde mit einem Spitzenwert-negativen akustischen Druck von 0,36 MPa erreicht. Hinweis: Dies ist der Druck an der Kopfhaut Oberfläche in der Mitte des Ultraschall-Strahls. Messungen der Einzel-Element-Wandlers Strahlprofil zeigen, dass der Schalldruck am Strahlteiler Kante nur etwa 0,12 MPa beträgt. Anschließend reduziert Dämpfung durch den Schädel der Druck zum Gehirn um schätzungsweise 25% (basierend auf Derating Choi et al. Bereinigt um 23 und Frequenz). Dies bedeutet, dass Störungen in Spitzenzeiten BBB-negativen akustischen Druck von 0,09 MPa aufgetreten ist (in der Mitte der Strahl) Bis 0,03 MPa (an der Grenze). Diese Drücke sind niedriger als die (in der Regel 0,4 bis 0,5 MPa) an anderer Stelle berichtet 24. Dieser Unterdruck Schwellenwert kann auf der höheren Dosis von Lipid Mikrobläschen in dieser Arbeit (etwa 1,2 ml / kg) im Vergleich zu anderen Benutzern. Während die Dosis von Mikrobläschen verwendet wurde, war höher als die empfohlene Dosis für den Menschen Diagnostik (10 l / kg) wurden negative Effekte nicht beobachtet.
Wie hier angegeben, ist die nicht-invasive Technik BOMUS und reversibel, allerdings hat sie das Potenzial, Schaden zu verursachen. In früheren Arbeiten 12, wurden Mäuse mit BOMUS behandelt histologische Schäden (Abbildung 5) und Verhaltensänderungen (6) bewertet. Peak-negativen akustischen Druck von 0,36 MPa wurden ohne beobachtete negative Effekte (Abbildung 6) verbunden sind. Jedoch wurden 0,52 MPa-BOMUS mit einer kleinen Anzahl von roten Blutkörperchen intrazerebrale Extravasate in einer Untergruppe von den Tieren verbunden ( So wie die BOMUS Technik ist potenziell schädlich, das Mangan hat auch bekannt Toxizität 25. Mn 2 + ist bekannt, dass toxische Effekte auf der neuromuskulären Endplatte 26 und 27 Nervensystem haben. Diese Toxizität ist wahrscheinlich verantwortlich für die Schläfrigkeit der Mäuse nach der Verabreichung, obwohl der Mechanismus dieser Wirkung ist unbekannt. Für etwa die ersten 60 Minuten der Stimulation, bleibt die Maus etwas schläfrig, aber immer noch als Reaktion auf schmerzhafte Reize wie eine Prise Zeh. Dies ermöglicht die Maus, um die Stimulation ohne körperlichen Zwanges tolerieren. Nach unserer Erfahrung ist dies ausreichend für Somnolenz etwa 60 Minuten nach dem das Tier unruhig werden kann. Zusätzliche chemische Zurückhaltung kann eine seinchieved wie etwa 15 Sekunden von 5% Isofluran über Nasenkegel benötigt. In diesem Beispiel ermöglicht die Schläfrigkeit der Stimulation des Vibrissen, aber es kann auch die neuronale Antwort im Barrel Cortex verringert haben. Neben dem einfachen Verabreichung Mn 2 +, kann die BOMUS Technik verwendet, um global verwaltet anderen diagnostischen oder therapeutischen Mitteln verabreicht werden. In früheren Arbeiten, BOMUS verwendet wurde, um Gd-DTPA, ein MRT-Kontrastmittel, an das Gehirn verabreichen. Zwölf Dennoch bleiben viele Fragen über die Natur des BBB Durchlässigkeit mit BOMUS erreicht. Erstens ist es nicht klar, welche Größe Agenten in der Lage, die BHS nach BOMUS überqueren sind. Sowohl Mn 2 + und Gd-DTPA (500 Da) sind relativ kleine Moleküle. Zweitens ist nicht klar, wie viel die Permeabilität der BHS über das Gehirn unterschiedlich. Drittens ist es nicht klar, ob die BBB Eröffnung ein relativ binäre Wirkung ist, oder wenn gewisse Öffnung Parameter können Sie die Größe oder die Geschwindigkeit des Materials beeinflussenPermeation. Obwohl Gd-DTPA verteilt relativ gleichmäßig über das Gehirn in der oben genannten Studie, kann es schon zu klein und zu diffusionsfähig, um etwaige Unterschiede in der Permeabilität verraten haben. Trotz dieser Unsicherheiten in Bezug auf die BOMUS, ist die Methode wirksam für die schnelle Verwaltung von Mn 2 + zum Zweck der AIM-MRT. AIM-MRT hat in Mäusen verwendet worden, um neuronale Reaktion auf langfristige (1-2 Tage) Stimulation in Mäusen 28-30 abzubilden, aber mit diesem neuen Ansatz sind kurzfristige Stimulation Experimente nun möglich. Zuvor ist die rasche Verabreichung von Mn 2 + war nur mit osmotische BBB Störungen mit Hilfe eines intracarotid Infusion von hypertonischen Mannit möglich. Dieser Ansatz war nur praktisch bei Ratten und größeren Tiermodellen, aber auch bei Ratten, diese Studien wurden von der Invasivität und Einseitigkeit der Technik begrenzt. Weil BOMUS invasiv durchgeführt werden können, sollte wach Stimulation und Längsschnittstudien nun möglich sein. Darüber hinaus becaverwenden Mn 2 + kann auf beiden Hemisphären verabreicht werden, sind eine breitere Palette von Stimulation Paradigmen möglich. In dem obigen Demonstration, die bilateralen Verwaltung Mn 2 + erlaubt die unstimulierten Hemisphäre als interne Kontrolle handeln, so dass neuronale Reaktion auf unspezifische Hintergrund Stimulation aus der Antwort auf die einseitige Vibrissen Stimulation getrennt werden konnten. Neben der Steuerung für die unspezifische Stimulation Hintergrund, der nicht stimulierten Hemisphäre auch verwendet wurde, um für die Homogenität und Konsistenz des Mangan-Verwaltung zu kontrollieren. Wie in anderen Mangan-MRT Versuche 19 zu sehen ist, zeigen die Verteilung von Daten (4), dass die BOMUS Technik keine homogene eine Verbesserung des Gehirns. So ohne angemessene Kontrollen (Kontroll-Tieren oder unstimulierten Hemisphäre), sind Regionen mit höheren Baseline-Erweiterung nur schwer von Regionen, deren Elemente zu unterscheidenviert Signal durch, um neuronale Aktivität. Obwohl der Grundlinie Mn 2 +-Erweiterung ist nicht homogen, ist das Muster ziemlich konsistent zwischen den Individuen. Dennoch könnten kleinere Abweichungen in dieser Grundlinie Enhancement darüber hinwegtäuschen, AIM-MRT-Signal. In dieser Demonstration haben wir uns dieses potenzielle Problem durch Mittelung der AIM-MRT-Signal über mehrere Tiere. Alternativ könnten Unterschiede in der Baseline-Erweiterung für den Erwerb von Vorstimulation Bilder berücksichtigt werden. Die hier vorgestellte Methode erfordert erhebliche statistische Bildanalyse, die wiederum erfordert High-Fidelity-Bild-Registrierung. Natürlich ist diese Registrierung nur sinnvoll, wenn die Quelldaten mit einer Auflösung (in allen drei Dimensionen), die ausreichend feiner als die Strukturen von Interesse ist, erworben wird. In dieser Demonstration wurden 3D-Bilder mit annähernd isotropen Voxeln etwa 160 Mikrometern in jeder Dimension, die für exzellente erlaubt erworbenanatomischen Registrierung. Dennoch können Bildregistrierung begrenzen die räumliche Auflösung dieser Methode eine leichte Fehlregistrierung-Durchschnitt könnte-out sehr kleine Bereiche der Verbesserung. Des Kleinhirns und Riechkolben kann besonders schwierig sein sich zu registrieren, weil sie eine fein geschichtete Verstärkung und haben sich oft aus der Ausrichtung mit dem Großhirn. Hier haben wir eine Methode zur Abbildung neuronaler Reaktion auf kurzzeitige Reize an wachen Mäusen vorgestellt. Obwohl nicht einfach ist, ist das Verfahren relativ praktisches und zugänglich. Diese detaillierte Diskussion der Grenzen und Feinheiten sollte hoffentlich ermöglichen es dem Leser, die Technik, ihre eigenen experimentellen Fragestellungen anzuwenden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Alle Arbeiten wurden an der Duke Center for In Vivo Microscopy, ein NIH / NIBIB durchgeführt nationalen Biomedizinische Technologie Resource Center (P41 EB015897) und NCI Small Animal Imaging Resource Program (U24 CA092656). Zusätzliche Unterstützung wurde von der NSF Graduate Research Fellowship (2003014921) zur Verfügung gestellt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hydrophone | Sonora Medical Systems, Longmont, CA | SN S4-251 | |
| Translation stage | Newport Corporation, Irvine, CA | ||
| Ultrasound transducer | Olympus NDT, Inc., Waltham MA | A306S-SU | Review the manufacturer's test sheet that accompanies the transducer to find the exact center frequency of that particular transducer, which may differ from the nominal frequency listed in the catalog. (e.g., the nominal frequency of our transducer was 2.25 MHz, but the actual center frequency was 2.15 MHz.) |
| Vevo Imaging Station | VisualSonics, Inc. Toronto, Canada | ||
| 50 dB power amplifier | E&I, Rochester, NY | model 240L | |
| Signal generator | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | model 33220A | |
| MnCl2-(H2O)4 | Sigma | Molecular weight varies by batch, call manufacturer for exact measurement | |
| Perflutren lipid microspheres | Lantheus Medical Imaging, N. Billerica, MA | DEFINITY | |
| Microsphere agitator | Lantheus Medical Imaging, N. Billerica, MA | VIALMIX | |
| MR imaging coil | m2m Imaging Corp., Hillcrest, OH | 35 mm diameter quadrature transmit/receive volume coil | |
| MRI system | GE Healthcare, Milwaukee, WI | GE EXCITE console operating a 7-T horizontal bore magnet | |
| Image analysis environment | Visage Imaging, San Diego, CA, MathWorks, Natick MA | Amira MATLAB |
References
- Aoki, I. Detection of the anoxic depolarization of focal ischemia using manganese-enhanced MRI. Magnet. Reson. Med. 50, 7-12 (2003).
- Aoki, I. Dynamic activity-induced manganese-dependent contrast magnetic resonance imaging. DAIM MRI). Magnet. Reson. Med. 48, 927-933 (2002).
- Duong, T. Q., Silva, A. C., Lee, S. P., Kim, S. G. Functional MRI of calcium-dependent synaptic activity: Cross correlation with CBF and BOLD measurements. Magnet. Reson. Med. 43, 383-392 (2000).
- Lin, Y. J., Koretsky, A. P. Manganese ion enhances T-1-weighted MRI during brain activation: An approach to direct imaging of brain function. Magnet. Reson. Med. 38, 378-388 (1997).
- Lu, H. B. Cocaine-induced brain activation detected by dynamic manganese-enhanced magnetic resonance imaging (MEMRI). P. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 2489-2494 (2007).
- Drapeau, P., Nachshen, D. A. Manganese fluxes and manganese-dependent neurotransmitter release in presynaptic nerve-endings isolated from rat-brain. J. Physiol-London. 348, 493-510 (1984).
- Narita, K., Kawasaki, F., Kita, H. Mn and Mg influxes through Ca channels of motor-nerve Terminals are prevented by verapamil in Frogs. Brain Res. 510, 289-295 (1990).
- Hynynen, K., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F. A. Noninvasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits. Radiology. 220, 640-644 (2001).
- Sheikov, N., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F., Hynynen, K. Cellular mechanisms of the blood-brain barrier opening induced by ultrasound in presence of microbubbles. Ultrasound Med. Biol. 30, 979-989 (2004).
- McDannold, N., Vykhodtseva, N., Raymond, S., Jolesz, F. A., Hynynen, K. MRI-guided targeted blood-brain barrier disruption with focused ultrasound: Histological findings in rabbits. Ultrasound Med. Biol. 31, 1527-1537 (2005).
- McDannold, N., Vykhodtseva, N., Hynynen, K. Targeted disruption of the blood-brain barrier with focused ultrasound: association with cavitation activity. Phys. Med. Biol. 51, 793-807 (2006).
- Howles, G. P. Contrast-enhanced in vivo magnetic resonance microscopy of the mouse brain enabled by noninvasive opening of the blood-brain barrier with ultrasound. Magnet. Reson. Med. 64, 995-1004 (2010).
- Howles, G. P., Qi, Y., Johnson, G. A. Ultrasonic disruption of the blood-brain barrier enables in vivo functional mapping of the mouse barrel field cortex with manganese-enhanced MRI. Neuroimage. 50, 1464-1471 (2010).
- Woolsey, T. A., Welker, C., Schwartz, R. H. Comparative anatomical studies of sml face cortex with special reference to occurrence of barrels in layer-4. J. Comp. Neurol. 164, 79-94 (1975).
- Howles, G. P., Nouls, J. C., Qi, Y., Johnson, G. A. Rapid production of specialized animal handling devices using computer-aided design and solid freeform fabrication. J. Magnet. Reson. Imag. 30, 466-471 (2009).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , 2nd edn, Academic Press. (2001).
- Cross, D. J. Statistical mapping of functional olfactory connections of the rat brain in vivo. Neuroimage. 23, 1326-1335 (2004).
- Venot, A., Lebruchec, J. F., Golmard, J. L., Roucayrol, J. C. An automated-method for the normalization of scintigraphic images. J. Nucl. Med. 24, 529-531 (1983).
- Aoki, I., Naruse, S., Tanaka, C. Manganese-enhanced magnetic resonance imaging (MEMRI) of brain activity and applications to early detection of brain ischemia. Nmr. Biomed. 17, 569-580 (2004).
- Welker, E., Vanderloos, H. Quantitative correlation between barrel-field size and the sensory innervation of the whiskerpad - a comparative-study in 6 strains of mice bred for different patterns of mystacial vibrissae. J. Neurosci. 6, 3355-3373 (1986).
- McCasland, J. S., Woolsey, T. A. High-resolution 2-deoxyglucose mapping of functional cortical columns in mouse barrel cortex. J. Comp. Neurol. 278, 555-569 (1988).
- Irwin, S. Comprehensive observational assessment : A systematic quantitative procedure for assessing behavioral and physiologic state of mouse. Psychopharmacologia. 13, 222-257 (1968).
- Choi, J. J., Pernot, M., Small, S. A., Konofagou, E. E. Noninvasive, transcranial and localized opening of the blood-brain barrier using focused ultrasound in mice. Ultrasound Med. Biol. 33, 95-104 (2007).
- McDannold, N., Vykhodtseva, N., Hynynen, K. Use of ultrasound pulses combined with definity for targeted blood-brain barrier disruption: A feasibility study. Ultrasound Med. Biol. 33, 584-590 (2007).
- Silva, A. C., Lee, J. H., Aoki, L., Koretsky, A. R. Manganese-enhanced magnetic resonance imaging (MEMRI): methodological and practical considerations. Nmr. Biomed. 17, 532-543 (2004).
- Meiri, U., Rahamimoff, R. Neuromuscular transmission - inhibition by manganese ions. Science. 176, 308 (1972).
- Aschner, M., Guilarte, T. R., Schneider, J. S., Zheng, W. Manganese: Recent advances in understanding its transport and neurotoxicity. Toxicol. Appl. Pharm. 221, 131-147 (2007).
- Watanabe, T., Frahm, J., Michaelis, T. Manganese-enhanced MRI of the mouse auditory pathway. Magnet. Reson. Med. 60, 210-212 (2008).
- Yu, X., Wadghiri, Y. Z., Sanes, D. H., Turnbull, D. H. In vivo auditory brain mapping in mice with Mn-enhanced MRI. Nat. Neurosci. 8, 961-968 (2005).
- Yu, X. Statistical mapping of sound-evoked activity in the mouse auditory midbrain using Mn-enhanced MRI. Neuroimage. 39, 223-230 (2008).
