Summary
Systematiske, store syntetiske genetiske (gen-gen eller epistasis) interaksjon skjermer kan brukes til å utforske genetisk redundans og sti krysstale. Her beskriver vi en high-throughput kvantitative syntetisk genetisk rekke screening teknologien, kalt eSGA som vi utviklet for å belyse epistatic relasjoner og utforske genetiske interaksjon nettverk i
Abstract
Fenotyper bestemmes av en kompleks serie av fysiske (f.eks protein-protein) og funksjonell (f.eks gen-gen eller genetisk) interaksjoner (GI) en. Mens fysiske interaksjoner kan indikere hvilke bakterielle proteiner er assosiert som komplekser, har de ikke nødvendigvis avsløre sti-nivå funksjonelle relationships1. GI skjermer, der veksten av doble mutanter bærer to slettede eller inaktiverte gener måles og sammenlignet med de tilsvarende enkle mutanter, kan belyse epistatic avhengigheter mellom loci og dermed gi et middel for å søke og oppdage nye funksjonelle relasjoner 2. Storskala GI kartene har blitt rapportert for eukaryote organismer som gjær 3-7, men GI informasjon forblir sparsom for 8 prokaryoter, som hindrer funksjonell annotering av bakterielle genomer. Til dette formål har vi og andre utviklet høy gjennomstrømming kvantitative bakterielle GI rastreringsmetoder 9, 10
Her presenterer vi de viktigste trinnene som kreves for å utføre kvantitativ E. coli Syntetisk Genetisk Array (eSGA) screening prosedyren på en genom-skala 9, ved hjelp av naturlig bakteriell konjugering og homolog rekombinasjon til systemisk generere og måle egnethet av et stort antall doble mutanter i en koloni matrise format. korthet blir en robot som brukes til å overføre , gjennom konjugering, kloramfenikol (cm) - merket mutant alleler fra konstruerte Hfr (Høy frekvens av rekombinasjon) 'donor stammer' i en ordnet rekke av kanamycin (Kan) - merkede F-mottaker stammer. Vanligvis bruker vi tap av funksjon enkelt mutanter bærer ikke-essensielle genet slettinger (f.eks 'Keio' samling 11) og essensielle genet hypomorphic mutasjoner (dvs. alleler overdragelse redusert protein uttrykk, stabilitet eller aktivitet 9, 12, 13) til spørre de funksjonelle assosiasjoner til ikke-essensielle og viktige gener, respectively. Etter konjugering og påfølgende genetisk utveksling mediert ved homolog rekombinasjon, blir de resulterende doble mutanter valgt på fast medium som inneholder både antibiotika. Etter utvekst, platene digitalt fotografert og koloni størrelser er kvantitativt scoret ved hjelp av en in-house automatisert bildebehandlingssystem 14. Soldater blir avslørt da veksten av en dobbel mutant er enten vesentlig bedre eller verre enn forventet 9. Skjerpende (eller negative) soldater ofte resultere mellom tap av funksjon mutasjoner i par av gener fra kompenserende veier som har betydning for den samme viktig prosess 2. Her, er tapet av et enkelt gen bufret, slik at enten enkelt mutant er levedyktig. Imidlertid er tap av begge trasé deleterious og resulterer i syntetisk letalitet eller sykdom (dvs. langsom vekst). Omvendt kan lindre (eller positiv) interaksjoner forekomme mellom gener i den samme sti eller protein kompleks 2 somsletting av enten genet alene er ofte tilstrekkelig til å forurolige normal funksjon av veien eller komplekse, slik at ytterligere perturbasjoner ikke reduserer aktiviteten og dermed vekst, ytterligere. Samlet, kan systematisk å identifisere og analysere GI nettverk gir deg objektive, globale kart over de funksjonelle relasjoner mellom et stort antall gener, som sti-nivå informasjon savnet av andre tilnærminger kan utledes 9.
Protocol
1. Konstruere HFR Cavalli Donor mutantstammer av Recombineering 15, 16
Trinnene for å konstruere eSGA donor flekker er beskrevet nedenfor. Kort, bruker vi målrettet λ - Red formidlet homolog rekombinasjon 16 av forsterket valgbar DNA markør kassett fragmenter generert av PCR for å skape ikke-essensielle genet sletting mutanter (§ 1.1) eller essensielle genet hypomorphic mutant donor stammer (§ 1.2) som deretter brukes som 'spørringer for å definere GI nettverk.
Merk: Under teknologiutvikling prosessen, har vi vurdert effekten av å bruke Hfr-mediert konjugerbare overføring for å kombinere mutasjoner ved hjelp av en veldefinert Hfr donor belastning (Hfr Cavalli, Hfr Hayes, og Hfr 3000). Vi undersøkte (i) evnen til effektivt gjøre donor mutanter ved hjelp recombineering metoden utviklet av Yu et al. (2000) 16, (ii) de relative effektivitetenav konjugativt DNA overføring av forskjellige kromosomale markører, og (iii) effekter av spørringen genet posisjon og kromosomale orientering i forhold til overføring Hfr locus, orit. Vi fant ut at λ - Red-mediert homolog rekombinasjon effektivitet var mye høyere i Hfr Cavalli enn i Hfr Hayes eller Hfr3000. Ved behov kan P1 transduksjon eller en Psuedo Hfr stamme 17, brukes til å lage muterte givere. Vi har med hell tilpasset alle disse fremgangsmåter for fremstilling og screening av et stort antall givere. Siden i vår rettssak konjugasjonsforsøkene den totale effektiviteten av overføring og antall ex-conjugants observert signifikant større med Hfr Cavalli, ble denne belastningen bakgrunn valgt for donor konstruksjon og store eSGA. Alle prosedyrer for eSGA skjermer ved hjelp HFR Cavalli givere er beskrevet.
- Forsterke DNA-fragment for påfølgende recombineering å slette en ikke-essensiell genet
Ansett to-trinns nestet PCR forsterkerefisering (figur 1) for å opprette et gen sletting kassett for utskifting målet åpne leseramme med en Cm motstand markør fra pKD3 plasmid (GI: 15554330, protein id: AAL02033.1) 15. Markøren er flankert av FRT-nettsted 11 tillater fjerning av motstanden genet, hvis nødvendig, i følge opp eksperimenter.
Merk: Vi nestet totrinns PCR å fjerne plasmidet fra den forsterkede produkt som brukes senere til å transformere de bakterielle celler. Fjerne plasmidet (i første PCR) og deretter opprette genet knockout kassetten i den andre PCR er nødvendig fordi transformasjon med et plasmid er mye mer effektiv enn recombineering, og målet er å oppnå - så mye som mulig - bare stammer som har hell erstattet målrettet genomisk DNA med den utvelgbare markør. Et alternativ til nestede PCR er å utføre en restriksjon digest av plasmidet utenfor regionen amplifisert i det andre PCRtrinn. Deretter produktet av restriksjonen digest renses og brukes som en mal i den nestede PCR trinnet (1.1.2). Dette alternativet er også enkel, men krever mer arbeid opp tid.- Bruk ca 45 ng pKD3 som en mal i PCR med fremover F1 og omvendt R1 primere til å produsere en 1070 bp produkt. Rense PCR fragmentet med Qiagen PCR rensing protokollen, og fortynne produktet i sterilt destillert vann til 5 ng / pl konsentrasjon.
- Bruke renset PCR-produkt som en mal, sette opp en ny PCR med gen-spesifikke (f.eks knockout) nestede primere, F2 og R2, som har (i) 45 nt av gen-spesifikke homologi regioner på 5'-ender for å tillate for homolog rekombinasjon umiddelbart oppstrøms og nedstrøms av målgenet for å erstatte den med den Cm motstand markør og (ii) 20 nt på 3'-endene for å prime syntesen av Cm markør. Størrelsen av det produserte fragmentet er 1123 bp. De gen-spesifikke homologi regioner er utformet for å fjerne målet opno leserammen samtidig la noen tilstøtende eller delvis overlappende koding segmenter intakt. Etter dette forsterkning, går du videre til trinn 1.3.
- Forsterke en merking kassett for å skape en viktig genet hypomorphic mutasjon
- Å konstruere hypomorphic donor mutante stammer, legge til et C-terminal sekvensiell peptid affinitet (SPA) fusion tag, som ofte litt påvirker avgjørende protein funksjon ved destabiliserende karakterutskrift overflod (dvs. protein kopi nummer) eller protein folding / aktivitet. For dette formål, lage en valgbar SPA-tag (SPA-Cm) DNA mal ved å konvertere Kan motstanden markør i pJL148 18 til Cm bruker recombineering mellom identiske nukleotidsekvenser flankerer Kan markør i pJL148 og Cm markør i pKD3 15. Den resulterende malen består av in-frame SPA-tag etterfulgt av en Cm motstand markør, og er egnet for PCR amplifikasjon, recombineering og påfølgende eSGA 12.
Merk: </ Strong> Essential gener er potensielt den mest interessante for gen-funksjon studier. Men fordi disse genene ikke kan slettes, hadde innovative metoder for å bli utviklet for å undersøke funksjonelle relasjoner essensielle gener. Flere egnede svært vellykkede tilnærminger har blitt utviklet opprinnelig i gjær. For eksempel, Davierwala et al. (2005) 19 utført GI skjermer ved hjelp av en panel av 575 temperaturfølsomme essensielle genet mutanter, og funnet ut at viktige gener utstilt omtrent fem ganger så mange soldater som unødvendige gener. Likeledes, Breslow et al. (2008) 20 utviklet en "redusert overflod av mRNA perturbasjon '(fuktig) tilnærming for å generere et bibliotek av hypomorphic alleler dekker ~ 82% av essensielle gjær gener for å studere stier og komplekser. Den fuktige tilnærmingen modifiserer 3'end av det uttrykte mRNA, reduserer nivået av målgenet 6, trolig på grunn av mRNA destabilisering. I likhet med den fuktige tilnærming 6, vår strategy har vært å utnytte de subtile effekter av perturbing 3'-enden av det uttrykte mRNA av essensielle proteiner.
Som vi beskriver nedenfor, vil ikke koden i seg selv ikke sannsynlig påvirke protein folding eller funksjon, men den subtile endringen av mRNA ved tag er tilstrekkelig, når det kombineres med miljømessige stressfaktorer eller andre mutasjoner, for å avsløre funksjonelt informative gen-miljø 13 og genet 9-genet, 12 interaksjoner.
For det første, til dags dato, har vi brukt SPA-koder for å rense ~ 3000 essensielle og ikke-essensielle E. coli proteiner 21-23, med over 80% av de 307 E. coli essensielle proteiner blir representert blant våre SPA-merket stammer 8. Fordi koden ble hell brukes til å isolere kjente protein komplekser, som ble gjensidig validert (dvs. samme komplekset kunne bli isolert ved merking og rensing ulike proteiner fra samme kompleks); og de isolerte komplekser var biologisk relevant, vi grunn at kodene gjørevanligvis ikke påvirke protein folding eller funksjon 12. Tilsvarende viste våre upubliserte observasjoner at koden i seg selv ikke påvirker vanligvis belastning vekst. Men begrunnet vi at endring av 3'-UTR ved å integrere koden og markøren kassett, som ble rapportert for fuktige stammer 6, kunne destabilisere visse transkripsjoner på RNA nivå eller i sjeldne tilfeller, hindre riktig folding eller funksjon fusjonsproteiner. Derfor spådde vi at kombinere slike perturbed alleler av essensielle gener med andre funksjonelt relevant mutasjoner andre steder i genomet vil medføre informativ GIS, som faktisk ble observert 9, 12. Videre SPA-merkede alleler av essensielle gener oppviste gen-miljø interaksjoner (f.eks narkotika overfølsomhet) i henhold til fenotypiske profilering arbeid av Nichols et al. (2011) 13, som utsettes en undergruppe av SPA-taggede essensielle stammer til ulike vekstbetingelser. Den samme studien confirmed at de fleste (54 av 58 testede) SPA-merket essensielle stammer viste svekket fitness i en eller flere dyrkningsbetingelser 13, som støtter ideen om at SPA-tag ofte skaper milde hypomorphic alleler i viktige gener som er nyttige for genom-wide GI skjermen programmer, inkludert eSGA. - Forsterke tagging kassett fra SPA-Cm malen ved hjelp gen-spesifikke primere S1 og S2, som hver inneholder (i) en 45 nt gen-spesifikk region for homolog recombineering på 5 'enden, etterfulgt av (ii) en 27 bp SPA- Cm spesifikk sekvens ved 3 'enden.
- Å konstruere hypomorphic donor mutante stammer, legge til et C-terminal sekvensiell peptid affinitet (SPA) fusion tag, som ofte litt påvirker avgjørende protein funksjon ved destabiliserende karakterutskrift overflod (dvs. protein kopi nummer) eller protein folding / aktivitet. For dette formål, lage en valgbar SPA-tag (SPA-Cm) DNA mal ved å konvertere Kan motstanden markør i pJL148 18 til Cm bruker recombineering mellom identiske nukleotidsekvenser flankerer Kan markør i pJL148 og Cm markør i pKD3 15. Den resulterende malen består av in-frame SPA-tag etterfulgt av en Cm motstand markør, og er egnet for PCR amplifikasjon, recombineering og påfølgende eSGA 12.
- Bekrefter og rense PCR produktet
- Bekrefter at merking kassett fullstendig forsterket ved å underkaste 2-5 pl av PCR-produktet til agarosegelelektroforese og rense det gjenværende DNA etter produsentens standard PCR rensing protokoll (Qiagen). Eluer PCR produkt i 30 pl sterilt destillert vann og fortynn til ~ 50 ng / ul konsentrasjon. Den renseteknologied produkt kan brukes umiddelbart i transformasjon (trinn 1.5) eller lagret ved -20 ° C i opptil 6 måneder før bruk.
- Forbereder HFR Cavalli kompetente celler for donor konstruksjon
- Inokuler en ml av den mettede overnatter kulturen i en Hfr Cavalli stamme inn 70 ml frisk Luria-Bertani (LB) medium med 35 pl av 50 pg / ml ampicillin i en 250 ml kolbe. Inkuber kulturen ved 32 ° C med rysting ved 220 rpm inntil en optisk tetthet (OD) 600 nm av ~ 0,5 til 0,6 oppnås (~ 2 timer).
- Overfør kultur til et vannbad for varmeindusert av λ røde rekombinasjon system 16 ved 42 ° C i 15 min med risting ved 160 rpm. Stopp induksjon ved å overføre kulturen til en kjølt is-oppslemming vannbad i 10-20 min ved 160 rpm. Sørge for å holde cellene kaldt fra dette punktet før etter transformasjon, bruke rør og kyvetter som er kjølt på is i minst 15 min før bruk.
- Dele culture like inn 2 pre-kjølt 50 ml polypropylenrør (~ 35 ml kultur per rør) og sentrifuger ved 4400 xg i 6 minutter ved 4 ° C.
- Kast supernatanten, og re-suspendere cellepelleten ved forsiktig vending i ~ 50 ml is-kaldt sterilt destillert vann. Sentrifuger cellene igjen på 4.400 xg i 6 minutter ved 4 ° C. Kast supernatanten og resuspendere hver cellepellet i 20 ml iskald steril 10% glyserol og sentrifuger igjen som beskrevet ovenfor.
- Dekanter supernatanten og resuspendere cellepelleten i 500 ul iskald 10% glyserol. Delmengde forberedt kompetente celler i 50 pl volumer i enkelte, pre-kjølt 1,5 ml mikro-sentrifugerør for umiddelbar forvandling. Cellene kan fryses på tørris eller i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C i opp til 3 måneder. Imidlertid er transformasjon effektivitet høyeste med nylagde kompetente celler.
- Transformation
- Legg 100 ng av renset PCR-produkt fratrinn 1.3.1 til vedkommende celler. Flick røret og la suspensjonen å sitte på isen i 5 min.
- Overfør suspensjon av iskalde kompetente celler og DNA til en pre-avkjølt elektroporering kyvette. Electroporate celleblanding med 2,5 kV, 25 mF, 200 ohm sette i en 2 mm gap kyvette (dvs. hvis du bruker en annen kyvetten, vennligst se produsentens instruksjoner for electroporation innstillinger), og umiddelbart tilsett 1 ml av romtemperatur SOC medium. Overfør electroporated celler i SOC medium i en 15 ml kultur tube og inkuber ved 32 ° C i 1 time med kretsende rysting ved 220 rpm.
- Etter inkubering, sentrifuger cellene ved 4400 xg i 5 min ved romtemperatur. Fjern ca 850 ul av supernatanten, og re-suspendere cellepelleten i den gjenværende væske.
- Spre cellene på forvarmede LB plater inneholdende 17 pg / ml CM, og inkuber ved 32 ° C over natten. Plukk to individuelle transformant kolonier og strek ut på LB-Cm plater for mutant bekreftelse. Vi anbefaler å unngå nettsted transformant kolonier for å redusere muligheten for å plukke stammer med sjeldne suppressor mutasjoner. Også strek samme transformanter på LB-Kan bekrefte at stammene er ikke Kan resistente.
Merk: Siden Cm motstand markør brukes til å lage donor stammer, forventer vi ikke donor mutanter å være Kan motstandsdyktig. Ved å stryke transformantene på både LB-Kan og LB-Cm plater, sørger vi for at donor mutasjon selv ikke noe forårsake Kan motstand. Hvis dette trinn ikke ble utført og målet mutasjoner skulle påvirke muligheten av stammen for å overleve på Kan, ville doble mutanter ikke gjøres effektivt ved hjelp eSGA siden donor stammer ville overleve alle valg trinnene. Dette er bare en føre logisk skritt å ta uventede fenotyper eller andre problemer som kan forstyrre gjennomføringen av eSGA skjermer. Hvis dette trinnet ble hoppet over, andre kontroller would fortsatt identifisere mislykkede skjermer. Imidlertid ville en tidligere påvisning av en donor som er motstandsdyktig i Kan eliminere en serie av uproduktive og unødvendig trinn. Andre mulige grunner for en belastning til å vokse på Kan kunne for eksempel omfatte utløpt antibiotika samt bruk av et PCR-produkt feil eller en stamme for transformasjonen. Alle disse problemene kan identifiseres og håndteres tidlig i prosedyren ved hjelp av denne kontrollen, som ikke er nødvendig, men anbefales for eSGA.
- Bekrefter ikke-essensielle genet sletting (trinn 1.6.1) eller viktig genet hypomorphic mutasjon (§ 1.6.2)
Merk: Når bekrefter genet sletting ved PCR, bør genomisk DNA fra et villtype stamme brukes som en kontroll.- Bekrefte ikke-essensielle genet sletting
- For å bekrefte genet sletting av PCR, isolere genomisk DNA fra de transformerte, antatte knockout stammer dyrket i flytende LB-Cm medium, etter manufacturer instruksjoner (Promega).
- For å bekrefte vellykket recombineering, forsterke DNA fra hver transformant med tre ulike sett med knockout bekreftelse primere. Utføre reaksjoner med ~ 150 ng av genomisk DNA mal, og bekrefter de riktige fragment størrelsene ved å kjøre PCR-syntetiserte produkter på en agarose gel.
- Den første primer settet består av en 20-nt flankerende primer, som ligger 200 bp oppstrøms for det utpekte området (Koco-F), og CM-R primer, som er komplementær til den Cm kassetten sekvensen. Denne forsterkningen er forventet å produsere en 445 nt amplikon i mutant, men ikke i den villtype stamme (figur 1).
- Det andre settet omfatter en fremre primer (Cm-F), annealing til Cm kassetten sekvensen, og en 20-nt revers flankerende bekreftelse primer (Koco-R), som er utformet for å anneal 200 bp nedstrøms for 3'-enden av den slettet genet. Denne forsterkningen reaksjonen ventes å produsere en 309 nt amplikon i mutanten, men ingenT i villtype stamme (figur 1).
- Den tredje PCR inneholder Koco-F og Koco-R primere. Denne reaksjonen er nødvendig for å bekrefte at den valgte stamme er ikke et merodiploid, med ett gen locus har blitt erstattet av kassetten og en annen duplisert men ellers villtype genet kopi fortsatt til stede. Denne forsterkningen fra riktig sletting mutant er forventet å produsere et 1,4 kb produkt (figur 1).
Merk: Når målet genet har omtrent samme lengde i basepar som genet sletting kassett, vil man ikke merke noen forskjell mellom et locus som har blitt erstattet av kassetten, og et locus som ikke har. For en definitiv bekreftelse i slike tilfeller anbefaler vi at du bruker flere primere å spesifikt forsterke en DNA segment innen slettet genet. I dette tilfellet, hvis genet er blitt slettet, vil en forsterkning produktet bli observert bare i villtype kontroll belastning og ikke i mutant. Disse primerekan være manuelt eller beregningsmessig designet for å spesifikt forsterke et segment av DNA innenfor den slettede regionen. Vi vanligvis forsterke 140 bp regioner.
- Bekrefter viktig genet hypomorphic mutasjon
- For å bekrefte hypomorphic mutasjonen ved PCR, bruke gen-spesifikk 20-nt forover (Koco-F) og reverse primere (Koco-R) som befinner seg 200 bp oppstrøms og nedstrøms, henholdsvis av SPA-tag innstikkstedet (figur 2).
Merk: Denne forsterkningen trinn brukes som en kontroll for å sikre fravær av et ukodet kopi av target essensielle genet. Når kun et kodet versjon er tilstede, er et enkelt bånd 310 bp større enn SPA-Cm amplikon observert. En 400 bp produktet ville signalisere tilstedeværelsen av ukodede versjonen av genet. - Parallelt med PCR bekreftelse, bruke Western blotting å verifisere i-frame innsetting av SPA-koden ved hjelp av en anti-FLAG M2 antistoff spesifikt til flagget-epitoper av SPA-tag 21.
- For å bekrefte hypomorphic mutasjonen ved PCR, bruke gen-spesifikk 20-nt forover (Koco-F) og reverse primere (Koco-R) som befinner seg 200 bp oppstrøms og nedstrøms, henholdsvis av SPA-tag innstikkstedet (figur 2).
- Bekrefte ikke-essensielle genet sletting
- Lagring av bekreftet donor belastning
- Overfør overnatter kultur bekreftet rekombinant donor mutantstammen til de merkede kryorør, supplere med glycerol til 15% endelig konsentrasjon, og bland godt. For langtidslagring, holde kryorør ved -80 ° C.
2. Oppstillingsanordningen E. coli F-Mottaker Mutants for eSGA Screens
- Replica-pin E. coli Keio eneste ikke-essensielle genet sletting mutant samling generert av Mori et al. (3968 stammer 11, F-BW25113; kan fås fra Open Biosystems) robotically til tjuefire 384-brønnen mikroplater inneholder 80 pl av flytende LB-medium per brønn , supplert med 50 ug / ml Kansas
Merk: For systematisk å vurdere soldater med essensielle gener, kan mottakeren Keio samlingen 11 suppleres med F-Kan-merket viktig genet hypomorphic mutantstammer med C-terminal SPA-tags 22, 23. - For å gjøre plass for grensekontroll belastningen, som vil fungere som en positiv kontroll, hjelp i innen og mellom plate normalizations samt i automatiserte colony quantizations, fjerne de inokulerte mediet fra de ytterste brønner av hver plate fra trinnet ovenfor og overføring til nye plater, igjen forlater de ytterste brønner tom.
Merk: Grensekontrollen stamme JW5028 fra Keio samlingen 11 er slettet for en liten pseudo gen som ikke har og ikke i våre hel-genom skjermer, viser soldater med eventuelle givere. Derfor er dette en god positiv kontroll belastning å identifisere sjeldne tilfeller når konjugering, låsing eller valg har feilet, noe som resulterer i fraværende eller sporadisk kant belastning vekst. For eksempel, hvis de grensekontrolloppgaver koloniene ikke vokse etter dobbel mutant utvalget kan spørringen belastningen ikke være i stand konjugasjon, kan konjugering har blitt forsøkt ina tilstand som hindret den fra å ta sted (for eksempel på en antibiotika-holdig plate), eller en feil antibiotika kan ha blitt lagt til valg plate. Tilsvarende, hvis svært få, sporadiske kolonier observert på hele platen, inkludert grensen, kan konjugasjon eller låsing har mislyktes, og skjermen må gjentas. Hvis dette sporadisk grensen veksten er reproduserbar, kan det tyde konsekvent dårlig donor konjugering og dermed tilfeller der doble mutanter er ikke observert er muligens på grunn av konjugering svikt, ikke sant soldater. Slike skjermer måtte kastes fra videre analyse. Videre, ved å være til stede på alle platene, lar grensekontroll belastningen kolonien kvantisering programvare for å automatisk finne koloni posisjoner på de doble mutant plater og dermed koloni posisjoner ikke må avgrenses manuelt. Til slutt, grensekontrollen belastning hjelpemidler i normalisering av koloniens størrelser innenfor (for eksempel ulike rader i en plate) og between (for eksempel ulike mottaker platene festet med samme donor til forskjellige tider) platene. - Likeledes, opprette negative kontrollprøver flekker ved å fjerne eventuelle to stammer fra et annet sted innenfor hver plate (ikke kant) og overføre påkjenningene til en ny plate. Fylle disse tomme brønner med LB-medium inneholdende 17 ug / ml av CM. Disse negative kontroll flekker er forventet å være tom i mottakeren og dermed doble mutant plater og bidra til at det var ingen behandling eller plate håndtering feil når nummerering, bildebehandling, eller låsing platene.
Merk: Disse tomme flekker er nødvendig negative kontroller. Negative kontroller bidra til å identifisere tilfeller når utvalget svikter - når negative kontrollstammer vokse under valget. Vi foreslår at ikke bare velger unike negative kontrollprøver flekker for hver av mottaker platene, men også å velge negative kontrollprøver flekker innen samme kvadrant av platen (for eksempel lavere til høyre). Denne måten, mønsteretav negative kontroll flekker ville identifisere mulige plate feilaktig bruk feil (f.eks plater blir feilmerket eller blir låst opp ned, der det øvre venstre kolonien er festet i nedre høyre posisjon). - Inokulere Keio stamme JW5028 11, med en pseudogene sletting, i en 500 ml flaske med 200 ml LB, som inneholder 50 mikrogram / ml Kansas Basert på våre hel-genom eSGA skjermer, er veksten av denne spesielle mutant nærmest vill attraksjon BW25113 og det er således brukt som en kant kontroll.
- Dyrker grupperte stammer samt JW5028 kultur natten ved 32 ° C med 190 rpm orbital risting til en OD på ~ 0,4 til 0,6 ved 600 nm. Etter overnatter vekst, fyll i grenseområdene brønner med ca 80 ul JW5028 overnatter kultur.
- De sammensatte platene kan brukes i trinn 3.2. Alternativt, for langtidslagring, utfyller hverandre godt i mottakerlandene plater med 15% glyserol, bland media og glyserol, og holde plateneved -80 ° C.
3. Høy tetthet Strain Mating Prosedyre for å generere E. coli Double Mutants
- Vokse Hfr donor belastningen, bærer spørringen mutasjon, merket med CM, overnatting ved 32 ° C i rikt LB-Cm flytende medium (17 ug / ml av CM) med risting ved 220 rpm.
- Pin bestilte mottakeren mutant samling i 384-koloni tetthet på fast LB plater supplert med 50 ug / ml av Kan. Parallelt pin donor spørringen mutantstammen i 384-koloni tetthet på samme antall LB plater, supplert med 17 ug / ml Cm. Inkuber platene over natten ved 32 ° C.
Merk: mottaker platene som brukes for låsing kan kreve opptil 36 t for å skaffe tilstrekkelig store kolonier for senere trinn. Når gjennomsnittlig kant koloni størrelse er ca 2 mm i diameter (eller høyere), platene er klar til å bli festet. - Å bøye stammene, pin donor fra en 384-koloni overnatter donor plate påtil fast LB plate. Deretter fester et enkelt 384-koloni mottaker plate over nystekte festet donor på konjugering plate. Fortsett pinning inntil alle giver-mottaker platene har vært konjugert ved pinning bort solide LB konjugering platene. Inkuber de festede konjugering platene ved 32 ° C i 16 til 24 timer.
Merk: Individuelle enkelt mutant donor stammer kan vise gen-til-genet variasjon i parring effektivitet på grunn av de potensielle effektene av mutasjoner på konjugasjon, DNA overføring effektivitet, eller fitness. Vekst kan bli stoppet når som helst mellom 16 og 24 timer, når tilstrekkelig store kolonier er innhentet for påfølgende låsing trinn. Bøyning som varer 16-24 timer produsere tilstrekkelige antallet fastboende conjugants for reproduserbare eSGA resultater selv for mutantene av sen overføring gener eller mutanter med litt lavere fitness. - Pin hver 384-tetthet konjugering plate på en enkelt faststoff LB plate, inneholdende cm (17 ug / ml) og Kan (50ug / ml) inntil alle konjugering platene har blitt låst. Inkuber nystekte låste første valg plater for 16-36 timer ved 32 ° C.
Merk: I forhold til de valg trinnene, kan ulike mengder tid være nødvendig for ulike donor skjermer. Ettersom alle doble mutanter i et gitt skjermen har samme donor mutasjon, i gjennomsnitt, gir en langsommere voksende donor mutant opphav til tregere vokser doble mutanter. Således, avhengig av donor egnethet kan valg-trinn krever mellom 16 og 36 timer. Den doble mutant veksten kan stoppes når den doble mutanter er tilstrekkelig stor til at påfølgende trinn enten pinning etter første utvalg eller avbildning etter den andre. Dette betyr vanligvis å grensekontroll kolonier i gjennomsnitt med minst 2 mm diameter. - Re-pin hver første valg plate på en annen, dobbel narkotika (CM og Kan), valg plate i 1536-kolonien format, slik at hver første valg koloni er representert med fire kolonier påden andre utvalg plate. Inkuber platene for 16-36 timer ved 32 ° C. Fotografere endelige doble mutant utvalg plater å kvantitativt måle veksten egnethet av mutant og analysere interaksjoner mellom genet parene (figur 3).
Merk: Selv om hyppigheten av merodiploidy (partielle kromosomale duplikasjoner) er lav på ca 1/1, 000 celler 24, kan merodiploidy maskere GI. Derfor anbefaler vi at du inkluderer biologiske replikerer i alle eSGA skjermer. Heldigvis kan kommersielle disponibel plater og plast låsing pads gjenbrukes opptil tre ganger ved sterilisering av materialer som følger: Agar fra platene kastes og platene samt elektrodene er sterilisert ved å dyppe dem i 10% blekemiddel natten, etterfulgt av en skylling med destillert vann, vasking i 70% etanol, og luft-tørke plasticware i en flyt hette under ultrafiolett lys. De sterile pads og plater lagres i forseglede sterile plastposer inntil bruk.
4. Bearbeiding av data og Utlede GI Poeng
- Mål kolonier på hver plate i batch-modus eller individuelt ved hjelp av en spesialisert koloni bildebehandlingsprogrammer 3, 9.
Merk: En passende Java-baserte high-throughput koloni bildebehandling og scoring programmet er nå fritt tilgjengelig for offentlig tilgang ( http://srcollins77.users.sourceforge.net/ ). Programvaren fungerer på ulike plattformer (dvs. Mac eller PC), og kan bli lansert enten som en kjørbar eller fra en terminal vindu. - Normalisere rå koloni størrelse målinger ved å korrigere for systematiske skjevheter i og mellom platene som plate kanteffekter, inter-plate variasjon effekter, ujevn image belysning, gjenstander på grunn av fysisk krumning av agaroverflaten, konkurranse effekter for nabokommunene kolonier og mulige låsing defekter , så vel som forskjeller i veksttid
- Koloniene i kanten rader og kolonner tendens til å være større på grunn av lavere konkurranse om næringsstoffer enn funnet i midten av platen. Derfor, for å korrigere for denne effekten, skalere størrelsene av kanten kolonier å være slik at den midlere størrelse i raden eller kolonnen er lik medianstørrelse koloniene i midten av platen.
- Analysere resultatene statistisk å ta hensyn til reproduserbarhet og standard avvik fra median størrelser av Parallellprøvene colony målinger. Minst tre uavhengige biologiske replikere eksperimenter er nødvendige for å vurdere den eksperimentelle reproduserbarhet.
- Slutt bruker de normaliserte median kolonivekst fitness størrelser å generere en GI skåre (S) for hvert gen pair med følgende formel:
n 1 "src =" / files/ftp_upload/4056/4056eq1.jpg "/>
Hvor, S var = (var Exp x (n Exp -1) + Var Cont x (n Cont -1)) / (n Exp + n Cont -2); Var Exp = maksimal variansen for normaliserte koloni størrelse på dobbel mutant, Var Cont = median av avvikene i de normaliserte doble mutant koloni størrelser fra referansegruppen sett, n Exp = antall målinger av doble mutant koloni størrelser, n Cont = median antall eksperimentelle gjentak over alle eksperimenter, μ Exp = median normaliserte koloni størrelser av de doble mutanter, og μ Cont = median av normaliserte koloni størrelser for alle doble mutanter oppstår fra den eneste donor mutantstammen. S-scoren reflekterer både statistisk sikkerhet fra en antatt digenic interaksjon samt biologiske styrken av interaksjonen. Sterke positive S-score indikerer lindre effekter, suggesting at samspill gener delta på samme bane 9, mens betydelig negativ S-score gjenspeiler syntetisk sykdom eller dødelighet, som ofte tyder på medlemskap i parallelle redundante veier 9. For å bestemme veien-nivå funksjonelle relasjoner blir en enkelt S-score for hvert par av testede gener produseres fra den endelige datasettet.
Merk: I vår forrige undersøkelse 9, fant vi at rekombinasjon tendens til å oppstå sjeldnere mellom gener innenfor 30 kbp av hverandre. Derfor, for nedstrøms analyse, etter normalisering og score generasjon, fjerner vi interaksjoner mellom gener innen 30 kbp av hverandre. I tillegg til GIS seg selv, kan funksjonelle relasjoner mellom parene av gener bli undersøkt ved å se på hvor like GI profiler for de to gener er. GI profil av et gen er settet av alle interaksjoner av det genet med alle andre gener i genomet utenforgenets trekkstengene område. Funksjonelt tilsvarende gener tendens til å ha høyere korrelasjoner av genetiske interaksjoner profiler 12, 25. Således, ved å beregne korrelasjonskoeffisientene for alle genene i den eksperimentelle datasettet kan man bruke eSGA for undersøkelse funksjonelle relasjoner selv mellom gener liggende nær hverandre på kromosomet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har skissert en trinnvis protokoll for bruk av robot eSGA screening for å undersøke bakterielle genfunksjoner på en sti nivå ved avhør GI. Denne tilnærmingen kan brukes for å studere enkelte gener samt hele biologiske systemer i E. coli. Nøye gjennomføre de eksperimentelle trinnene beskrevet ovenfor, inkludert alle nødvendige kontroller, og strengt analysere og uavhengig validere GI data er viktige aspekter for å lykkes med eSGA i å gjøre nye funksjonelle funn. I tillegg til eSGA, en konseptuelt lignende metode for å studere GI i E. coli, kalt GIANT-coli 17, kan brukes til å belyse romanen funksjonelle relasjoner som ofte savnet av andre metoder, som proteomikk 23 eller fenotypiske 13 skjermer alene. Likevel, i likhet med ethvert genom-wide tilnærming, eksisterer begrensninger gjør på anvendeligheten av eSGA eller GIANT-coli, for eksempel for andre bakterielle arter. Dette er til delsforårsake av utilgjengelighet av genom-wide enkelt gen sletting mutantstammen samlinger for de fleste bakterielle arter, spesielt for arter hvor målrettet mutagenese er begrenset av en lav naturlig frekvens av homolog rekombinasjon. I slike tilfeller, kan genet forstyrrelser ved hjelp av metoder slik som tilfeldige sporbar mutagenese-baserte assays som TnSeq 31 potensielt bli brukt til å undersøke bakterielle genfunksjoner. For en oversikt over nye alternative bakterielle genetiske screening prosedyrer, se gjennomgang papir ved Gagarinova og Emili (2012) 32.
Selv GI metoder ofte avdekke mange interessante forbindelser som tyder på romanen mekanistiske lenker, integrering av disse dataene med annen informasjon som fenotypisk profilering 13, fysiske interaksjon nettverk 22, 23, og GC-slutning foreninger kan være spesielt lærerikt. For eksempel, som med GI-nettverk, GC foreninger, som er basert på bevaringav genet rekkefølge (operons), bakterielle genet fusjoner, operon rekombinasjon frekvenser som stammer fra intergeniske avstander spådd operons tvers genomer, kan så vel som fylogenetisk profilering 33 gir ytterligere innsikt i hvordan en bakteriell celle organiserer protein komplekser i funksjonelle trasé å megle og koordinere store cellulære prosesser 12, 23.
E. coli er en arbeidshest modell for å forstå molekylærbiologi andre Gram-negative bakterier. For dette formål, kan eSGA GI data brukes i forbindelse med sammenlignende genomikk informasjon (f.eks fylogenetisk profilering, gene expression profilering) for å undersøke den evolusjonære bevaring av funksjonelle relasjoner oppdaget av eSGA på tvers av andre proteobacterial arter og prokaryote taxa. Videre interaksjonsdata generert for E. coli kan brukes til å få innsikt i veien arkitektur mikrober oppdaget av metagenomikrofoner, som funksjonelle merknader mangler. Siden mange gener er allment konservert over alle mikrober 23, og fordi antibiotikafølsomhet kan forbedres ved visse genetiske forstyrrelser 34, kan de funksjonelle relasjoner opplyst av eSGA selv potensielt utnyttes for å utforme innovativ kombinasjon narkotika terapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av midler fra Genome Canada, Ontario Genomics Institute, og den kanadiske Institutes of Health Research tilskudd til JG og AE AG er en mottaker av Vanier Canada Graduate Scholarship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| I. Antibiotics | |||
| Chloramphenicol | Bioshop | #CLR201 | |
| Kanamycin | #KAN201 | ||
| Ampicillin | # AMP201 | ||
| 2. Luria-Bertani medium | |||
| LB powder | Bioshop | #LBL405 | |
| Agar | Bioshop | #AGR003 | |
| 3. Bacterial Strains and Plasmids | |||
| Hfr Cavalli strain λred system (JL238) | Babu et al.14. | ||
| pKD3 | E. coli Genetic Stock Centre, Yale | ||
| Keio E. coli F- recipient collection | National BioResource Project (NBRP) of Japan11 | ||
| Hypomorphic E. coli F- SPA-tag strains | Open biosystems; Babu et al.14 | ||
| 4. Primers | |||
| pKD3-based desalted constant primers | F1: 5'-GGCTGACATGGGAATTAGC-3' R1: 5'-AGATTGCAGCATTACACGTCTT-3' |
||
| Desalted custom primers | Cm-R: 5'-TTATACGCAAGGCGACAAGG-3' Cm-F: 5'- GATCTTCCGTCACAGGTAGG-3' |
||
| Desalted custom primers | F2 and R2: 20 nt constant regions based on pKD3 sequence and 45 nt custom homology regions F2 constant region: 5'-CATATGAATATCCTCCTTA-3' R2 constant region: 5'-TGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3'S1 and S2: 27 nt constant regions for priming the amplification of the SPA-Cm cassette and 45 nt custom homology regions S1 constant region: 5'AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3' S2 constant region: 5'- GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT -3' KOCO-F and KOCO-C: 20 nt primers 200 bp away from the non-essential gene deletion site or the essential gene SPA-tag insertion site |
||
| 5. PCR and Electrophoresis Reagents | |||
| Taq DNA polymerase | Fermentas | # EP0281 | |
| 10X PCR buffer | Fermentas | # EP0281 | |
| 10 mM dNTPs | Fermentas | # EP0281 | |
| 25 mM MgCl2 | Fermentas | # EP0281 | |
| Agarose | Bioshop | # AGA002 | |
| Loading dye | NEB | #B7021S | |
| Ethidium bromide | Bioshop | # ETB444 | |
| 10X TBE buffer | Bioshop | # ETB444.10 | |
| Tris Base | Bioshop | # TRS001 | |
| Boric acid | Sigma | # T1503-1KG | |
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | Sigma | # B6768-500G | |
| DNA ladder | NEB | #N3232L | |
| 6. DNA isolation and Clean-up Kits | |||
| Genomic DNA isolation and purification kit | Promega | #A1120 | |
| Plasmid Midi kit | Qiagen | # 12143 | |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | #28104 | |
| 7. Equipment for PCR, Transformation and Replica-pinning | |||
| Thermal cycler | BioRad, iCycler | ||
| Agarose gel electrophoresis | BioRad | ||
| Electroporator | Bio-Rad GenePulser II | ||
| 0.2 cm electroporation cuvette | Bio-Rad | ||
| 42 °C water bath shaker | Innova 3100 | ||
| Beckman Coulter TJ-25 centrifuge | Beckman Coulter | ||
| 32 °C shaker | New Brunswick Scientific, USA | ||
| 32 °C plate incubator | Fisher Scientific | ||
| RoToR-HDA benchtop robot | Singer Instruments | ||
| 96, 384 and 1,536 pin density pads | Singer Instruments | ||
| 96 or 384 long pins | Singer Instruments | ||
| 8. Imaging Equipments | |||
| Camera stand | Kaiser | ||
| Digital camera, 10 megapixel | Any Vendor | ||
| Light boxes, Testrite 16" x 24" units | Testrite | ||
| 9. Pads or Plates Recycling | |||
| 10% bleach | Any Vendor | ||
| 70% ethanol | Any Vendor | ||
| Sterile distilled water | Any Vendor | ||
| Flow hood | Any Vendor | ||
| Ultraviolet lamp | Any Vendor | ||
| 10. Labware | |||
| 50 ml polypropylene tubes | Any Vendor | ||
| 1.5 ml micro-centrifuge tubes | Any Vendor | ||
| 250 ml conical flaks | VWR | # 29140-045 | |
| 15 ml sterile culture tubes | Thermo Scientific | # 366052 | |
| Cryogenic vials | VWR | # 479-3221 | |
| Rectangular Plates | Singer Instruments | ||
| 96-well and 384-well microtitre plates | Singer Instruments | Nunc | |
| Plate roller for sealing multi-well | Sigma | #R1275 | |
| plates | ABgene | # AB-0580 | |
| Adhesive plate seals | Fisher Scientific | # 13-990-14 | |
| -80 °C freezer | Any Vendor | ||
References
- Bandyopadhyay, S., Kelley, R., Krogan, N. J., Ideker, T. Functional maps of protein complexes from quantitative genetic interaction data. PLoS Comput. Biol. 4, e1000065 (2008).
- Costanzo, M., Baryshnikova, A., Myers, C. L., Andrews, B., Boone, C. Charting the genetic interaction map of a cell. Curr. Opin. Biotechnol. 22, 66-74 (2011).
- Costanzo, M., et al. The genetic landscape of a cell. Science. 327, 425-4231 (2010).
- Fiedler, D., et al. Functional organization of the S. cerevisiae phosphorylation network. Cell. 136, 952-963 (2009).
- Roguev, A., et al. Conservation and rewiring of functional modules revealed by an epistasis map in fission yeast. Science. 322, 405-4010 (2008).
- Schuldiner, M., et al. Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile. Cell. 123, 507-519 (2005).
- Wilmes, G. M., et al. A genetic interaction map of RNA-processing factors reveals links between Sem1/Dss1-containing complexes and mRNA export and splicing. Mol. Cell. 32, 735-746 (2008).
- Babu, M., et al. Systems-level approaches for identifying and analyzing genetic interaction networks in Escherichia coli and extensions to other prokaryotes. Mol. Biosyst. 12, 1439-1455 (2009).
- Butland, G., et al. coli synthetic genetic array analysis. Nat. Methods. 5, 789-7895 (2008).
- Typas, A., et al. Regulation of peptidoglycan synthesis by outer-membrane proteins. Cell. 143, 1097-10109 (2010).
- Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol. Syst. Biol. 2, 2006-200008 (2006).
- Babu, M., et al. Genetic interaction maps in Escherichia coli reveal functional crosstalk among cell envelope biogenesis pathways. PLoS Genet. 7, e1002377 (2011).
- Nichols, R. J., et al. Phenotypic landscape of a bacterial cell. Cell. 144, 143-156 (2011).
- Babu, M., Gagarinova, A., Greenblatt, J., Emili, A. Array-based synthetic genetic screens to map bacterial pathways and functional networks in Escherichia coli. Methods Mol Biol. 765, 125-153 (2011).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-665 (2000).
- Yu, D., et al. An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 5978-5983 (2000).
- Typas, A., et al. quantitative analyses of genetic interactions in. E. coli. Nat. Methods. 5, 781-787 (2008).
- Zeghouf, M., et al. Sequential Peptide Affinity (SPA) system for the identification of mammalian and bacterial protein complexes. J. Proteome Res. 3, 463-468 (2004).
- Davierwala, A. P., et al. , 1147-1152 (2005).
- Breslow, D. K., et al. A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome. Nat. Methods. 5, 711-718 (2008).
- Babu, M., et al. Sequential peptide affinity purification system for the systematic isolation and identification of protein complexes from Escherichia coli. Methods Mol. Biol. 564, 373-400 (2009).
- Butland, G., et al. Interaction network containing conserved and essential protein complexes in Escherichia coli. Nature. 433, 531-537 (2005).
- Hu, P., Janga, S. C., Babu, M., Diaz-Mejia, J. J., Butland, G., et al. Global functional atlas of Escherichia coli encompassing previously uncharacterized proteins. PLoS Biol. 7, (2009).
- Anderson, R. P., Roth, J. R. Tandem genetic duplications in phage and bacteria. Annu. Rev. Microbiol. 31, 473-505 (1977).
- Boone, C., Bussey, H., Andrews, B. J. Exploring genetic interactions and networks with yeast. Nat. Rev. Genet. 8, 437-449 (2007).
- Collins, S. R., et al. Functional dissection of protein complexes involved in yeast chromosome biology using a genetic interaction map. Nature. 446, 806-8010 (2007).
- Le Meur, N., Gentleman, R. Modeling synthetic lethality. Genome Biol. 9, R135 (2008).
- Tong, A. H., et al. Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants. Science. 294, 2364-2368 (2001).
- Tong, A. H., et al. Global mapping of the yeast genetic interaction network. Science. 303, 808-813 (2004).
- Wong, S. L., et al. Combining biological networks to predict genetic interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 15682-15687 (2004).
- van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nat. Methods. 6, 767-772 (2009).
- Gagarinova, A., Emili, A. Genome-scale genetic manipulation methods for exploring bacterial molecular biology. Mol. Biosyst. 8, 1626-1638 (2012).
- Dewey, C. N., et al. Positional orthology: putting genomic evolutionary relationships into context. Brief Bioinform. 12, 401-412 (2011).
- St Onge, R. P., et al. Systematic pathway analysis using high-resolution fitness profiling of combinatorial gene deletions. Nat. Genet. 39, 199-206 (2007).
