Summary
Sistemáticos ya gran escala sintéticos genéticos (gen-gen o epistasis) pantallas de interacción puede ser utilizado para explorar la redundancia genética y la vía de la diafonía. A continuación, se describe un alto rendimiento cuantitativo sintético tecnología de detección genética amplia, denominada eSGA que hemos desarrollado para la aclaración de las relaciones y explorar epistatic interacción en redes genéticas
Abstract
Fenotipos están determinados por una serie compleja de física (por ejemplo, proteína-proteína) y funcionales (por ejemplo, gen-gen o genética) interacciones (GI) 1. Aunque las interacciones físicas pueden indicar que las proteínas bacterianas se asocian en forma de complejos, que no necesariamente revelan nivel vía-relationships1 funcionales. Pantallas GI, en las que se mide el crecimiento de los mutantes dobles que llevan dos genes eliminados o inactivados y en comparación con los mutantes individuales correspondientes, puede iluminar dependencias epistática entre loci y por lo tanto, proporcionar un medio para consultar y descubrir nuevas relaciones funcionales 2. Mapas a gran escala GI se ha informado de los organismos eucariotas como las levaduras 3-7, pero la información sigue siendo escasa GI para procariotas 8, que impide la anotación funcional de genomas bacterianos. Con este fin, nosotros y otros han desarrollado de alto rendimiento métodos cuantitativos de detección de bacterias gastrointestinales 9, 10
A continuación, se presentan los principales pasos necesarios para realizar cuantitativo E. coli sintético de matriz genética (eSGA) procedimiento de detección en una escala del genoma 9, utilizando conjugación bacteriana natural y la recombinación homóloga para generar sistémicamente y medir la aptitud de un gran número de mutantes dobles en un formato de matriz de colonia. Brevemente, un robot se utiliza para transferir , a través de la conjugación, cloranfenicol (Cm) - marcado alelos mutantes de Hfr ingeniería (alta frecuencia de recombinación) 'cepas donantes en una serie ordenada de kanamicina (Kan) - F-receptores marcados cepas. Típicamente, se utiliza la pérdida de función de los mutantes individuales no esenciales que llevan deleciones del gen (por ejemplo, la colección "Keio '11) y mutaciones de genes esenciales hipomórficos alelos (es decir, que confieren expresión de proteínas reducida, estabilidad, actividad o 9, 12, 13) a consultar a las asociaciones funcionales de genes no esenciales y esenciales, respectivamente. Después de la conjugación mediada y subsiguiente intercambio genético por recombinación homóloga, los dobles mutantes resultantes se seleccionaron en medio sólido que contiene ambos antibióticos. Después consecuencia, las placas son digitalmente fotografiado y tamaños de colonia son cuantitativamente calificado usando un sistema interno de procesamiento automático de imagen 14. Indicaciones geográficas se revela cuando la tasa de crecimiento de un mutante doble o es significativamente mejor o peor que el esperado 9. No deseados (o negativa) entre las indicaciones geográficas a menudo como resultado mutaciones de pérdida de función en los pares de genes de las vías compensatorias que inciden en el mismo proceso esencial 2. Aquí, la pérdida de un solo gen está tamponada, de tal manera que sea único mutante es viable. Sin embargo, la pérdida de las dos vías es perjudicial y resulta en la letalidad sintética o enfermedad (es decir, crecimiento lento). A la inversa, aliviar (o positivo) pueden ocurrir interacciones entre los genes en la misma vía o complejo de proteínas como la 2supresión de genes, ya sea solo a menudo es suficiente para perturbar la función normal de la vía o un complejo tal que las perturbaciones adicionales no reducen la actividad, y por lo tanto el crecimiento, aún más. En general, la identificación sistemática y el análisis de redes de GI puede proporcionar mapas globales, recomendaciones, de las relaciones funcionales entre un gran número de genes, de los cuales pueden ser vía la información a nivel perdido por otros enfoques inferidos 9.
Protocol
1. La construcción de cepas donantes Hfr Cavalli mutantes por recombinería 15, 16
Los pasos para la construcción de las manchas de donantes eSGA se describen a continuación. En pocas palabras, usamos λ blanco - rojo mediada la recombinación homóloga 16 de casete amplificado seleccionable marcador fragmentos de ADN generados por PCR para crear no esenciales mutantes de deleción de genes (sección 1.1) o de genes esenciales hypomorphic cepas mutantes donantes (sección 1.2), que luego son utilizados como 'consultas' para definir las redes de GI.
Nota: Durante el proceso de desarrollo tecnológico, se evaluó la eficacia del uso de Hfr mediada por la transferencia conjugativo para la combinación de mutaciones utilizando una cepa bien definido Hfr donante (Hfr Cavalli, Hayes Hfr y Hfr 3000). Examinamos (i) la capacidad de hacer de manera eficiente mutantes donantes utilizando el método recombinería iniciada por Yu et al. (2000) 16, (ii) las eficiencias relativasde transferencia de ADN conjugativo de diferentes marcadores cromosómicos, y (iii) los efectos de la posición y orientación del gen cromosómico consulta relativa a la transferencia locus Hfr, oriT. Se encontró que λ - Red mediada por recombinación homóloga eficiencia fue mucho mayor en Hfr Cavalli que en Hfr Hayes o Hfr3000. Si es necesario, la transducción de P1 o una cepa Hfr Psuedo 17, se puede utilizar para crear mutantes donantes. Hemos adaptado con éxito todos estos métodos para elaborar y seleccionar un gran número de donantes. Como en nuestros experimentos de prueba de conjugación, la eficacia global de la transferencia y el número de ex-conjugantes observado fue significativamente mayor con Hfr Cavalli, este fondo cepa particular fue elegida para la construcción de los donantes y eSGA gran escala. Todos los procedimientos para pantallas eSGA utilizando Hfr donantes Cavalli se describen.
- Amplificar el fragmento de ADN para recombinería posterior para eliminar un gen no esencial
Emplear dos etapas nested PCR amplificadosficación (Figura 1) para crear un casete de deleción del gen para la sustitución del marco de destino de lectura abierto con un marcador de resistencia a Cm en el plásmido pKD3 (GI: 15554330; Identificación de proteínas: AAL02033.1) 15. El marcador está flanqueado por el 11-FRT sitios permite la eliminación del gen de resistencia, en caso necesario, en el seguimiento de los experimentos.
Nota: no anidado PCR de dos etapas para eliminar el plásmido a partir del producto amplificado que se utiliza posteriormente para transformar las células bacterianas. Extracción del plásmido (en la primera PCR) y luego crear el casete de knockout de genes en la segunda PCR es necesaria porque la transformación con un plásmido que es mucho más eficiente que recombinería, y el objetivo es obtener - tanto como sea posible - sólo las cepas que tienen sustituido con éxito el ADN genómico específico con el marcador seleccionable. Una alternativa a la PCR anidada es realizar una digestión de restricción del plásmido fuera de la región amplificada en la segunda PCRel paso. Después, el producto de la digestión de restricción se purifica y se utiliza como una plantilla en la PCR anidada paso (1.1.2). Esta opción también es simple, pero requiere más trabajo a tiempo.- Use aproximadamente 45 ng de pKD3 como molde en la PCR con cebadores R1 hacia delante f1 y de reversa para producir un producto de 1.070 pb. Se purifica el fragmento de PCR utilizando el protocolo Qiagen de purificación de PCR, y diluir el producto en agua destilada estéril a 5 ng / l concentración.
- Usando el producto de PCR purificado como una plantilla, establecer una segunda PCR con genes específicos-(por ejemplo knockout) cebadores anidados, F2 y R2, que tienen (i) 45 nt de regiones de homología de genes específicos en el 5'-extremos para permitir para la recombinación homóloga inmediatamente aguas arriba y aguas abajo del gen diana para reemplazarlo con el marcador de resistencia a Cm y (ii) 20 nt en los extremos 3 'para cebar la síntesis del marcador Cm. El tamaño del fragmento producido es 1.123 pb. Las regiones de homología de genes específicos están diseñados para eliminar la op objetivoen el marco de lectura, dejando los segmentos adyacentes o superpuestos parcialmente codificación intacta. Después de esta ampliación, vaya al paso 1.3.
- Ampliando un casete de etiquetado para la creación de una mutación en el gen esencial hypomorphic
- Para construir cepas mutantes hipomórficos donantes, añadir un C-terminal del péptido de afinidad secuencial (SPA) tag de fusión, que a menudo afecta ligeramente función de la proteína esencial por la abundancia de transcripción desestabilizador (es decir, número de copias de proteína) o de plegamiento de proteínas / actividad. Para este fin, crear un seleccionable SPA-tag (SPA-Cm) plantilla de ADN mediante la conversión del marcador de resistencia a Kan en pJL148 a 18 cm, utilizando recombinería entre idénticas secuencias de nucleótidos que flanquean el marcador Kan en pJL148 y el marcador Cm en pKD3 15. La plantilla resultante consiste en marco SPA-etiqueta seguido de un marcador de resistencia a Cm, y es adecuado para la amplificación por PCR, la recombinería y posterior eSGA 12.
Nota: </ Strong> los genes esenciales son potencialmente los más interesantes para estudios de la función génica. Sin embargo, debido a que estos genes no se pueden eliminar, métodos innovadores tuvo que ser desarrollado para investigar las relaciones funcionales de los genes esenciales. Varios enfoques adecuados gran éxito se han desarrollado inicialmente en la levadura. Por ejemplo, Davierwala et al. (2005) 19 GI realizadas pantallas utilizando un panel de 575 mutantes sensibles a la temperatura de genes esenciales, y encontraron que los genes esenciales presentaba aproximadamente cinco veces el número de las indicaciones geográficas como los genes no esenciales. Asimismo, Breslow et al. (2008) 20 desarrollado una "disminución de la abundancia de ARNm de perturbación '(húmedo) enfoque para generar una biblioteca de alelos hipomórficos cubren ~ 82% de los genes de levadura para estudiar las vías esenciales y complejos. El enfoque húmedo modifica el extremo 3 'del mRNA expresado, la reducción del nivel del gen objetivo 6, probablemente debido a la desestabilización del ARNm. Al igual que el enfoque húmedo 6, nuestro estrategy ha sido explotar los efectos sutiles de perturbar el extremo 3 'del ARNm expresado de proteínas esenciales.
Como se describe abajo, la etiqueta por sí mismo no es probable afectar el plegamiento de proteínas o de la función, pero la perturbación sutil del ARNm por la etiqueta es suficiente, cuando se combina con factores de estrés ambiental u otras mutaciones, para revelar funcionalmente informativo genes y medio ambiente 13 y gen -gen 9, 12 interacciones.
En primer lugar, hasta la fecha, hemos utilizado SPA-tags para purificar las proteínas de E. ~ 3.000 esenciales y no esenciales coli 21-23, con más del 80% de los 307 E. coli proteínas esenciales están representados entre nuestras cepas etiquetados SPA-8. Puesto que la etiqueta se utilizó con éxito para aislar complejos de proteínas conocidas, que se validaron recíprocamente (es decir, el mismo complejo puede ser aislado por el marcado y la purificación de proteínas a partir de diferentes dentro del mismo complejo), y los complejos aislados eran biológicamente relevante, razón por la que las etiquetas hacerpor lo general no afectan el plegamiento de proteínas o de la función 12. Del mismo modo, nuestras observaciones no publicadas revelaron que la etiqueta por sí mismo generalmente no afecta el crecimiento de la cepa. Sin embargo, razonamos que la alteración de la 3'-UTR mediante la integración de la etiqueta y el casete de marcador, como se informó para las cepas 6 húmedo, podría desestabilizar ciertas transcripciones en el nivel de ARN o, en raras ocasiones, impedir el plegamiento correcto o la función de la proteínas de fusión. Por lo tanto, se predijo que la combinación de tales perturbado alelos de los genes esenciales con otras mutaciones relevantes funcionalmente otras partes del genoma se traduciría en IG informativo, que de hecho se observó 9, 12. Alelos Además, SPA-etiquetados de genes esenciales exhibe interacciones gen-ambiente (por ejemplo, hipersensibilidad de drogas) de acuerdo con el trabajo de perfiles fenotípica por Nichols et al. (2011) 13, que sometió a un subconjunto de SPA-etiquetados cepas esenciales para una variedad de condiciones de crecimiento. El mismo estudio confirmed que la mayoría (54 de 58 probados) SPA-etiquetados cepas esenciales mostraron aptitud deterioro en una o más condiciones de cultivo de 13, lo que apoya la idea de que la SPA-etiqueta a menudo crea leves hypomorphic alelos en los genes esenciales que son útiles para todo el genoma GI incluyendo aplicaciones de pantalla eSGA. - Amplificar el casete de etiquetado de la plantilla de SPA-Cm usando cebadores específicos del gen S1 y S2, cada uno contienen (i) un 45 nt de genes específicos de la región homóloga para recombinería en el extremo 5 ', seguido por (ii) un 27 pb SPA- Cm secuencia específica en el extremo 3 '.
- Para construir cepas mutantes hipomórficos donantes, añadir un C-terminal del péptido de afinidad secuencial (SPA) tag de fusión, que a menudo afecta ligeramente función de la proteína esencial por la abundancia de transcripción desestabilizador (es decir, número de copias de proteína) o de plegamiento de proteínas / actividad. Para este fin, crear un seleccionable SPA-tag (SPA-Cm) plantilla de ADN mediante la conversión del marcador de resistencia a Kan en pJL148 a 18 cm, utilizando recombinería entre idénticas secuencias de nucleótidos que flanquean el marcador Kan en pJL148 y el marcador Cm en pKD3 15. La plantilla resultante consiste en marco SPA-etiqueta seguido de un marcador de resistencia a Cm, y es adecuado para la amplificación por PCR, la recombinería y posterior eSGA 12.
- Confirmación y purificando el producto de la PCR
- Confirmar que el casete de etiquetado se ha amplificado correctamente sometiendo 2-5 l del producto de PCR a electroforesis en gel de agarosa y se purifica el ADN restante siguiendo el protocolo estándar del fabricante purificación de PCR (Qiagen). Eluir el producto de la PCR en 30 l de agua destilada estéril y se diluye hasta ~ 50 ng / l de concentración. La purificacióned producto se puede utilizar inmediatamente en transformación (paso 1,5) o se almacenó a -20 ° C durante un máximo de 6 meses hasta su uso.
- Preparación Hfr células competentes Cavalli para la construcción de donantes
- Inocular un ml del cultivo saturado durante la noche de una cepa Hfr Cavalli en 70 ml de fresco Luria-Bertani (LB) con 35 l de 50 mg de ampicilina / ml en un matraz de 250 ml. Incubar el cultivo a 32 ° C con agitación a 220 rpm hasta una densidad óptica (OD) 600 nm de ~ 0.5-0.6 se obtiene (~ 2 h).
- Transferir el cultivo a un baño de agua para la inducción de calor del sistema de recombinación λ rojo 16 a 42 ° C durante 15 min con agitación a 160 rpm. Detener la inducción mediante la transferencia del cultivo a un baño de agua enfriada con hielo suspensión durante 10-20 min a 160 rpm. Asegúrese de mantener las células en frío a partir de este punto hasta después de la transformación; Tubos de uso y las cubetas que han sido refrigerados en hielo durante al menos 15 min antes de su uso.
- Divida la cULTURA igualmente en 2 preenfriados tubos de polipropileno de 50 ml (~ 35 ml de cultivo por tubo) y se centrifuga a 4.400 xg durante 6 min a 4 ° C.
- Eliminar el sobrenadante y volver a suspender el sedimento celular por inversión suave en ~ 50 ml de hielo-agua fría destilada estéril. Centrifugar las células de nuevo a 4.400 xg durante 6 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y volver a suspender cada sedimento de células en 20 ml de helado de glicerol estéril al 10% y se centrifuga de nuevo como se describió anteriormente.
- Decantar el sobrenadante y volver a suspender el sedimento celular en 500 l de hielo frío 10% de glicerol. Dividir en partes alícuotas de las células competentes preparadas en 50 volúmenes mu l en individuales, pre-refrigerado de 1,5 ml de microcentrífuga tubos para la transformación inmediata. Las células pueden ser congeladas en hielo seco o nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C durante un máximo de 3 meses. Sin embargo, la eficiencia de transformación más alta es recién preparadas con células competentes.
- Transformación
- Añadir 100 ng de producto de PCR purificado a partir1.3.1 paso a las células competentes. Flick el tubo y permitir la suspensión de sentarse en hielo durante 5 min.
- Transferir la suspensión de helado de células competentes y el ADN a una cubeta de electroporación previamente enfriada. Electroporar mezcla de células con el 2,5 kV, 25 uF, 200 ohms poner en un hueco de 2 mm cubeta (es decir, si se utiliza una cubeta diferente, por favor, consulte las instrucciones del fabricante para la configuración de electroporación), e inmediatamente se añade 1 ml de la temperatura del medio ambiente SOC. Transferir las células electroporadas en medio SOC en un tubo de cultivo de 15 ml y se incuba a 32 ° C durante 1 hora con agitación orbital a 220 rpm.
- Después de la incubación, centrifugar las células a 4.400 xg durante 5 min a temperatura ambiente. Retire aproximadamente 850 l del sobrenadante, y volver a suspender el sedimento celular en el líquido restante.
- Extender las células en placas de LB precalentado conteniendo 17 g / ml de Cm y se incuba a 32 ° C durante la noche. Escoja dos colonias transformantes individuales y raya a cabo en LB-Cm placas para confirmación mutante. Se recomienda evitar las grandes colonias transformantes con el fin de reducir la posibilidad de recoger las cepas con raras mutaciones supresoras. También racha de los transformantes mismos sobre LB-Kan para confirmar que las cepas no son Kan resistente.
Nota: Dado que el marcador de resistencia a Cm se utiliza para hacer las cepas donantes, no esperamos que los mutantes de donantes para ser resistente Kan. Al rayar los transformantes en ambos LB-Kan y placas LB-Cm, nos aseguramos de que la mutación en sí no donante de alguna manera, la presión del Kan. Si este paso no se realiza y las mutaciones objetivo fueron afectar a la capacidad de la cepa para sobrevivir en Kan, dobles mutantes no se haría efectivamente usando eSGA ya que las cepas donantes sobreviviría todos los pasos de selección. Esto es simplemente una medida de precaución lógica para capturar fenotipos inesperados o cualquier otra cuestión que pueda interferir con la realización de las pantallas eSGA. Si este paso se omite, controles pareciera otrosiendo d identificar pantallas fallidos. Sin embargo, una detección más temprana de un donante que es resistente a Kan eliminaría una serie de pasos improductivos e innecesarios. Otras posibles razones para una cepa para crecer en Kan podrían incluir, por ejemplo expirado antibiótica, así como el uso de un mal producto de PCR o de una cepa para la transformación. Todos estos problemas pueden ser identificados y tratados tempranamente en el proceso con la ayuda de este control, que no es obligatorio, pero se recomienda para eSGA.
- Confirmación de la deleción del gen no esencial (paso 1.6.1) o mutación del gen esencial hypomorphic (sección 1.6.2)
Nota: Cuando se confirma la supresión de genes por PCR, el ADN genómico de una cepa de tipo salvaje debe ser utilizado como un control.- Confirmando no esencial deleción del gen
- Para confirmar la eliminación de genes por PCR, aislar el ADN genómico de las cepas transformadas, knockout putativo cultivadas en líquido LB-Cm medio, después de la FABRICACIÓNinstrucciones urer (Promega).
- Para confirmar recombinería éxito, amplificar el ADN de cada transformante con tres conjuntos diferentes de cebadores de confirmación de final. Realizar las reacciones con ~ 150 ng de molde de ADN genómico, y confirmar los tamaños de los fragmentos correctos mediante la ejecución de los productos de PCR-sintetizados sobre un gel de agarosa.
- El conjunto de cebadores primero se compone de un 20-nt cebador flanqueante, localizado 200 pb aguas arriba de la región diana (KOCO-F), y el cebador Cm-R, que es complementaria a la secuencia de casete Cm. Esta amplificación se espera para producir un amplicón de 445 nt en el mutante, pero no en la cepa de tipo salvaje (Figura 1).
- El segundo conjunto incluye un cebador directo (Cm-F), hibridación a la secuencia de casete Cm, y un reverso 20-nt flanqueantes cebador confirmación (KOCO-R), que está diseñado para hibridarse 200 pb aguas abajo del extremo 3 'de la eliminada gen. Esta reacción de amplificación se espera para producir un amplicón de 309 nt en el mutante, pero not en la cepa de tipo salvaje (Figura 1).
- La tercera PCR contiene KOCO-F y cebadores KOCO-R. Esta reacción es necesario para confirmar que la cepa seleccionada no es un merodiploide, con un locus de gen que ha sido reemplazada por el casete y duplicados otro pero por lo demás de tipo salvaje copia del gen presente todavía. Esta amplificación de un mutante de deleción correctas se espera que produzca un producto de 1,4 kb (Figura 1).
Nota: Cuando el gen diana tiene aproximadamente la misma longitud en pares de bases como el casete de deleción del gen, no se advierte una diferencia entre un locus que ha sido sustituido por el casete, y un lugar, que no tiene. Para una confirmación definitiva en tales casos, se recomienda utilizar cebadores adicionales para amplificar específicamente un segmento de ADN dentro del gen suprimido. En este caso, si el gen ha sido eliminada, un producto de amplificación se observó sólo en la cepa de tipo salvaje de control y no en el mutante. Estos cebadorespuede ser manual o computacionalmente diseñado para amplificar específicamente un segmento de ADN dentro de la región eliminada. Por lo general amplificar 140 bp regiones.
- Confirmación de la mutación del gen esencial hypomorphic
- Para confirmar la mutación hypomorphic por PCR, el uso específico de gen 20-nt hacia adelante (KOCO-F) y cebadores inversos (KOCO-R) ubicadas 200 pb aguas arriba y aguas abajo, respectivamente, del sitio de inserción SPA-tag (Figura 2).
Nota: Este paso de amplificación se usa como un control para asegurar la ausencia de una copia sin marcadores del gen objetivo esencial. Cuando sólo una versión etiquetada está presente, una única banda 310 pb más grande que el amplicón SPA-Cm se observa. Un producto de 400 pb sería una señal de la presencia de la versión etiquetada del gen. - En paralelo a la confirmación de la PCR, el uso de transferencia Western para verificar la inserción en marco de la SPA-tag usando un anticuerpo anti-FLAG M2 específico para la Bandera de epítopos de la SPUna etiqueta-21.
- Para confirmar la mutación hypomorphic por PCR, el uso específico de gen 20-nt hacia adelante (KOCO-F) y cebadores inversos (KOCO-R) ubicadas 200 pb aguas arriba y aguas abajo, respectivamente, del sitio de inserción SPA-tag (Figura 2).
- Confirmando no esencial deleción del gen
- Almacenamiento de la cepa donante confirmado
- Transferir el cultivo durante la noche de la cepa donante confirmado mutante recombinante a los crioviales etiquetados, complementar con glicerol al 15% de concentración final, y mezclar bien. Para almacenamiento a largo plazo, mantener los crioviales a -80 ° C.
2. Arraying E. F-coli receptores mutantes de Pantallas eSGA
- Replica-pin del E. coli Keio sola no esencial colección deleción del gen mutante generado por Mori et al. (3968; 11 cepas F-BW25113; puede obtenerse de Open Biosystems) robóticamente a veinticuatro 384-y microplacas que contienen 80 l de medio LB líquido por pocillo , suplementado con 50 mg / ml Kan
Nota: Para la evaluación sistemática de IG con genes esenciales, el destinatario Keio recogida 11 se puede complementar con el F-Kan-marcado gen esencial hypomorphic cepas mutantes con C-terminales SPA-etiquetas 22, 23. - Para hacer espacio para la cepa de control de frontera, que actuará como un control positivo, ayuda en dentro y entre las normalizaciones de la placa, así como en cuantificaciones de colonias automatizados, eliminar los medios inoculados a partir de los pocillos exteriores de cada placa de la etapa anterior y la transferencia a nuevas placas, dejando de nuevo los pozos ultraperiféricas vacía.
Nota: La cepa de control fronterizo JW5028 de la colección de Keio 11 se suprime un gen pequeño seudo que no debe, y no ha en nuestras pantallas de todo el genoma, exhiben geográficas con cualquier donante. Por lo tanto, esta es una buena cepa de control positivo para determinar los casos raros en que conjugación, fijación, o selecciones han fallado, resultando en el crecimiento de la cepa frontera ausente o esporádica. Por ejemplo, si las colonias de control de fronteras no crecen después de la selección doble mutante, la cepa de consulta puede no ser capaz de conjugación, la conjugación puede haber sido i intentadona condición que impide que tenga lugar (por ejemplo, sobre una placa que contiene el antibiótico), o un antibiótico equivocado puede haber sido añadido a la placa de selección. Del mismo modo, si muy pocas colonias esporádicos se observan en toda la placa, incluyendo la frontera, conjugación o pinning puede haber fallado, y la pantalla tiene que ser repetido. Si este crecimiento esporádico frontera es reproducible, puede indicar conjugación donante consistentemente pobre y por lo tanto los casos en que los dobles mutantes no se observan son, posiblemente debido a un fallo ortográfico no, las indicaciones geográficas verdad. Pantallas de este tipo tendría que ser descartada del análisis adicional. Además, al estar presente en todas las placas, la cepa control de fronteras permite que el software de cuantificación de colonias para determinar automáticamente posiciones de colonias en las placas dobles mutantes y por lo tanto las posiciones de colonias no tienen que ser demarcadas manualmente. Por último, las ayudas fronterizos de control de tensión en la normalización de los tamaños de colonia (por ejemplo, dentro de las diferentes filas dentro de un plato) y entreen (por ejemplo, placas de receptores diferentes cubrió con el mismo donante en diferentes momentos) placas. - Del mismo modo, crear puntos de control negativo mediante la eliminación de cualesquiera dos cepas de un lugar diferente dentro de cada placa (no frontera) y transferir las cepas a una nueva placa. Llenar estos pocillos vacíos con medio LB que contiene 17 mg / ml de Cm. Estos puntos de control negativo se espera que esté vacío en el recipiente y por lo tanto las placas de mutantes dobles y ayudar a asegurar que no había errores de procesamiento o manipulación de la placa cuando numeración, formación de imágenes, o fijando las placas.
Nota: Estos espacios vacíos se requieren controles negativos. Los controles negativos ayudar a identificar casos cuando la selección falla - cuando las cepas de control negativo crecer durante la selección. Sugerimos que no sólo seleccionar únicos puntos de control negativo para cada una de las placas receptoras, pero para elegir también puntos negativos de control dentro del mismo cuadrante de la placa (por ejemplo, inferior derecha). De esta manera, el patrónde los puntos de control negativo sería identificar posibles errores en la placa de uso indebido (por ejemplo, las placas están mal etiquetados o ser clavado cabeza abajo, donde la colonia izquierda superior se fija en la posición inferior derecha). - Inocular la cepa Keio JW5028 11, con una supresión pseudogene, en un matraz de 500 ml con 200 ml de LB, que contiene 50 mg / ml de Kan En base a todo el genoma de pantallas eSGA, el crecimiento de este mutante particular es el más cercano silvestre Tipo de BW25113 y se utiliza así como un control de fronteras.
- Cultivar las cepas en matriz, así como el cultivo JW5028 durante la noche a 32 ° C con 190 rpm de agitación orbital a una DO de ~ 0,4 a 0,6 a 600 nm. Después del crecimiento durante la noche, rellene los pozos fronterizos con aproximadamente 80 l de JW5028 cultivo durante la noche.
- Las placas ensambladas se puede utilizar en el paso 3.2. Alternativamente, para almacenamiento a largo plazo, complementar cada pocillo en las placas receptoras con 15% de glicerol, mezclar los medios de comunicación y glicerol, y mantener las placasa -80 º C.
3. De alta densidad Strain Procedimiento para la generación de apareamiento E. coli mutantes dobles
- Crecer la cepa donante Hfr, teniendo la mutación consulta, marcado con Cm, durante la noche a 32 ° C en medio rico líquido LB-cm (17 g / ml de Cm) con agitación a 220 rpm.
- Pin de la colección ordenada receptor mutante en la densidad de 384 colonias sobre placas de LB sólido suplementado con 50 g / ml de Kan En paralelo, el pin de la cepa mutante consulta donante en la densidad de 384 colonias en el mismo número de placas de LB, suplementado con 17 g / ml de Cm. Se incuban las placas durante la noche a 32 ° C.
Nota: Las placas receptoras utilizadas en la colocación de clavos puede requerir hasta 36 horas para obtener colonias suficientemente grandes para las etapas subsiguientes. Cuando el tamaño promedio de colonias frontera es de aproximadamente 2 mm de diámetro (o mayor), las placas están listas para ser clavado. - Para conjugar las cepas, fijar el donante de una placa de 384 donantes durante la noche en la coloniaa la placa de LB sólido. Posteriormente fijar una sola placa de 384 colonias destinatario sobre el donante recién puestas en la placa de conjugación. Continúe sujetando hasta que todas las placas de donante-receptor se han conjugado fijando en sólidas placas de LB conjugación. Incubar las placas de conjugación articulada en 32 ° C durante 16 a 24 h.
Nota: individuales cepas mutantes donantes individuales pueden mostrar gen-a-gen variabilidad en la eficacia de acoplamiento debido a los posibles efectos de las mutaciones sobre la conjugación, la eficiencia de transferencia de ADN, o aptitud. El crecimiento se puede detener en cualquier momento entre 16 y 24 horas, cuando las colonias suficientemente grandes se han obtenido para las posteriores etapas de colocación de clavos. Conjugaciones que duran 16 a 24 hr producir un número suficiente de ex conjugantes para obtener resultados reproducibles eSGA incluso para los mutantes de los genes tardíos transferencia o mutantes con aptitud ligeramente inferior. - PIN cada placa de conjugación 384-densidad en una placa de LB sólido único, que contienen Cm (17 mg / ml) y Kan (50g / ml) hasta que todas las placas de conjugación se han depositado. Incubar las placas recién prendidas primera selección para 16-36 horas a 32 ° C.
Nota: En lo que respecta a las etapas de selección, diferentes cantidades de tiempo puede ser necesario para las pantallas de diferentes donantes. Puesto que todos los mutantes dobles en una pantalla dada tienen la mutación mismo donante, en promedio, un mutante lento crecimiento donante da lugar a un crecimiento más lento doble mutantes. Así, dependiendo de la condición física de donantes, los pasos de selección puede requerir entre 16 y 36 hr. El crecimiento mutante doble se puede detener cuando los mutantes dobles son suficientemente grandes para el paso siguiente o bien fijando después de la primera selección o formación de imágenes después de la segunda. Esto normalmente se traduce en bordean las colonias de control en promedio con por lo menos 2 mm de diámetro. - Volver a fijar cada placa de selección primero sobre un segundo fármaco, doble (Cm y Kan), placa de selección en formato 1536 de colonias, de tal manera que cada colonia selección primero está representado por cuatro colonias enla placa de segunda selección. Incubar las placas durante 16-36 horas a 32 ° C. Fotografía las placas finales dobles selección de mutantes para medir cuantitativamente la aptitud crecimiento de los mutantes y para analizar las interacciones entre pares de genes (Figura 3).
Nota: Aunque la frecuencia de merodiploidy (parcial duplicaciones cromosómicas) es baja en alrededor de 1/1, 000 células 24, merodiploidy puede enmascarar GI. Por lo tanto, se recomienda incluso se replica biológica en todas las pantallas eSGA. Afortunadamente, comerciales placas de plástico desechables y almohadillas de colocación de clavos puede ser reutilizado hasta tres veces mediante la esterilización de los materiales de la siguiente manera: El agar de las placas se elimina y las placas, así como almohadillas se esterilizan por remojo en lejía al 10% durante la noche, seguido por una enjuague con agua destilada, lavado en etanol al 70%, y secado al aire el material de plástico en una campana de flujo bajo luz ultravioleta. Las almohadillas estériles y las placas se almacenan en bolsas de plástico estériles hasta su uso.
4. Procesamiento de datos y obtener puntuaciones GI
- Medir las colonias en cada placa en modo por lotes o de forma individual usando un software especializado colonia de imágenes 3, 9.
Nota: Una adecuada basada en Java de alto rendimiento de imagen colonia y la aplicación de puntuación está disponible gratuitamente para acceso público ( http://srcollins77.users.sourceforge.net/ ). El software funciona en diferentes plataformas (por ejemplo, Mac o PC) y se puede iniciar ya sea como un archivo ejecutable o desde una ventana de terminal. - Normalizar las mediciones de colonias primas de tamaño mediante la corrección de las desviaciones sistemáticas dentro y entre las placas, tales como los efectos de borde de placa, entre placas efectos de variación, iluminación imagen desigual, artefactos debido a la curvatura física de la superficie del agar, los efectos de competencia para las colonias vecinas y los posibles defectos de colocación de clavos , así como las diferencias en el tiempo de crecimiento
- Las colonias en las filas y columnas de borde tiende a ser mayor debido a la menor competencia por los nutrientes que se encuentran en el centro de la placa. Por lo tanto, para corregir este efecto, la escala de los tamaños de las colonias de borde a ser tal que la mediana del tamaño en esa fila o columna es igual a la mediana del tamaño de las colonias en el centro de la placa.
- Analizar estadísticamente los resultados para tener en cuenta la reproducibilidad y la varianza estándar de los tamaños medios de las mediciones de colonias replicadas. Al menos tres experimentos independientes replicadas biológicos son necesarios para evaluar la reproducibilidad experimental.
- Finalmente, el uso de los medios normalizados de colonias tamaños aptitud de crecimiento para generar una puntuación GI (S) para cada par de genes utilizando la siguiente fórmula:
n 1 "src =" / files/ftp_upload/4056/4056eq1.jpg "/>
Cuando, S = var (var x Exp (Exp. n -1) + var Cont x (n Cont -1)) / (n + n Exp Cont -2); var Exp = la varianza máxima de los tamaños de colonia normalizados para la doble mutante; mediana = var Cont de las variaciones en los tamaños normalizados de colonias mutantes dobles de la serie de referencia; Exp. n = número de mediciones de los tamaños de colonia dobles mutantes, n = Cont la mediana del número de repeticiones experimental sobre todos los experimentos; μ Exp = dimensiones medias de colonias normalizadas de los dobles mutantes, y Cont μ = mediana de tamaños de colonia normalizadas para todos los dobles mutantes derivados de la cepa donante único mutante. La puntuación S refleja tanto la confianza estadística de una interacción digenic putativo, así como la resistencia biológica de la interacción. Strong Positive S-resultados indican efectos aliviar, suggesting que los genes que interactúan participar en la misma vía 9, mientras negativo significativo S-puntuaciones reflejan enfermedad sintético o letalidad, que a menudo es sugerente de pertenencia en vías redundantes paralelos 9. Para la determinación de las relaciones de nivel de vía-funcionales, una única puntuación S para cada par de genes de la prueba se produce a partir del conjunto de datos final.
Nota: En nuestro estudio anterior 9, hemos encontrado que la recombinación tiende a producirse con menos frecuencia entre los genes dentro de 30 kpb de la otra. Por lo tanto, para el análisis de aguas abajo, después de la normalización y la generación de puntuación, se elimina las interacciones entre los genes dentro de 30 kpb de la otra. Además de las indicaciones geográficas sí mismos, las relaciones funcionales entre los pares de genes se puede investigar al ver la similitud de los perfiles de IG de los dos genes son. El perfil de GI de un gen es el conjunto de todas las interacciones de ese gen con todos los otros genes en el genoma de fueraárea de conexión del gen. Genes funcionalmente similares tienden a tener una mayor correlación de los perfiles de interacción genético 12, 25. Así, mediante el cálculo de coeficientes de correlación para todos los genes en el conjunto de datos experimentales se pueden usar eSGA para investigar las relaciones funcionales entre los genes incluso situadas cerca unas de otras en el cromosoma.
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Discussion
Hemos esbozado un protocolo de paso a paso para el uso de robótica de detección eSGA para investigar las funciones de genes de bacterias a un nivel interrogando vía gastrointestinal. Este enfoque puede ser utilizado para estudiar los genes individuales, así como los sistemas biológicos completos en E. coli. Con cuidado, la ejecución de las medidas experimentales descritas anteriormente, incluyendo todos los controles adecuados, y con rigor el análisis y la validación de los datos de forma independiente GI son aspectos clave para el éxito de eSGA para hacer nuevos descubrimientos funcionales. Además de eSGA, un método conceptualmente similar para el estudio de GI en E. coli, denominado GIGANTE coli-17, puede ser usado para iluminar nuevas relaciones funcionales que a menudo se pierden por otros enfoques, tales como la proteómica 23 o fenotípicas 13 pantallas independientes. Sin embargo, como con cualquier enfoque de todo el genoma, no existen limitaciones en la aplicabilidad de eSGA o gigante coli, por ejemplo a otras especies bacterianas. Esto es en parte serála causa de la falta de disponibilidad de todo el genoma únicas colecciones supresión de genes cepa mutante para la mayoría de las especies bacterianas, en particular para las especies donde se ve obstaculizado mutagénesis dirigida por una baja frecuencia natural de la recombinación homóloga. En tales casos, las interrupciones de genes utilizando métodos tales como la mutagénesis al azar rastreables ensayos basados como TnSeq 31 puede ser utilizado potencialmente para la investigación de las funciones del gen bacterial. Para una visión general de las nuevas alternativas procedimientos de detección genética de bacterias, véase el documento de revisión por Gagarinova y Emili (2012) 32.
Aunque los métodos de GI a menudo revelan muchas conexiones interesantes sugerente de nuevos enlaces mecánicos, la integración de estos datos con otra información, como perfiles fenotípicos 13, las redes de interacción física 22, 23, y las asociaciones de GC-inferidos pueden ser particularmente informativa. Por ejemplo, como con las redes de GI, asociaciones de GC, que se basan en la conservaciónde orden de los genes (operones), fusiones del gen bacterial, frecuencias de recombinación operón derivados de distancias intergénicas de operones predijo través de los genomas, así como perfiles filogenéticos 33 puede proporcionar información adicional en cómo una célula bacteriana organiza complejos de proteínas en vías funcionales para mediar y coordinar importante procesos celulares 12, 23.
E. coli es un modelo de caballo de trabajo para la comprensión de la biología molecular de otras bacterias Gram-negativas. Para este fin, los datos eSGA GI puede ser utilizado en conjunción con la información genómica comparativa (por ejemplo, perfiles filogenético, perfiles de expresión génica) para investigar la conservación evolutiva de las relaciones funcionales descubiertos por eSGA a través de otras especies proteobacterial y taxones procariótico. Además, la interacción de datos generado por E. coli se puede utilizar para comprender mejor la arquitectura de la vía de microbios descubierto por metagenomicrófonos, para lo cual se carece de anotaciones funcionales. Dado que muchos genes son ampliamente conservadas a través de todos los microbios 23, y debido a la sensibilidad a antibióticos se puede mejorar ciertas perturbaciones genéticas 34, las relaciones funcionales iluminadas por eSGA puede incluso potencialmente ser explotado para el diseño de terapias de combinación de fármacos innovadores.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por fondos del Genoma Canadá, el Instituto de Genómica de Ontario, y los Institutos Canadienses de Investigación en Salud de las subvenciones a JG AG y AE es un recipiente de Vanier Canadá Becas de Posgrado.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| I. Antibiotics | |||
| Chloramphenicol | Bioshop | #CLR201 | |
| Kanamycin | #KAN201 | ||
| Ampicillin | # AMP201 | ||
| 2. Luria-Bertani medium | |||
| LB powder | Bioshop | #LBL405 | |
| Agar | Bioshop | #AGR003 | |
| 3. Bacterial Strains and Plasmids | |||
| Hfr Cavalli strain λred system (JL238) | Babu et al.14. | ||
| pKD3 | E. coli Genetic Stock Centre, Yale | ||
| Keio E. coli F- recipient collection | National BioResource Project (NBRP) of Japan11 | ||
| Hypomorphic E. coli F- SPA-tag strains | Open biosystems; Babu et al.14 | ||
| 4. Primers | |||
| pKD3-based desalted constant primers | F1: 5'-GGCTGACATGGGAATTAGC-3' R1: 5'-AGATTGCAGCATTACACGTCTT-3' |
||
| Desalted custom primers | Cm-R: 5'-TTATACGCAAGGCGACAAGG-3' Cm-F: 5'- GATCTTCCGTCACAGGTAGG-3' |
||
| Desalted custom primers | F2 and R2: 20 nt constant regions based on pKD3 sequence and 45 nt custom homology regions F2 constant region: 5'-CATATGAATATCCTCCTTA-3' R2 constant region: 5'-TGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3'S1 and S2: 27 nt constant regions for priming the amplification of the SPA-Cm cassette and 45 nt custom homology regions S1 constant region: 5'AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3' S2 constant region: 5'- GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT -3' KOCO-F and KOCO-C: 20 nt primers 200 bp away from the non-essential gene deletion site or the essential gene SPA-tag insertion site |
||
| 5. PCR and Electrophoresis Reagents | |||
| Taq DNA polymerase | Fermentas | # EP0281 | |
| 10X PCR buffer | Fermentas | # EP0281 | |
| 10 mM dNTPs | Fermentas | # EP0281 | |
| 25 mM MgCl2 | Fermentas | # EP0281 | |
| Agarose | Bioshop | # AGA002 | |
| Loading dye | NEB | #B7021S | |
| Ethidium bromide | Bioshop | # ETB444 | |
| 10X TBE buffer | Bioshop | # ETB444.10 | |
| Tris Base | Bioshop | # TRS001 | |
| Boric acid | Sigma | # T1503-1KG | |
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | Sigma | # B6768-500G | |
| DNA ladder | NEB | #N3232L | |
| 6. DNA isolation and Clean-up Kits | |||
| Genomic DNA isolation and purification kit | Promega | #A1120 | |
| Plasmid Midi kit | Qiagen | # 12143 | |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | #28104 | |
| 7. Equipment for PCR, Transformation and Replica-pinning | |||
| Thermal cycler | BioRad, iCycler | ||
| Agarose gel electrophoresis | BioRad | ||
| Electroporator | Bio-Rad GenePulser II | ||
| 0.2 cm electroporation cuvette | Bio-Rad | ||
| 42 °C water bath shaker | Innova 3100 | ||
| Beckman Coulter TJ-25 centrifuge | Beckman Coulter | ||
| 32 °C shaker | New Brunswick Scientific, USA | ||
| 32 °C plate incubator | Fisher Scientific | ||
| RoToR-HDA benchtop robot | Singer Instruments | ||
| 96, 384 and 1,536 pin density pads | Singer Instruments | ||
| 96 or 384 long pins | Singer Instruments | ||
| 8. Imaging Equipments | |||
| Camera stand | Kaiser | ||
| Digital camera, 10 megapixel | Any Vendor | ||
| Light boxes, Testrite 16" x 24" units | Testrite | ||
| 9. Pads or Plates Recycling | |||
| 10% bleach | Any Vendor | ||
| 70% ethanol | Any Vendor | ||
| Sterile distilled water | Any Vendor | ||
| Flow hood | Any Vendor | ||
| Ultraviolet lamp | Any Vendor | ||
| 10. Labware | |||
| 50 ml polypropylene tubes | Any Vendor | ||
| 1.5 ml micro-centrifuge tubes | Any Vendor | ||
| 250 ml conical flaks | VWR | # 29140-045 | |
| 15 ml sterile culture tubes | Thermo Scientific | # 366052 | |
| Cryogenic vials | VWR | # 479-3221 | |
| Rectangular Plates | Singer Instruments | ||
| 96-well and 384-well microtitre plates | Singer Instruments | Nunc | |
| Plate roller for sealing multi-well | Sigma | #R1275 | |
| plates | ABgene | # AB-0580 | |
| Adhesive plate seals | Fisher Scientific | # 13-990-14 | |
| -80 °C freezer | Any Vendor | ||
References
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