Summary
Systematische, grootschalige synthetische genetische (gen-gen of epistase) interactie schermen kunnen worden gebruikt om genetische redundantie en route overspraak verkennen. Hier hebben we een high-throughput kwantitatieve synthetische genetische scala screening technologie te beschrijven, genoemd eSGA door ons ontwikkelde voor het ophelderen van epistatisch relaties en het verkennen van genetische interactie netwerken in
Abstract
Fenotypen bepaald door een complexe reeks fysieke (bv. eiwit-eiwit) en functionele (bijv. gen-gen of genetische) interacties (GI) 1. Terwijl fysieke interacties kunnen aangeven welke bacteriële eiwitten worden geassocieerd als complexen, doen ze niet per se onthullen pad-level functionele relationships1. GI schermen, waarbij de groei van dubbele mutanten voorzien van twee genen verwijderd of geïnactiveerd wordt gemeten en vergeleken met de overeenkomstige enkelvoudige mutanten kunnen verlichten epistatisch afhankelijkheden tussen loci en dus een middel op te vragen en te ontdekken nieuwe functionele relaties 2. Grootschalige GI maps gemeld voor eukaryote organismen zoals gisten 3-7, maar GI informatie blijft dun voor prokaryoten 8, dat de functionele annotatie van bacteriële genomen belemmert. Hiertoe hebben wij en anderen ontwikkeld high-throughput kwantitatieve bacteriële GI screeningsmethoden 9, 10
Hier presenteren we de belangrijkste stappen die nodig zijn om kwantitatieve E. uit te voeren coli Genetic Synthetic Array (eSGA) screening procedure op genoom-schaal 9, met natuurlijke bacteriële conjugatie en homologe recombinatie systemisch genereren en de geschiktheid van grote aantallen dubbele mutanten in een array formaat kolonie te meten. kort wordt een robot gebruikt voor het doorschakelen , door middel van conjugatie, chlooramfenicol (Cm) - gemarkeerde mutante allelen van engineering HFR (hoge frequentie van recombinatie) "donor stammen 'in een geordende reeks van kanamycine (Kan) - gemarkeerde F-ontvanger stammen. Typische toepassingsgebieden loss-of-function enkele mutanten richting niet-essentieel gen deleties (bijvoorbeeld de 'Keio' collectie 11) en essentiële gen hypomorphic mutaties (bijvoorbeeld allelen verleent verminderde eiwitexpressie stabiliteit of activiteit 9, 12, 13) te bevragen de functionele verenigingen van niet-essentiële en essentiële genen, respectively. Na conjugatie en daaropvolgende genetische uitwisseling gemedieerd door homologe recombinatie worden de resulterende dubbele mutanten geselecteerd op vast medium dat beide antibiotica. Na uitgroei worden de platen digitaal belicht en kolonie maten kwantitatief gescoord op een eigen geautomatiseerde beeldverwerkingsysteem 14. GI's worden onthuld wanneer de groeisnelheid van een dubbele mutant is ofwel significant beter of slechter dan verwachte 9. Verzwarende (of negatieve) GA vaak resulteren tussen loss-of-function mutaties in genen paren van compenserende pathways die van invloed zijn op dezelfde essentiële proces 2. Hier wordt het verlies van een gen gebufferd, zodat zowel enkelvoudige mutant levensvatbaar is. Het verlies van beide routes schadelijk is en resulteert in synthetische letaliteit of ziekte (langzame groei). Omgekeerd kunnen verlichten (of positief) interacties optreden tussen genen in dezelfde route of eiwit complex 2 alsdeletie van beide genen alleen is vaak voldoende om de normale functie van de signalisatieweg of complex zodanig dat aanvullende verstoringen niet activiteit te verminderen, waardoor groei verder verstoren. Overall kan systematisch identificeren en analyseren GI netwerken onpartijdige, wereldkaarten van de functionele samenhang tussen grote aantallen genen, waarvan pathway belangrijke informatie gemist andere benaderingen kunnen worden afgeleid 9.
Protocol
1. De bouw van Hfr Cavalli Donor mutante stammen door Recombineering 15, 16
De stappen voor het construeren van de donor eSGA vlekken worden hieronder beschreven. Kortom, we gebruiken gerichte λ - Rood gemedieerde homologe recombinatie 16 van geamplificeerd selecteerbare DNA-merker cassette fragmenten gegenereerd door PCR om niet-essentiële genen deletiemutanten (punt 1.1) of essentieel gen hypomorphic mutante donor stammen (paragraaf 1.2), die vervolgens worden gebruikt als te creëren 'vragen' om GI-netwerken te definiëren.
Opmerking: Tijdens het technologie-ontwikkeling proces, hebben we de effectiviteit van het gebruik Hfr-gemedieerde conjugatie-overdracht voor het combineren van mutaties met behulp van een goed gedefinieerde Hfr donorstam (HFR Cavalli, Hfr Hayes, en Hfr 3000). We onderzochten (i) de mogelijkheid om efficiënt te donor mutanten volgens de recombineering methode ontwikkeld door Yu et al.. (2000) 16, (ii) de relatieve efficiëntievan conjugative DNA overdracht van verschillende chromosomale markers, en (iii) de effecten van query gen positie en oriëntatie ten opzichte van chromosomale Hfr de overdracht locus, oriT. Wij vonden dat λ - Rood-gemedieerde homologe recombinatie efficiëntie veel hoger in Hfr Cavalli dan in Hfr Hayes of Hfr3000. Desgewenst kan P1 transductie of een pseudo Hfr stam 17, worden gebruikt om mutant donors maken. We hebben succesvol aangepast al deze werkwijzen voor het maken en screenen van grote aantallen donors. Aangezien in ons onderzoek conjugatie experimenten de algehele efficiëntie van de overdracht en het aantal ex-conjugants waargenomen was significant groter bij Hfr Cavalli werd deze specifieke stam achtergrond gekozen donor bouw en grootschalige eSGA. Alle procedures voor het eSGA schermen met behulp van Hfr Cavalli donoren worden beschreven.
- Amplificeren van het DNA fragment voor latere recombineering een niet-essentieel gen verwijderen
Gebruik van twee stappen nested PCR ampli15:;: catie (Figuur 1) een gendeletie cassette voor vervanging van de streefwaarde open reading frame met een Cm resistentiemerker de pKD3 plasmide (AAL02033.1 eiwit id 15554330 GI) te maken. De marker wordt geflankeerd door FRT-sites 11 waardoor de verwijdering van het resistentiegen eventueel in vervolg experimenten.
Opmerking: Wij genest tweestaps PCR op het plasmide uit het geamplificeerde product dat vervolgens wordt gebruikt om de bacteriële cellen te transformeren. Verwijderen van de plasmide (in de eerste PCR) en vervolgens een knockout cassette in de tweede PCR is nodig omdat transformatie met een plasmide is veel efficiënter dan recombineering, en het doel is te verkrijgen - zoveel mogelijk - alleen stammen die succesvol vervangen gerichte genomisch DNA met de selecteerbare marker. Een alternatief voor geneste PCR is via een restrictiedigestie van het plasmide buiten het gebied geamplificeerd in de tweede PCRstap. Vervolgens wordt het product van de restrictie digest wordt gezuiverd en gebruikt als een template in de geneste PCR stap (1.1.2). Deze optie is ook simpel, maar vereist meer werk op tijd.- Gebruik ongeveer 45 ng van pKD3 als een matrijs in PCR met voorwaartse F1 en reverse primers R1 een 1070 bp product. Zuiver het PCR fragment met de Qiagen PCR zuivering protocol en verdun het product in steriel gedestilleerd water tot 5 ng / ul concentratie.
- Met gezuiverde PCR product als een matrijs, opzetten van een tweede PCR met genspecifieke (bijv. knockout) geneste primers, F2 en R2, die (i) 45 nt van genspecifieke homologie regio's aan het 5'-einde om voor homologe recombinatie onmiddellijk stroomopwaarts en stroomafwaarts van het doelwitgen te vervangen door de Cm resistentie marker en (ii) 20 nt aan het 3'-uiteinden om de synthese van de marker Cm primen. De grootte van de geproduceerde fragment is 1123 bp. De genspecifieke homologie gebieden zijn bedoeld om het doel op verwijderen leesraam terwijl een aangrenzend of gedeeltelijk overlappende coderende segmenten intact. Na deze versterking, ga dan naar 1.3 stap.
- Amplificeren van een tagging cassette voor het creëren van een essentieel gen hypomorphic mutatie
- Om hypomorphic donor mutante stammen te construeren, voeg een C-terminale peptide sequentiële affiniteit (SPA) fusie-tag, die iets vaak van essentieel belang de functies van eiwitten beïnvloedt door de destabiliserende transcript overvloed (dwz eiwit kopienummer) of het vouwen van eiwitten / activiteit. Daartoe een selecteerbare SPA-tag (SPA-Cm) DNA template door omzetting van de Kan resistentiemerker in pJL148 18 tot Cm met recombineering tussen identieke nucleotidesequenties flankeren de Kan marker in pJL148 en Cm marker in pKD3 15. De resulterende sjabloon bestaat uit in-frame SPA-tag gevolgd door een Cm resistentiemerker, en is geschikt voor PCR amplificatie recombineering en daaropvolgende eSGA 12.
Opmerking: </ Strong> Essential genen zijn potentieel de meest interessante voor gen functie studies. Echter, omdat deze genen kunnen niet worden verwijderd, innovatieve methoden ontwikkeld moesten worden voor het onderzoeken van de functionele relaties van essentiële genen. Verschillende geschikt zeer succesvolle benaderingen zijn in eerste instantie ontwikkeld in gist. Bijvoorbeeld Davierwala et al.. (2005) 19 uitgevoerd GI schermen met behulp van een panel van 575 temperatuurgevoelige essentieel gen mutanten, en vond dat essentiële genen vertoonden ongeveer vijf keer het aantal GI's als niet-essentiële genen. Ook Breslow et al.. (2008) 20 ontwikkelde een 'verminderde overvloed van mRNA verstoring' (vochtig) benadering van een bibliotheek van hypomorphic allelen die ~ 82% van essentiële gistgenen te wegen en complexen te bestuderen genereren. Het vochtige benadering wijzigt het 3'-uiteinde van de mRNA expressie, waarbij het niveau van het doelwitgen 6 waarschijnlijk door destabilisatie mRNA. Net als bij de vochtige aanpak 6, onze uitgebrey is de subtiele effecten van storende het 3 'uiteinde van de mRNA expressie van essentiële eiwitten benutten.
Als we beschrijven, impliceert het label zelf niet waarschijnlijk van invloed eiwitvouwing of functie, maar de subtiele verstoring van de mRNA van de tag volstaat, in combinatie met omgevingsinvloeden of andere mutaties, functioneel informatieve genmilieu 13 en gen openbaren -gen 9, 12 interacties.
Ten eerste, tot nu toe hebben we gebruik gemaakt SPA-tags om ~ 3.000 essentiële en niet-essentiële E. coli eiwitten éénentwintig-drieëntwintig te zuiveren, met meer dan 80% van de 307 E. coli essentiële eiwitten worden binnen onze SPA-gelabelde stammen 8. Omdat de tag werd met succes gebruikt om bekende eiwitcomplexen, die samengebouwd zijn gevalideerd (dwz hetzelfde complex zou kunnen worden geïsoleerd door tagging en het zuiveren van verschillende eiwitten binnen hetzelfde complex) te isoleren, en de geïsoleerde complexen waren biologisch relevante, we reden dat de tags doenmeestal niet van invloed op het vouwen van eiwitten of functie 12. Ook onze niet-gepubliceerde observaties bleek dat de tag op zichzelf meestal niet druk groei beïnvloeden. Maar we redeneerde dat het veranderen van de 3'-UTR door de integratie van de tag en de marker cassette, zoals werd gemeld voor vochtige stammen 6, kunnen bepaalde transcripties destabiliseren op het RNA-niveau of, in zeldzame gevallen, belemmeren de juiste vouwing of functie van het fusieproteïnen. Daarom hebben we voorspeld dat deze allelen combinatie van essentiële genen verstoorde met andere functioneel relevante mutaties elders in het genoom leidt tot informatieve GA, die ook is waargenomen 9, 12. Bovendien SPA-gelabeld allelen van essentiële genen gen-omgeving interacties (bijv. overgevoeligheid voor geneesmiddelen) tentoongesteld volgens de fenotypische profilering werk van Nichols et al.. (2011) 13, die onderworpen een subset van SPA-gelabeld essentieel stammen van verschillende groeiomstandigheden. Dezelfde studie confirmed dat de meeste (54 van de 58 geteste) SPA-tagged essentieel stammen toonden verminderde fitheid in een of meer kweekomstandigheden 13, die de notie dat de SPA-tag vaak mild hypomorphic allelen in essentiële genen die nuttig zijn voor genoom-wijde creëert ondersteunt GI scherm toepassingen, inclusief eSGA. - Versterken de tagging cassette van de SPA-Cm template met genspecifieke primers S1 en S2 met elk (i) een 45 nt genspecifieke regio homoloog recombineering aan het 5'-uiteinde, gevolgd door (ii) een 27 bp SPA- Cm specifieke sequentie bij het 3'-uiteinde.
- Om hypomorphic donor mutante stammen te construeren, voeg een C-terminale peptide sequentiële affiniteit (SPA) fusie-tag, die iets vaak van essentieel belang de functies van eiwitten beïnvloedt door de destabiliserende transcript overvloed (dwz eiwit kopienummer) of het vouwen van eiwitten / activiteit. Daartoe een selecteerbare SPA-tag (SPA-Cm) DNA template door omzetting van de Kan resistentiemerker in pJL148 18 tot Cm met recombineering tussen identieke nucleotidesequenties flankeren de Kan marker in pJL148 en Cm marker in pKD3 15. De resulterende sjabloon bestaat uit in-frame SPA-tag gevolgd door een Cm resistentiemerker, en is geschikt voor PCR amplificatie recombineering en daaropvolgende eSGA 12.
- Bevestigd en zuiveren van het PCR product
- Bevestigen dat de cassette kunnen tagging werd geamplificeerd door het onderwerpen van 2-5 pi van het PCR product aan agarosegelelektroforese en zuiver het resterende DNA volgens standaard van de fabrikant PCR zuivering protocol (Qiagen). Elueer het PCR product in 30 pi steriel gedestilleerd water tot ~ 50 ng / ul concentratie. De zuiveringed product kan direct worden gebruikt in transformatie (stap 1,5) of opgeslagen bij -20 ° C maximaal 6 maanden tot gebruik.
- Voorbereiden Hfr Cavalli competente cellen voor donor bouw
- Enten een ml van de verzadigde overnachtcultuur van een Hfr Cavalli zeef in 70 ml vers Luria-Bertani (LB) medium met 35 pl van 50 ug / ml ampicilline in een 250 ml kolf. Incubeer de kweek bij 32 ° C onder schudden bij 220 rpm tot een optische dichtheid (OD) van 600 nm ~ 0.5-0.6 verkregen (~ 2 uur).
- Breng de cultuur een waterbad warmte inductie van de λ rode rekombinatiestelsel 16 bij 42 ° C gedurende 15 min met schudden bij 160 rpm. Stop de inductie door het overbrengen van de cultuur een gekoelde slurry ijs-waterbad gedurende 10-20 min bij 160 rpm. Zorg ervoor dat de cellen kou vanaf nu tot na transformatie, gebruik buizen en cuvetten die zijn gekoeld op ijs gedurende ten minste 15 minuten voor gebruik.
- Verdeel de cCULTUUR eveneens in 2 voorgekoeld 50 ml polypropyleenbuizen (~ 35 ml kweek per buis) en centrifugeer bij 4400 xg gedurende 6 min bij 4 ° C.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet door voorzichtig omkeren in ~ 50 ml ijskoud steriel gedestilleerd water. Centrifugeer de cellen opnieuw bij 4.400 xg gedurende 6 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer elke cel pellet in 20 ml ijskoude steriele 10% glycerol en centrifugeer zoals hiervoor beschreven.
- Giet het supernatant en de celpellet resuspendeer in 500 ul ijskoude 10% glycerol. Aliquot de bereide competente cellen in 50 pl volumes in individuele, voorgekoeld 1,5 ml micro-centrifugebuisjes voor onmiddellijke transformatie. De cellen kunnen worden ingevroren op droog ijs of in vloeibare stikstof en bewaard bij -80 ° C maximaal 3 maanden. Echter de transformatie-efficiëntie het hoogst met vers bereide competente cellen.
- Transformatie
- Voeg 100 ng gezuiverd PCR product vanstap 1.3.1 aan de bevoegde cellen. Flick de buis en laat suspensie op ijs zitten 5 min.
- Breng de ijskoude competente cellen en DNA aan een voorgekoeld elektroporatie cuvet. Electroporate cel mengsel met de 2,5 kV, 25 uF, 200 Ohm instelling in een 2 mm gat-kuvet (dwz als u een andere cuvet, raadpleegt u de instructies van de fabrikant voor elektroporatie instellingen), en voeg onmiddellijk 1 ml op kamertemperatuur SOC medium. Breng de geëlektroporeerde cellen in SOC medium in een 15 ml kweekbuis en incubeer bij 32 ° C gedurende 1 uur met orbitaal schudden bij 220 rpm.
- Na incubatie gecentrifugeerd bij 4.400 cellen xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder ongeveer 850 ul van het supernatant, en de celpellet resuspendeer in de overblijvende vloeistof.
- De cellen uitgespreid op voorverwarmde LB platen met 17 ug / ml Cm en incubeer bij 32 ° C geroerd. Kies twee individuele transformant kolonies en streeploos op LBCm-platen voor mutant bevestiging. We raden vermijden grootste transformant kolonies teneinde de mogelijkheid van het kiezen van stammen met zeldzame suppressor mutaties verminderen. Ook streak dezelfde transformanten op LB-Kan te bevestigen dat de stammen niet Kan resistent.
Opmerking: Aangezien de Cm weerstand marker wordt gebruikt om de donor stammen te maken, verwachten we niet dat de donor mutanten te zijn Kan resistent. Door strepen de transformanten op beide LB-Kan en LB-Cm-platen, zorgen we ervoor dat de donor mutatie zelf niet een of andere manier Kan weerstand veroorzaken. Als deze stap niet uitgevoerd en de beoogde mutaties zou het vermogen van de stam om te overleven Kan beïnvloeden, zou dubbele mutanten niet effectief gebruik gemaakt eSGA aangezien donor stammen zou overleven alle selectiestappen. Dit is slechts een voorzorgsmaatregel logische stap om onverwachte fenotypes of andere problemen die kunnen interfereren met de voltooiing van de eSGA schermen te vangen. Als deze stap overgeslagen, regelaars woulD nog te identificeren mislukte schermen. Echter, een vroegere detectie van een donor die resistent is tegen Kan elimineren reeks onproductief en onnodige stappen. Andere mogelijke oorzaken van een stam te groeien op Kan zou bijvoorbeeld verstreken antibioticum en het gebruik van een verkeerde PCR product of een stam voor de transformatie. Al deze problemen kunnen worden geïdentificeerd en behandeld vroeg in de procedure met behulp van deze controle, die niet verplicht is, maar aanbevolen voor eSGA.
- Bevestiging van de niet-essentiële gendeletie (stap 1.6.1) of essentieel gen hypomorphic mutatie (paragraaf 1.6.2)
Opmerking: Bij de bevestiging van de gendeletie door PCR, genomisch DNA van een wild type stam worden gebruikt als controle.- Bevestiging niet-essentiële gendeletie
- Om gendeletie bevestigen PCR, isoleer het genomische DNA van de getransformeerde, vermeende knockout stammen gekweekt in vloeibaar LB-medium Cm na de Manufacturer instructies (Promega).
- Om succesvol recombineering bevestigen amplificeren het DNA van elke transformant drie verschillende sets primers knockout bevestiging. Voer de reacties met ongeveer 150 ng genomisch DNA template en bevestig het juiste fragment afmetingen door het uitvoeren van de PCR-producten gesynthetiseerd op een agarosegel.
- De eerste primer bestaat uit een 20-nt flankerende primer, 200 bp stroomopwaarts van het doelgebied (Koco-F) en Cm-R primer die complementair is aan de sequentie Cm cassette. Deze versterking wordt verwacht dat een 445 nt amplicon in de mutant te produceren, maar niet in de wild type stam (figuur 1).
- De tweede set bestaat uit een voorwaartse primer (Cm-F), annealing de cassette Cm sequentie en een 20-nt reverse primer flankerende bevestiging (Koco-R), die is ontworpen om 200 bp stroomafwaarts van het 3'-uiteinde van het gloeien verwijderde gen. Deze amplificatiereactie wordt verwacht dat 309 nt amplicon in de mutant te produceren, maart in de wild type stam (figuur 1).
- De derde PCR bevat Koco-F en Koco-R primers. Deze reactie is nodig om te bevestigen dat de gekozen stam niet een merodiploïde, met een genlocus is vervangen door de cassette en een dubbele maar anders wild-type genkopie nog aanwezig. Deze amplificatie van een correcte deletie mutant verwachting een 1,4 kb product (figuur 1) te produceren.
Opmerking: Als het doelwitgen heeft ongeveer dezelfde lengte in baseparen als gendeletie cassette, zal niet een verschil tussen een locus die is vervangen door de cassette en een locus die niet heeft. Een definitieve bevestiging in dergelijke gevallen raden wij aanvullende primers een DNA segment specifiek amplificeren binnen het verwijderde gen. In dit geval, als het gen is verwijderd, wordt een amplificatieproduct worden alleen waargenomen in de wild type controle stam en niet in de mutant. Deze primerskan handmatig of rekenkundig ontworpen om een segment van DNA specifiek amplificeren binnen het verwijderde gebied. We meestal amplificeren 140 bp regio.
- Bevestiging van essentieel gen hypomorphic mutatie
- De hypomorphic mutatie door PCR bevestigen, gebruikt genspecifieke 20-nt forward (Koco-F) en reverse primers (Koco-R) 200 bp stroomopwaarts en stroomafwaarts gelegen, respectievelijk de SPA-tag insertieplaats (figuur 2).
Opmerking: Dit amplificatiestap wordt gebruikt als controle van de afwezigheid van een niet-gecodeerd kopie van het beoogde essentiële gen waarborgen. Wanneer slechts een gemerkte versie aanwezig is, wordt een band 310 bp groter dan de SPA-Cm amplicon waargenomen. Een 400 bp product zou het signaal de aanwezigheid van de gecodeerde versie van het gen. - Parallel aan de PCR bevestiging met Western blotting om de in-frame inbrengen van de SPA-tag te verifiëren met behulp van een anti-FLAG M2 antilichaam specifiek voor de FLAG-epitopen van de SPA-label 21.
- De hypomorphic mutatie door PCR bevestigen, gebruikt genspecifieke 20-nt forward (Koco-F) en reverse primers (Koco-R) 200 bp stroomopwaarts en stroomafwaarts gelegen, respectievelijk de SPA-tag insertieplaats (figuur 2).
- Bevestiging niet-essentiële gendeletie
- Het opslaan van de bevestigde donorstam
- Breng de nacht cultuur van de bevestigde recombinante donor mutante stam aan de gelabelde cryovials, aan te vullen met glycerol tot 15% eindconcentratie, en meng goed. Voor langdurige opslag, houdt de cryovials bij -80 ° C.
2. Arraying E. coli F-ontvanger Mutanten voor eSGA Schermen
- Replica-pin de E. coli Keio enkele niet-essentiële gen deletie mutant collectie gegenereerd door Mori et al.. (3968 stammen 11, F-BW25113, verkrijgbaar bij Open Biosystems) robot tot vierentwintig 384-wells microtiterplaten die 80 ul vloeibare LB media per well , aangevuld met 50 ug / ml Kan
Opmerking: Voor systematisch beoordelen van GI's met essentiële genen, kan de ontvanger Keio collectie 11 worden aangevuld met de F-Kan-gemarkeerd essentieel gen hypomorphic mutantstammen met C-terminale SPA-tags 22, 23. - Om ruimte voor de grenscontrole stam, die zal fungeren als een positieve controle te maken, hulp in binnen en tussen plaat normalisaties als in geautomatiseerde kolonie quantizations, verwijdert u het geënte medium uit de ultraperifere putjes van elke plaat uit de bovenstaande stap en transfer naar nieuwe platen, wederom verlaten van de buitenste putten leeg.
Opmerking: De grenscontrole stam JW5028 van de Keio collectie 11 wordt geschrapt voor een klein pseudo-gen dat niet mag, en is niet in ons hele genoom schermen, GI's vertonen met alle donoren. Daarom is dit een goede positieve controlestam om zeldzame vast te stellen wanneer conjugatie, pinning, of selecties hebben gefaald, wat resulteert in geen of sporadisch grens stam groei. Bijvoorbeeld, als de grenscontrole kolonies groeien niet na een dubbele mutant selectie, de query stam niet in staat conjugatie kan conjugatie zijn geprobeerd invt voorwaarde dat zij verhinderd plaats (bijv. op een antibioticum bevattende plaat), of een verkeerde antibiotica zijn toegevoegd aan de selectie plaat. Ook wanneer zeer weinig sporadische kolonies waargenomen op de gehele plaat, inclusief de rand, kan conjugatie of pinnen hebben gefaald en het scherm moet worden herhaald. Als dit sporadisch grens groei is reproduceerbaar, kan dit duiden op aanhoudend slechte donor conjugatie en dus gevallen waarin dubbele mutanten niet in acht worden genomen zijn mogelijk als gevolg van conjugatie mislukking, niet waar GI's. Dergelijke schermen moeten worden verwijderd uit verdere analyse. Bovendien door aanwezig op alle platen, het controlegebied stam kan de kolonie kwantisering software automatisch bepalen kolonie posities op de dubbele mutant platen en dus kolonie posities niet moeten handmatig worden afgebakend. Ten slotte is de grenscontrole stam helpt bij de normalisering van de kolonie grootte in (bijv. verschillende rijen in een bord) en tussun (bijv. verschillende ontvangende platen vastgemaakt met dezelfde donor op verschillende tijdstippen) platen. - Ook maakt negatieve controle plekken door het verwijderen van alle twee stammen uit een andere locatie binnen elke plaat (niet grens) en breng de stammen aan een nieuwe plaat. Vul de lege putjes met LB medium dat 17 ug / ml Cm. Deze negatieve controle plekken zullen naar verwachting leeg te zijn in de ontvanger en dus dubbele mutant platen en ervoor te zorgen dat er geen verwerking of plaat handling fouten bij het nummeren, beeldvorming, of pinning de platen te helpen.
Opmerking: Deze lege plekken nodig zijn negatieve controles. Negatieve controles helpen bij het identificeren gevallen wanneer de selectie niet - als negatieve controle stammen groeien tijdens de selectie. We stellen voor om niet alleen uniek negatieve controle spots kiest voor elk van de ontvanger platen, maar ook kiezen negatieve controle spots binnen dezelfde kwadrant van de plaat (bijvoorbeeld rechtsonder). Zo het patroonvan negatieve controle plekken zou identificeren van mogelijke plaat verkeerd fouten (bijv. platen worden verkeerd benoemd of wordt ondersteboven vastgepind, waar de linkerbovenhoek kolonie is vastgezet in de rechter positie). - Beënten Keio stam JW5028 11, met een pseudogen deletie, in een 500 ml kolf met 200 ml LB, dat 50 ug / ml Kan basis van onze hele genoom eSGA schermen, de groei van deze specifieke mutant ligt het dichtst bij wild soort BW25113 en wordt dus gebruikt als een grenscontrole.
- De array groeien stammen en de JW5028 kweek overnacht bij 32 ° C met 190 rpm orbitaal schudden tot een OD van ~ 0,4 tot 0,6 bij 600 nm. Na de groei gedurende de nacht, vul de rand putten met ongeveer 80 ul van JW5028 kweek van een nacht.
- De geassembleerde platen kunnen worden gebruikt in stap 3.2. Als alternatief voor langdurige opslag, vullen elk putje in de ontvangende platen met 15% glycerol, meng de media en glycerol, en houden de platenbij -80 ° C.
3. High-density Strain Mating Procedure voor het genereren van E. coli dubbele mutanten
- Hfr groeien de donor stam, waarbij de query mutatie, aangeduid met Cm overnacht bij 32 ° C in LB-rijke Cm vloeibaar medium (17 ug / ml Cm) onder schudden bij 220 rpm.
- Pin bestelde ontvanger mutant collectie 384 kolonie dichtheid op vaste LB-platen aangevuld met 50 ug / ml van Kansas Daarnaast speld de donor zoekopdracht mutante stam in 384 kolonie dichtheid op hetzelfde aantal LB platen, aangevuld met 17 ug / ml Cm. 'S nachts Incubeer de platen bij 32 ° C.
Opmerking: De ontvanger platen voor pinning kunnen tot 36 uur voor het verkrijgen van voldoende grote kolonies voor volgende trappen. Wanneer de gemiddelde grens kolonie grootte is ongeveer 2 mm in diameter (of hoger), de platen zijn klaar om te worden vastgemaakt. - Om de stammen vervoegen, speld de donor uit een 384-kolonie 's nachts donor plaat opom vaste LB plaat. Vervolgens pin een enkele 384-kolonie ontvanger plaat over de vers-gespeld donor over de vervoeging plaat. Ga door pinning totdat alle donor-ontvanger platen zijn geconjugeerd door pinning op vaste LB conjugatie platen. Incubeer de platen vastgemaakt conjugatie bij 32 ° C gedurende 16 tot 24 uur.
Opmerking: Individuele enkele mutant donor stammen kunnen gen-om-gen variabiliteit in paring efficiëntie als gevolg van de potentiële effecten van de mutaties op conjugatie, DNA-transfer efficiëntie, of fitness tonen. Groei kan worden gestopt op elk gewenst moment tussen de 16 en 24 uur, bij voldoende grote kolonies zijn verkregen voor de volgende pinning stappen. Vervoegingen duurt 16 tot 24 uur te produceren voldoende aantallen ex-conjugants voor reproduceerbare eSGA resultaten, zelfs voor de mutanten van late overdracht van genen of mutanten met iets lagere fitness. - Pin elk 384-dichtheid conjugatie plaat op een solide LB plaat, met daarin Cm (17 ug / ml) en Kan (50ug / ml) totdat alle conjugation platen zijn vastgemaakt. Incubeer de vers vastgemaakt eerste selectie platen 16-36 uur bij 32 ° C.
Opmerking: Met betrekking tot de selectie stappen verschillende hoeveelheden tijd nodig zijn voor verschillende donor schermen. Aangezien alle dubbele mutanten in een bepaald scherm dezelfde donor mutatie gemiddeld een langzamer groeiende donor mutant leidt tot langzamer groeiende dubbele mutanten. Dus, afhankelijk van de donor fitness kan selectiestappen vereist tussen 16 en 36 uur. De dubbele mutant groei worden gestopt wanneer de dubbele mutanten voldoende groot voor de volgende stap ofwel pinning na de eerste selectie of beeldvorming na de tweede. Dit vertaalt meestal controle kolonies gemiddeld grens met ten minste 2 mm diameter. - Elke eerste selectieplaat opnieuw pin naar een tweede dubbele geneesmiddel (Cm en Kan), selectieplaat in 1536-kolonie format, zodat elke kolonie eerste selectie wordt door vier koloniesde tweede selectie plaat. Incubeer de platen gedurende 16-36 uur bij 32 ° C. Fotograferen uiteindelijke dubbele mutant selectieplaten kwantitatief te meten de groei geschiktheid van de mutant en de interacties tussen genenparen (figuur 3) analyseren.
Opmerking: Hoewel de frequentie van merodiploidy (gedeeltelijke chromosomale duplicaties) is laag bij ongeveer 1/1, 000 cellen 24, merodiploidy kunnen maskeren GI. Daarom raden wij u met inbegrip van biologische repliceert in alle eSGA schermen. Gelukkig kan commerciële wegwerpborden en plastic pinnen pads worden hergebruikt tot driemaal steriliseren van het materiaal als volgt: Agar van de platen wordt verwijderd en de platen en pads worden gesteriliseerd door weken in 10% bleekmiddel nacht, gevolgd door een spoelen met gedistilleerd water, wassen in 70% ethanol en aan de lucht drogen plasticware in een stroomkap onder ultraviolet licht. De steriele pads en platen worden opgeslagen in afgesloten steriele plastic zakken tot gebruik.
4. Het verwerken van gegevens en het afleiden van GI Scores
- Meet de kolonies op elke plaat in batch-modus of individueel met behulp van een gespecialiseerde kolonie imaging software 3, 9.
Opmerking: Een geschikte Java-gebaseerde high-throughput kolonie beeldvorming en scoren applicatie is nu gratis beschikbaar voor toegang van het publiek ( http://srcollins77.users.sourceforge.net/ ). De software werkt op verschillende platformen (bv. Mac of pc) en kan worden gelanceerd, hetzij als een uitvoerbaar bestand of vanaf een terminal venster. - Normaliseren van de ruwe koloniegrootte metingen door te corrigeren voor systematische fouten binnen en tussen platen zoals plaat randeffecten, inter-plaat variatie effecten, oneffen beeld verlichting, artefacten als gevolg van fysieke kromming van de agar oppervlak, concurrentie-effecten voor naburige koloniën en eventuele pinning gebreken , en verschillen in groeitijd
- De kolonies in rand rijen en kolommen doorgaans groter door lagere concurrentie om voedingsstoffen dan in het midden van de plaat. Dus om te corrigeren voor dit effect, de schaal van de afmetingen van de rand kolonies moet zodanig zijn dat de mediane omvang in die rij of kolom gelijk is aan de gemiddelde grootte van de kolonie in het midden van de plaat.
- Statistisch analyseren van de resultaten rekening te houden met de reproduceerbaarheid en de standaard afwijking van de gemiddelde grootte van de kolonie herhaalde metingen. Ten minste drie onafhankelijke biologische herhaalde experimenten noodzakelijk zijn om de experimentele reproduceerbaarheid evalueren.
- Tenslotte de genormaliseerde gemiddelde koloniegroei fitness omvang de GI score (S) voor elk gen paar met de volgende formule genereren:
n 1 "src =" / files/ftp_upload/4056/4056eq1.jpg "/>
Wanneer var S = (var Exp x (n Exp -1) + Cont var x (n Cont -1)) / (n + n Exp Cont -2); var Exp = de maximale variantie van de genormaliseerde afmetingen van de kolonie dubbele mutant; var Cont = mediaan van de verschillen in de genormaliseerde dubbele mutant kolonie maten van de referentie-set; n Belichtingstijd = aantal metingen van dubbele mutant kolonie maten; n Cont = de mediaan aantal experimentele repliceert over alle experimenten; μ Belichtingstijd = gemiddelde genormaliseerde kolonie grootte van de dubbele mutanten, en μ Cont = mediaan van genormaliseerde kolonie maten en voor alle dubbele mutanten die voortvloeien uit de donor mutante stam. De S-score weerspiegelt zowel de statistische betrouwbaarheid van een vermoedelijke digenic interactie en de biologische sterkte van de interactie. Sterke positieve S-scores geven aan het verlichten van effecten, suggesting dat de interactie genen deel te nemen aan dezelfde route 9, terwijl er aanzienlijke negatieve S-scores weerspiegelen synthetische ziekte of sterfte, die vaak doet denken aan het lidmaatschap van parallelle redundante paden 9. Voor het bepalen van de route goede functionele relaties is een S-score voor elk paar geteste genen uit de uiteindelijke dataset.
Opmerking: In onze vorige studie 9, vonden we dat recombinatie meestal minder vaak tussen genen binnen 30 kbp van elkaar. Derhalve voor downstream analyse na normalisatie en score generatie verwijderen we interacties tussen genen binnen 30 kbp van elkaar. Naast GI zelf kunnen functionele relaties tussen paren genen worden onderzocht door te kijken naar hoe sterk de GI profielen van de twee genen. De GI profiel van een gen is de verzameling van alle interacties van dat gen met andere genen in het genoom buitenhet gen koppeling gebied. Functioneel vergelijkbare genen vaak hogere correlaties van genetische interactie profielen 12, 25 hebben. Dus bij de berekening correlatiecoëfficiënten voor alle genen in de experimentele dataset kan gebruiken voor het onderzoeken eSGA functionele relaties tussen genen zelfs liggen dicht bij elkaar op het chromosoom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We hebben geschetst een stapsgewijze protocol voor het gebruik van robotica eSGA screening voor bacteriële gen functies te onderzoeken op een pad niveau door ondervragen GI. Deze benadering kan worden gebruikt om individuele genen alsmede gehele biologische systemen te bestuderen in E. coli. Voorzichtig uitvoeren van de experimentele hierboven beschreven stappen, inclusief alle passende controles en grondig analyseren en onafhankelijk valideren van de gegevens GI belangrijke aspecten voor het succes van eSGA het maken van nieuwe functionele ontdekkingen. Naast eSGA een conceptueel vergelijkbaar methode voor het bestuderen GI in E. coli, genoemd GIANT-coli 17 kan worden gebruikt om nieuwe functionele relaties die vaak gemist door andere benaderingen, zoals proteoomanalyse 23 of fenotypische 13 schermen alleen verlichten. Niettemin, zoals met elk genoom-brede benadering heeft beperkingen bestaan op de toepasbaarheid van eSGA of GIANT-coli, bijvoorbeeld om andere bacteriële species. Dit is deelsde oorzaak van het niet beschikbaar zijn van genoom-brede enkel gen deletie mutant stam collecties voor de meeste soorten bacteriën, in het bijzonder voor soorten waarvoor gerichte mutagenese wordt belemmerd door een lage natuurlijke frequentie van homologe recombinatie. In dergelijke gevallen kan gendisrupties methoden zoals willekeurige mutagenese trackable gebaseerde assays zoals TnSeq 31 eventueel worden gebruikt voor het onderzoeken van bacteriële genfuncties. Voor een overzicht van opkomende alternatieve bacteriële genetische screening procedures, zie overzichtsartikel door Gagarinova en Emili (2012) 32.
Hoewel GI methoden onthullen vaak veel interessante verbindingen die wijzen op nieuwe mechanistische links, de integratie van deze gegevens met andere informatie, zoals fenotypische profilering 13, fysieke interactie netwerken 22, 23, en GC-afgeleid verenigingen kan bijzonder informatief. Bijvoorbeeld zoals met GA netwerken, GC associaties, die gebaseerd zijn op de instandhoudingvan gen bestelling (operons), bacteriële genfusies, operon recombinatie frequenties afgeleid van intergenische afstanden van voorspelde operons over genomen, kan zowel als fylogenetische profilering 33 meer inzicht te verschaffen in hoe een bacteriële cel organiseert eiwitcomplexen in functionele paden om te bemiddelen en grote coördineren cellulaire processen 12, 23.
E. coli is een werkpaard model voor het begrijpen van de moleculaire biologie van andere Gram-negatieve bacteriën. Hiertoe kan de eSGA GI data worden gebruikt in combinatie met vergelijkende genomics informatie (bijv. fylogenetische profilering, genexpressieprofielen) aan de evolutionaire behoud van functionele relaties ontdekt eSGA in andere soorten en proteobacterial Prokaryote taxa onderzoeken. Bovendien is de interactie data gegenereerd voor E. coli kan worden gebruikt om inzicht te krijgen in de weg architectuur van microben ontdekt metagenomicrofoons, waarvoor functionele annotaties ontbreken. Aangezien vele genen sterk geconserveerd in alle microben 23 en omdat antibiotica gevoeligheid kan worden verhoogd door bepaalde genetische storingen 34 mogen de functionele verbanden verlicht door eSGA zelfs mogelijk worden benut voor het ontwerpen vernieuwende combinatie geneesmiddeltherapieën.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de middelen van Genome Canada, de Ontario Genomics Institute, en de Canadese Institutes of Health Research subsidies aan JG en AE AG is een ontvanger van Vanier Canada Graduate Scholarship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| I. Antibiotics | |||
| Chloramphenicol | Bioshop | #CLR201 | |
| Kanamycin | #KAN201 | ||
| Ampicillin | # AMP201 | ||
| 2. Luria-Bertani medium | |||
| LB powder | Bioshop | #LBL405 | |
| Agar | Bioshop | #AGR003 | |
| 3. Bacterial Strains and Plasmids | |||
| Hfr Cavalli strain λred system (JL238) | Babu et al.14. | ||
| pKD3 | E. coli Genetic Stock Centre, Yale | ||
| Keio E. coli F- recipient collection | National BioResource Project (NBRP) of Japan11 | ||
| Hypomorphic E. coli F- SPA-tag strains | Open biosystems; Babu et al.14 | ||
| 4. Primers | |||
| pKD3-based desalted constant primers | F1: 5'-GGCTGACATGGGAATTAGC-3' R1: 5'-AGATTGCAGCATTACACGTCTT-3' |
||
| Desalted custom primers | Cm-R: 5'-TTATACGCAAGGCGACAAGG-3' Cm-F: 5'- GATCTTCCGTCACAGGTAGG-3' |
||
| Desalted custom primers | F2 and R2: 20 nt constant regions based on pKD3 sequence and 45 nt custom homology regions F2 constant region: 5'-CATATGAATATCCTCCTTA-3' R2 constant region: 5'-TGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3'S1 and S2: 27 nt constant regions for priming the amplification of the SPA-Cm cassette and 45 nt custom homology regions S1 constant region: 5'AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3' S2 constant region: 5'- GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT -3' KOCO-F and KOCO-C: 20 nt primers 200 bp away from the non-essential gene deletion site or the essential gene SPA-tag insertion site |
||
| 5. PCR and Electrophoresis Reagents | |||
| Taq DNA polymerase | Fermentas | # EP0281 | |
| 10X PCR buffer | Fermentas | # EP0281 | |
| 10 mM dNTPs | Fermentas | # EP0281 | |
| 25 mM MgCl2 | Fermentas | # EP0281 | |
| Agarose | Bioshop | # AGA002 | |
| Loading dye | NEB | #B7021S | |
| Ethidium bromide | Bioshop | # ETB444 | |
| 10X TBE buffer | Bioshop | # ETB444.10 | |
| Tris Base | Bioshop | # TRS001 | |
| Boric acid | Sigma | # T1503-1KG | |
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | Sigma | # B6768-500G | |
| DNA ladder | NEB | #N3232L | |
| 6. DNA isolation and Clean-up Kits | |||
| Genomic DNA isolation and purification kit | Promega | #A1120 | |
| Plasmid Midi kit | Qiagen | # 12143 | |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | #28104 | |
| 7. Equipment for PCR, Transformation and Replica-pinning | |||
| Thermal cycler | BioRad, iCycler | ||
| Agarose gel electrophoresis | BioRad | ||
| Electroporator | Bio-Rad GenePulser II | ||
| 0.2 cm electroporation cuvette | Bio-Rad | ||
| 42 °C water bath shaker | Innova 3100 | ||
| Beckman Coulter TJ-25 centrifuge | Beckman Coulter | ||
| 32 °C shaker | New Brunswick Scientific, USA | ||
| 32 °C plate incubator | Fisher Scientific | ||
| RoToR-HDA benchtop robot | Singer Instruments | ||
| 96, 384 and 1,536 pin density pads | Singer Instruments | ||
| 96 or 384 long pins | Singer Instruments | ||
| 8. Imaging Equipments | |||
| Camera stand | Kaiser | ||
| Digital camera, 10 megapixel | Any Vendor | ||
| Light boxes, Testrite 16" x 24" units | Testrite | ||
| 9. Pads or Plates Recycling | |||
| 10% bleach | Any Vendor | ||
| 70% ethanol | Any Vendor | ||
| Sterile distilled water | Any Vendor | ||
| Flow hood | Any Vendor | ||
| Ultraviolet lamp | Any Vendor | ||
| 10. Labware | |||
| 50 ml polypropylene tubes | Any Vendor | ||
| 1.5 ml micro-centrifuge tubes | Any Vendor | ||
| 250 ml conical flaks | VWR | # 29140-045 | |
| 15 ml sterile culture tubes | Thermo Scientific | # 366052 | |
| Cryogenic vials | VWR | # 479-3221 | |
| Rectangular Plates | Singer Instruments | ||
| 96-well and 384-well microtitre plates | Singer Instruments | Nunc | |
| Plate roller for sealing multi-well | Sigma | #R1275 | |
| plates | ABgene | # AB-0580 | |
| Adhesive plate seals | Fisher Scientific | # 13-990-14 | |
| -80 °C freezer | Any Vendor | ||
References
- Bandyopadhyay, S., Kelley, R., Krogan, N. J., Ideker, T. Functional maps of protein complexes from quantitative genetic interaction data. PLoS Comput. Biol. 4, e1000065 (2008).
- Costanzo, M., Baryshnikova, A., Myers, C. L., Andrews, B., Boone, C. Charting the genetic interaction map of a cell. Curr. Opin. Biotechnol. 22, 66-74 (2011).
- Costanzo, M., et al. The genetic landscape of a cell. Science. 327, 425-4231 (2010).
- Fiedler, D., et al. Functional organization of the S. cerevisiae phosphorylation network. Cell. 136, 952-963 (2009).
- Roguev, A., et al. Conservation and rewiring of functional modules revealed by an epistasis map in fission yeast. Science. 322, 405-4010 (2008).
- Schuldiner, M., et al. Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile. Cell. 123, 507-519 (2005).
- Wilmes, G. M., et al. A genetic interaction map of RNA-processing factors reveals links between Sem1/Dss1-containing complexes and mRNA export and splicing. Mol. Cell. 32, 735-746 (2008).
- Babu, M., et al. Systems-level approaches for identifying and analyzing genetic interaction networks in Escherichia coli and extensions to other prokaryotes. Mol. Biosyst. 12, 1439-1455 (2009).
- Butland, G., et al. coli synthetic genetic array analysis. Nat. Methods. 5, 789-7895 (2008).
- Typas, A., et al. Regulation of peptidoglycan synthesis by outer-membrane proteins. Cell. 143, 1097-10109 (2010).
- Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol. Syst. Biol. 2, 2006-200008 (2006).
- Babu, M., et al. Genetic interaction maps in Escherichia coli reveal functional crosstalk among cell envelope biogenesis pathways. PLoS Genet. 7, e1002377 (2011).
- Nichols, R. J., et al. Phenotypic landscape of a bacterial cell. Cell. 144, 143-156 (2011).
- Babu, M., Gagarinova, A., Greenblatt, J., Emili, A. Array-based synthetic genetic screens to map bacterial pathways and functional networks in Escherichia coli. Methods Mol Biol. 765, 125-153 (2011).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-665 (2000).
- Yu, D., et al. An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 5978-5983 (2000).
- Typas, A., et al. quantitative analyses of genetic interactions in. E. coli. Nat. Methods. 5, 781-787 (2008).
- Zeghouf, M., et al. Sequential Peptide Affinity (SPA) system for the identification of mammalian and bacterial protein complexes. J. Proteome Res. 3, 463-468 (2004).
- Davierwala, A. P., et al. , 1147-1152 (2005).
- Breslow, D. K., et al. A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome. Nat. Methods. 5, 711-718 (2008).
- Babu, M., et al. Sequential peptide affinity purification system for the systematic isolation and identification of protein complexes from Escherichia coli. Methods Mol. Biol. 564, 373-400 (2009).
- Butland, G., et al. Interaction network containing conserved and essential protein complexes in Escherichia coli. Nature. 433, 531-537 (2005).
- Hu, P., Janga, S. C., Babu, M., Diaz-Mejia, J. J., Butland, G., et al. Global functional atlas of Escherichia coli encompassing previously uncharacterized proteins. PLoS Biol. 7, (2009).
- Anderson, R. P., Roth, J. R. Tandem genetic duplications in phage and bacteria. Annu. Rev. Microbiol. 31, 473-505 (1977).
- Boone, C., Bussey, H., Andrews, B. J. Exploring genetic interactions and networks with yeast. Nat. Rev. Genet. 8, 437-449 (2007).
- Collins, S. R., et al. Functional dissection of protein complexes involved in yeast chromosome biology using a genetic interaction map. Nature. 446, 806-8010 (2007).
- Le Meur, N., Gentleman, R. Modeling synthetic lethality. Genome Biol. 9, R135 (2008).
- Tong, A. H., et al. Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants. Science. 294, 2364-2368 (2001).
- Tong, A. H., et al. Global mapping of the yeast genetic interaction network. Science. 303, 808-813 (2004).
- Wong, S. L., et al. Combining biological networks to predict genetic interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 15682-15687 (2004).
- van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nat. Methods. 6, 767-772 (2009).
- Gagarinova, A., Emili, A. Genome-scale genetic manipulation methods for exploring bacterial molecular biology. Mol. Biosyst. 8, 1626-1638 (2012).
- Dewey, C. N., et al. Positional orthology: putting genomic evolutionary relationships into context. Brief Bioinform. 12, 401-412 (2011).
- St Onge, R. P., et al. Systematic pathway analysis using high-resolution fitness profiling of combinatorial gene deletions. Nat. Genet. 39, 199-206 (2007).
