Summary
Систематические крупномасштабные синтетические генетические (ген-ген или эпистаза) экранов взаимодействия может быть использована для изучения генетической избыточности и пути перекрестных помех. Здесь мы описываем высокой пропускной количественные синтетических генетических технологий скрининга массив, называемый eSGA, которые мы разработали для выяснения отношений эпистатических и изучение генных сетей взаимодействия в
Protocol
1. Построение Hfr Cavalli донора мутантных штаммов по Recombineering 15, 16
Шаги для построения пятна eSGA доноров описаны ниже. Короче говоря, мы используем целевые λ - Red опосредованной гомологичной рекомбинации 16 из усиленного выбор кассет маркером фрагменты ДНК методом ПЦР для создания несущественных генов удаления мутантов (раздел 1.1) или существенных генов гипоморфных мутантных штаммов-доноров (раздел 1.2), которые затем используются в качестве «запросами», чтобы определить GI сетей.
Примечание: В процессе развития технологий, мы оценивали эффективность использования HFR-опосредованной передачи конъюгативных для объединения мутации использованием четко определенных Hfr донора штамма (HFR Cavalli, Hfr Hayes, и Hfr 3000). Мы рассмотрели (I) способность эффективно сделать донором мутантов помощью recombineering метод впервые Ю. и соавт. (2000) 16, (II) относительная эффективностьконъюгативных переноса ДНК различных хромосомных маркеров, и (III) последствия запроса положение генов и хромосомных ориентации по отношению к локусу Hfr передачи, Орит. Мы обнаружили, что λ - Red-опосредованной гомологичной рекомбинации эффективность была значительно выше в Hfr Cavalli, чем в Hfr Hayes или Hfr3000. Если требуется, трансдукции P1 или деформации Psuedo Hfr 17, может быть использована для создания мутантного доноров. Мы успешно адаптировать все эти способы получения и скрининга большого числа доноров. Так как в наших опытах суда сопряжения, общая эффективность передачи и число бывших conjugants наблюдаются было значительно больше с Hfr Cavalli, данный фон штамм был выбран для строительства доноров и крупных eSGA. Все процедуры для экранов eSGA использованием Hfr Cavalli доноров описаны.
- Усиливая фрагмент ДНК для последующего recombineering для удаления несущественных генов
Применять два шага ПЦР амплитудыфикации (рис. 1) для создания кассеты генов удаления для замены целевой открытые рамки считывания с Cm маркер устойчивости от pKD3 плазмиды (GI: 15554330; белка ID: AAL02033.1) 15. Маркер в окружении FRT-сайты 11 позволяет удаление гена устойчивости, при необходимости, в последующих экспериментах.
Примечание: Мы вложенные двухступенчатой ПЦР для удаления плазмиды из усиленного продукт, который используется в дальнейшем для преобразования бактериальных клеток. Удаление плазмиды (в первой ПЦР), а затем создать кассеты генов нокаутом во втором ПЦР является необходимым, поскольку преобразование с плазмидой является гораздо более эффективным, чем recombineering, а целью является получение - насколько это возможно - только штаммы, которые имеют успешно заменил целевых геномной ДНК с селективного маркера. Альтернативой ПЦР заключается в выполнении ограничений дайджест плазмиды за пределами региона усиливаются во второй ПЦРшагу. Тогда произведение ограничение дайджест очищают и используют в качестве шаблона во вложенном шаг ПЦР (1.1.2). Эта опция также проста, но требует больше работы, до времени.- Используйте около 45 нг pKD3 в качестве матрицы в ПЦР с прямой и обратной F1 R1 праймеров для получения 1070 б.п. продукта. Очищают ПЦР фрагмента помощью очистки ПЦР Qiagen протокол, и развести продукт в стерильной дистиллированной водой до 5 нг / мкл концентрации.
- Использование очищенного продукта ПЦР в качестве шаблона, созданного второй ПЦР с ген-специфического (например нокаутом) вложенных грунтовки, F2 и R2, которые имеют (я) 45 нуклеотидов гена конкретных областей гомологии на 5'-концов, чтобы позволить для гомологичной рекомбинации сразу на входе и выходе гена-мишени, чтобы заменить его Cm маркер устойчивости и (II) 20 нуклеотидов на 3'-концов к главному синтеза Cm маркером. Размер производимых фрагмента 1123 п.о.. Ген конкретных регионах гомологии предназначены для удаления целевого опан рамки считывания, оставляя любую соседнюю или частично перекрывающихся сегментов кодирования нетронутыми. После этого усиления, переходите к шагу 1.3.
- Развивая пометки кассеты для создания существенных генных мутаций гипоморфных
- Для построения гипоморфных доноров мутантные штаммы, добавьте C-терминал последовательного пептида сродство (SPA) слияние тегов, которые часто немного влияет на важнейшую функцию белка дестабилизирующим обилие стенограмма (т.е. белки число копий) или сворачивания белка / деятельности. Для этого создайте выбор SPA-тегов (SPA-см) ДНК-матрицы путем преобразования маркера Кан сопротивления в pJL148 18 до см с использованием recombineering между одинаковыми нуклеотидных последовательностей фланговых маркеров Кан в pJL148 и Cm маркер в pKD3 15. В результате шаблон состоит из в рамке SPA-теги следуют Cm маркер устойчивости, и подходит для ПЦР-амплификации, recombineering и последующие eSGA 12.
Примечание: </ STRONG> Основные гены потенциально являются наиболее интересными для изучения функций генов. Однако, поскольку эти гены не могут быть удалены, инновационные методы должны были быть разработаны для исследования функциональных связей основных генов. Несколько подходящих весьма успешных подходов были разработаны первоначально в дрожжах. Например, Davierwala и соавт. (2005) 19 выполнена Г.И. экранов с помощью панелей из 575 термочувствительные мутанты существенных генов и обнаружили, что существенных генов выставлены примерно в пять раз число солдат, как несущественные гены. Кроме того, Бреслоу и соавт. (2008) 20 развитых сократилась обилие мРНК возмущение "(влажный) подход для создания библиотеки гипоморфных аллелей покрытие ~ 82% эфирного генов дрожжей для изучения путей и комплексов. Влажной подход изменяет 3'выразил мРНК, снижение уровня гена-мишени 6, вероятно, связано с мРНК дестабилизации. Подобный подход влажной 6, наш СтратегУ в том, чтобы использовать тонкие эффекты возмущающих конце 3 'выразил мРНК необходимых белков.
Как мы опишем ниже, тег сам по себе не влияет на вероятность складывающиеся белка или функции, но тонкие возмущения мРНК тегом достаточно, в сочетании с экологических стрессоров или других мутаций, выявить функционально информативных генов и окружающей среды 13 и генной Ген-9, 12 взаимодействий.
Во-первых, на сегодняшний день, мы использовали SPA-теги, чтобы очистить ~ 3,000 существенных и несущественных кишечная палочка белков 21-23, причем более 80% из 307 E.coli, необходимых белков, которую он представляет в числе наших SPA-отмеченных штаммы 8. Поскольку тег был успешно использован для выделения известные белковые комплексы, которые были взаимно подтверждено (т.е. тот же комплекс может быть выделен с помощью меток и очистки различных белков внутри самого комплекса), а также изолированные комплексы, биологически соответствующий, мы причина того, что тэги делатькак правило, не влияют на складных белка или функции 12. Кроме того, наши неопубликованные наблюдения показали, что тег само по себе обычно не влияет на рост штамма. Тем не менее, мы рассудили, что изменения 3'-UTR путем интеграции теги и маркер кассету, как сообщалось, для влажных штаммами 6, может дестабилизировать определенных протоколов на уровне РНК или, в редких случаях, препятствуют надлежащему складные или функции слитых белков. Таким образом, мы предсказали, что сочетание таких возмущенных аллелей генов существенно с другими функционально значимых мутаций в другом месте генома приведет к информативные солдат, которые действительно наблюдался 9, 12. Кроме того, SPA-отмеченных аллелей генов существенно выставлены генов с окружающей средой (например, препарат гиперчувствительности) в соответствии с фенотипическими работы по профилированию Nichols и соавт. (2011) 13, который подвергается подмножество SPA-отмеченных существенных деформаций для различных условий роста. То же исследование confirmeг, что большинство (54 из 58 проверенных) SPA-отмеченных существенных деформаций показал, фитнес нарушениями в одной или нескольких условий культивирования 13, который поддерживает идею о том, что SPA-теги часто создает мягкий гипоморфных аллелей в основных генов, которые являются полезными для генома GI экран приложений, включая eSGA. - Усиление мечения кассету из SPA-Cm шаблона с помощью ген-специфического праймера S1 и S2, каждая из которых содержит (I) в 45 нуклеотидов генов конкретного региона для гомологичной recombineering на 5 'конце, а затем (II) на 27 б.п. SPA- Cm определенной последовательности на конец 3 '.
- Для построения гипоморфных доноров мутантные штаммы, добавьте C-терминал последовательного пептида сродство (SPA) слияние тегов, которые часто немного влияет на важнейшую функцию белка дестабилизирующим обилие стенограмма (т.е. белки число копий) или сворачивания белка / деятельности. Для этого создайте выбор SPA-тегов (SPA-см) ДНК-матрицы путем преобразования маркера Кан сопротивления в pJL148 18 до см с использованием recombineering между одинаковыми нуклеотидных последовательностей фланговых маркеров Кан в pJL148 и Cm маркер в pKD3 15. В результате шаблон состоит из в рамке SPA-теги следуют Cm маркер устойчивости, и подходит для ПЦР-амплификации, recombineering и последующие eSGA 12.
- Проверка и очистка продуктов ПЦР
- Убедитесь, что теги кассета была правильно усиливаются при условии 2-5 мкл продукта ПЦР для электрофореза в агарозном геле и очистить оставшиеся ДНК после стандартной ПЦР производителя очистки протокола (Qiagen). Элюируйте продукта ПЦР в 30 мкл стерильной дистиллированной воде и доводят до ~ 50 нг / мкл концентрации. Purifiред продукт может быть использован непосредственно в преобразовании (шаг 1,5) или хранят при температуре -20 ° C в течение 6 месяцев до использования.
- Подготовка Hfr Cavalli компетентных клеток донора для строительства
- Инокулировать одном мл насыщенной ночной культуры штамма Hfr Cavalli в 70 мл свежего Лурия-Bertani (LB) среда с 35 мкл 50 мкг / мл ампициллина в 250 мл колбу. Инкубируют культуры при 32 ° C при встряхивании при 220 оборотов в минуту до оптической плотности (ОП) 600 нм ~ 0.5-0.6 получается (~ 2 часа).
- Передача культуры на водяной бане тепло индукции λ красным системы рекомбинации 16 при 42 ° С в течение 15 мин при встряхивании при 160 оборотах в минуту. Остановить индукции путем передачи культуры охлажденной льдом суспензии водяной бане в течение 10-20 мин при 160 оборотах в минуту. Удостоверьтесь, чтобы держать клетки холодная, с этой точки только после преобразования; использование трубы и кюветы, которые были охлажденным на льду в течение по крайней мере 15 минут перед использованием.
- Разделите сulture поровну на 2 предварительно охлажденный 50 мл полипропиленовые трубы (~ 35 мл культуры в трубку) и центрифуге при 4400 мкг в течение 6 мин при 4 ° C.
- Удалите супернатант и вновь приостановить осадок клеток, осторожно инверсии в ~ 50 мл ледяной стерильной дистиллированной воды. Центрифуга клетки снова при 4400 мкг в течение 6 мин при 4 ° C. Удалите супернатант и вновь приостановить каждого осадок клеток в 20 мл ледяной стерильным 10% глицерина и центрифугируют, как описано выше.
- Слейте супернатант и вновь приостановить осадок клеток в 500 мкл ледяного 10% глицерина. Алиготе подготовленных компетентных клеток в 50 мкл объема в отдельных, предварительно охлажденный 1,5 мл микро-пробирок для непосредственного преобразования. Эти клетки могут быть заморожены на сухом льду или в жидком азоте и хранили при -80 ° C в течение 3 месяцев. Тем не менее, эффективность трансформации является самым высоким с свежеприготовленный компетентных клеток.
- Преобразование
- Добавить 100 нг очищенного продукта ПЦРшагу 1.3.1 компетентных клеток. Флик трубы и подвески позволяют сидеть на льду в течение 5 мин.
- Передача подвески ледяной компетентных клеток и ДНК предварительно охлажденные электропорации кюветы. Electroporate смесь клеток с 2,5 кВ, 25 мкФ, 200 Ом установкой в 2 мм зазор кювет (т.е. при использовании различных кювет, см. инструкции производителя для электропорации настройках), и сразу же добавляют 1 мл номера средней температуры SOC. Передача электропорации клеток в среде SOC в 15 мл трубки культуры и инкубировать при 32 ° С в течение 1 часа с орбитальной встряхивании при 220 оборотах в минуту.
- После инкубации клеток центрифугируют при 4400 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре. Удалите примерно 850 мкл супернатанта, и вновь приостановить осадок клеток в оставшейся жидкости.
- Распространение клеток на предварительно нагретой LB пластины, содержащие 17 мкг / мл Cm, и инкубировать при 32 ° C в течение ночи. Выберите два отдельных колоний трансформантов и подряд на LB-Cm пластин для мутантов подтверждение. Мы рекомендуем избегать крупных трансформированных колоний, с тем чтобы уменьшить возможность выбора штаммов с редкими супрессоров мутаций. Кроме того, полоса то же трансформантов на LB-Кана, чтобы подтвердить, что штаммы не являются устойчивыми Кан.
Примечание: Поскольку Cm маркер устойчивости используется, чтобы сделать донором штаммов, мы не ожидаем, что донор мутантов, чтобы быть устойчивыми Кан. По полос трансформантов на обе LB-Кан и LB-см пластины, мы гарантируем, что донор мутация сама по себе не вызывает как-то Кан сопротивление. Если этот шаг не были выполнены и цель мутации влияют на способность напрягаться, чтобы выжить на Кан, двойные мутанты не будет сделано эффективно использовать eSGA, так как донор штаммов бы пережить все Выбор шага. Это просто предосторожности логическим шагом поймать неожиданного фенотипов или любые другие вопросы, которые могут помешать завершению экранов eSGA. Если этот шаг был пропущен, другие woul управленияеще бы идентифицировать неудачные экранов. Тем не менее, раннее выявление доноров, которые устойчивы к Кан позволит устранить ряд непродуктивных и ненужных шагов. Другие возможные причины деформации расти на Кан может включать, например, истек антибиотиков, а также использование неправильного продукта ПЦР или деформации для преобразования. Все эти вопросы могут быть определены и рассмотрены на ранних этапах процедуры с помощью этого элемента управления, который не обязательно, но рекомендуется для eSGA.
- Подтверждение несущественных генов удаления (шаг 1.6.1) или существенных генных мутаций гипоморфных (раздел 1.6.2)
Примечание: При подтверждении удаления гена методом ПЦР геномной ДНК из штамма дикого типа должны быть использованы в качестве контроля.- Подтверждение несущественных генов удаления
- Для подтверждения удаления гена методом ПЦР, изоляции геномной ДНК из трансформированных, предполагаемые штаммы нокаутом, выращенные в жидкой LB-Cm среду, после Производдарственной казны инструкции (Promega).
- Для подтверждения успешных recombineering, усиливать ДНК из каждого трансформанта с тремя различными наборами праймеров нокаутом подтверждение. Выполните реакции с ~ 150 нг геномной ДНК-матрицы, и подтвердить правильность размеров фрагментов, выполнив ПЦР-синтезированных продуктов в агарозном геле.
- Первый набор праймеров состоит из 20-NT фланговые праймер, расположенный в 200 б.п. выше по течению от целевого региона (KOCO-F), и Cm-R грунтовку, которая является дополнением к Cm последовательность кассеты. Это усиление будет производить 445 NT ампликона в мутанта, но не в штамма дикого типа (рис. 1).
- Вторая группа включает в себя прямой праймер (Cm-F), отжиг в Cm последовательность кассеты, и в 20-NT обратном фланговые подтверждения праймера (KOCO-R), которая предназначена для отжига 200 б.п. ниже по течению от 3 'конца удален ген. Это усиление реакции будет производить 309 NT ампликона в мутанта, но нет в штамма дикого типа (рис. 1).
- Третий PCR содержит KOCO-F и KOCO-R праймеров. Эта реакция требует, чтобы подтвердить, что выбранный штамм не merodiploid, с одной локуса гена на этом месте кассеты и другое дублируется, но иного гена дикого типа копия еще присутствует. Это усиление от правильного удаления мутант будет производить 1,4 Кб продукта (рис. 1).
Примечание: Когда ген-мишень имеет примерно такой же длины в пар оснований, что и кассетные делеции гена, никто не заметит разницы между локусом, который был заменен кассету, и локус, которое не имеет. Для окончательного подтверждения в таких случаях, мы рекомендуем использовать дополнительные праймеры для амплификации ДНК сегмента в рамках удален ген. В этом случае, если ген был удален, усиление продукт будет наблюдаться только в штамма дикого типа управления, а не в мутантов. Эти праймерыможет быть вручную или вычислительно разработана специально для амплификации сегмента ДНК в удаленные области. Мы обычно усиливают 140 б.п. регионов.
- Подтверждение существенных генных мутаций гипоморфных
- Для подтверждения гипоморфных мутаций методом ПЦР, используя ген-специфического 20-NT вперед (KOCO-F) и обратного праймеров (KOCO-R) расположен в 200 б.п. вверх и вниз, соответственно, SPA-теги месте установки (рис. 2).
Примечание: Этот шаг усиления используется в качестве контроля для обеспечения отсутствия немаркированные копии целевой существенных генов. Когда только с тегами версии присутствует, одна полоса 310 б.п. больше SPA-Cm ампликона не наблюдается. 400 б.п. продукт будет означать присутствие немаркированные версии гена. - Параллельно с подтверждением ПЦР, используя Вестерн-блоттинга для проверки в рамке вставки SPA-тегов с помощью анти-FLAG M2 антитела, специфичные к FLAG-эпитопов SPA-теги 21.
- Для подтверждения гипоморфных мутаций методом ПЦР, используя ген-специфического 20-NT вперед (KOCO-F) и обратного праймеров (KOCO-R) расположен в 200 б.п. вверх и вниз, соответственно, SPA-теги месте установки (рис. 2).
- Подтверждение несущественных генов удаления
- Хранение подтвердил донора штамма
- Переезд в течение ночи культуры подтвердили рекомбинантного доноров мутантного штамма с меченым криопробирки, дополнять с глицерином до 15% конечной концентрации, и хорошо перемешать. Для длительного хранения, держать криопробирки при температуре -80 ° C.
2. Выстроив E. палочка F-получателей Мутанты для экранов eSGA
- Реплика-контактный E. палочки Keio одного несущественного удаления гена мутанта коллекцию порожденных Мори и соавт. (3968 штаммы 11, F-BW25113; может быть получена из открытых Biosystems) робота до двадцати четырех 384-луночные планшеты, содержащие 80 мкл жидкой среды LB на ячейку , с добавлением 50 мкг / мл Кана
Примечание: Для систематической оценки ГИС с существенным генов, получатель Keio коллекции 11 может быть дополнен F-Кан-отмечены существенные гена hypomorphIC мутантных штаммов с С-концевыми SPA-теги 22, 23. - Чтобы освободить место для деформации пограничного контроля, который будет выступать в качестве положительного контроля, помощь в пределах и между пластиной нормализации, а также в автоматизированных квантований колонии, удалить прививку средств массовой информации из внешнего скважин каждой пластины из приведенных выше шага и передачи новые пластины, снова оставляя внешний скважин пустым.
Примечание: деформации пограничного контроля JW5028 из коллекции Keio 11, удален за небольшую псевдо генов, которые не должны, и не в наших целого генома экранов, обладают солдат с любой доноров. Таким образом, это хороший положительный штамм контроля для выявления редких случаях, когда сопряжение, закрепление, или выборы не удалось, в результате чего отсутствует или спорадический рост штамма границы. Например, если границы колоний контроля не расти после двойной мутант выбора, запрос штамм не может быть способно сопряжения, сопряжение, возможно, были попытки яН.А. условии, что помешало ему происходит (например, с антибиотиками содержащих пластины), или неправильный антибиотик может быть добавлен к выбору пластины. Аналогично, если очень мало, спорадические колониях наблюдается на всей пластине, в том числе границы, сопряжения или пиннинг, возможно, не удалось, и на экране должна быть повторена. Если это спорадические роста границу воспроизводимых, это может указывать последовательно бедных доноров сопряжения и, следовательно, случаи, когда двойные мутанты не наблюдается, возможно, за счет сопряжения недостаточности, не правда ГУ. Такие экраны должны быть исключены из дальнейшего анализа. Более того, присутствует на всех пластин, деформации пограничного контроля позволяет программное обеспечение колонии квантования для автоматического определения колонии позиции на двойной мутант пластины и тем самым колонии позиции не должны быть разграничены вручную. Наконец, пограничный контроль деформации помогает в нормализации размеров в колонии (например, различные строк в табличке) и betwEEN (например, различные плиты получателя возлагали с того же донора в разное время) пластин. - Кроме того, создание отрицательного пятна контроля путем удаления любых двух штаммов из другого места в каждой пластины (не границы) и передать штаммов к новой пластинки. Заполните эти пустые скважины с LB среде, содержащей 17 мкг / мл Ст. Эти негативные пятна контроля как ожидается, будут пустыми в стране-получателе и, следовательно, двойной мутант пластин и помочь гарантировать, что не было никакой обработки или ошибки при обработке пластин нумерации, изображений или закрепления пластины.
Примечание: Эти пустые места требуется отрицательного контроля. Отрицательные контроли помочь выявить случаи, когда выбора не удается - при отрицательных штаммов контроля расти во время отбора. Мы предлагаем не только выбрать уникальные отрицательные пятна контроля для каждого из получателей плит, а также выбрать отрицательные пятна контроля в пределах одного квадранта пластины (например, справа внизу). Таким образом, картинаотрицательных пятна контроля будут выявлены возможные пластины неправильной ошибки (например, плиты или быть ошибочно возлагаются вверх дном, где верхний левый колонии закреплен в правом нижнем положении). - Инокуляции штаммом Keio JW5028 11, с псевдогена удаления, в 500 мл колбу с 200 мл LB, содержащей 50 мкг / мл Кан Основываясь на нашем целого генома экранов eSGA, рост данного мутанта является самым близким к диким Тип BW25113 и, таким образом, использоваться в качестве пограничного контроля.
- Расти упорядоченной штаммов, а также JW5028 культуры в течение ночи при 32 ° C с 190 оборотов в минуту орбитальное вращение в ОП ~ 0,4 - 0,6 при 600 нм. После ночного роста, заполните границу скважин с примерно 80 мкл JW5028 ночной культуры.
- Собравшиеся пластины могут быть использованы в шаге 3.2. Кроме того, для длительного хранения, а дополняют друг у реципиента пластин с 15% глицерина, смешать средств массовой информации и глицерин, и держать пластиныпри -80 ° C.
3. Высокая плотность деформации спаривания процедуре создания E. палочки двойные мутанты
- Рост штамма Hfr доноров, принимая запрос мутации, отмеченные Cm, в течение ночи при 32 ° C в богатых LB-Cm жидкой среде (17 мкг / мл см) при встряхивании при 220 оборотах в минуту.
- Pin приказал получателя мутантов коллекции в 384-колонии плотности на твердые пластины LB, дополненной 50 мкг / мл Кан параллельно, контактный доноров запрос мутантного штамма в 384-колонии плотности на такое же количество LB пластины с добавлением 17 мкг / мл Ст. Инкубируйте пластины в течение ночи при 32 ° C.
Примечание: получатель пластины используются для фиксации может потребоваться до 36 часов для получения достаточно больших колоний для последующих шагов. Когда средний размер колонии границы составляет около 2 мм в диаметре (или больше), плиты готовы быть закреплены. - Для сопряженных штаммов, контактный донора от 384-колонии ночь пластины доноров пов твердой пластины LB. Впоследствии контакту одного 384-колонии получателя пластины на свеже-доноров возлагали на сопряжении пластины. Продолжайте, пока все возлагают донор-реципиент пластины были сопряжены закрепления на твердые плиты сопряжения LB. Инкубируйте возлагали сопряжения плит при 32 ° С в течение 16 до 24 часов.
Примечание: Индивидуальные одного мутантных штаммов-доноров может показать гена в геном изменчивости в брачный эффективность из-за возможных последствий мутаций на сопряжение, перенос ДНК эффективности и пригодности. Рост может быть остановлен в любое время между 16 и 24 часами, когда достаточно большие колонии были получены для последующего закрепления шаги. Сопряжения продолжительностью от 16 до 24 часов производят достаточного количества экс-conjugants для воспроизводимых результатов eSGA даже для мутантов конце передачи генов или мутанты с несколько более низким фитнеса. - Pin каждый 384-плотность сопряжения плиты на одной сплошной пластины LB, содержащей см (17 мкг / мл) и Кан (50мкг / мл), пока все сопряжения плит были закреплены. Инкубируйте свежих возлагали первые пластинки выбор для 16-36 часов при 32 ° C.
Примечание: В отношении выбора шагов, разное количество времени может быть необходимо для различных экранов донора. Поскольку все двойные мутанты в данном экрана имеют одинаковые мутации доноров, в среднем, медленно растущие мутантные донора приводит к медленно растущим двойных мутантов. Таким образом, в зависимости от донора фитнес, выбор шага может потребовать между 16 и 36 час. Двойной мутант рост может быть остановлен, когда двойные мутанты являются достаточно большими для последующей стадии закрепления либо после первого выбора или изображений после второго. Это обычно переводится пограничного контроля колоний в среднем по крайней мере, 2 мм диаметром. - Re-полюсный каждая первая пластинка выбор на второй, дважды наркотиков (Cm и Кан), выбор пластинки в 1536-колонии формате, так что каждая первая колония выбор представлены четыре колонии наВторая пластинка выбор. Инкубируйте пластины для 16-36 часов при 32 ° C. Сфотографируйте окончательный двойной мутант пластин выбор количественно измерить рост фитнес-мутанта и анализ взаимодействий между парами генов (рис. 3).
Примечание: Несмотря на частоте merodiploidy (частичное дублирование хромосомные) является низким, около 1/1, 000 ячеек 24, merodiploidy может маскировать GI. Таким образом, мы рекомендуем в том числе биологических повторяет на всех экранах eSGA. К счастью, коммерческие одноразовые тарелки и пластиковые закрепления прокладки можно использовать повторно до трех раз по стерилизации материала следующим образом: Агар из пластин отбрасывается и плиты, а также прокладки стерилизуют путем замачивания их в 10% отбеливателя в течение ночи, а затем промыть дистиллированной воды, стиральные в 70% этанола и воздушной сушки пластиковой посуды в потоке капот под ультрафиолетовым светом. Стерильные прокладки и пластины хранятся в герметичных стерильных пластиковых пакетах до использования.
4. Обработка данных и получение GI результаты
- Измерьте колоний на каждой пластине в пакетном режиме или индивидуально с помощью специализированного ПО для обработки изображений колонии 3, 9.
Примечание: подходящий Java-основе высокой пропускной способностью визуализации колонии и забил приложение теперь свободно доступен для публичного доступа ( http://srcollins77.users.sourceforge.net/ ). Программное обеспечение работает на различных платформах (например, Mac или ПК) и может быть запущен либо как исполняемый файл или в окне терминала. - Нормализация сырья измерения размера колонии, исправляя для систематических погрешностей внутри и между пластинами, такие как пластины краевые эффекты, в том пластины эффекты изменения, неравномерное освещение изображения, артефакты из-за физических кривизны поверхности агара, конкуренции последствия для соседних колоний и возможного закрепления дефектов , а также различия в росте время
- Колонии в край строки и столбцы имеют тенденцию быть больше из-за снижения конкуренции за питательные вещества, чем находится в центре пластины. Таким образом, для коррекции этого эффекта, масштабировать размер края колоний быть таким, чтобы средний размер в этой строке или столбце равна среднему размеру колоний в центре пластины.
- Анализ результатов статистически учитывать воспроизводимость и стандартные отклонения от среднего размера повторных измерений колонии. По крайней мере, три независимые биологические эксперименты повторных необходимые для оценки экспериментальной воспроизводимости.
- Наконец, используйте нормированный средний размер роста колонии фитнес для получения оценки GI (S) для каждого гена пары по следующей формуле:
N 1 "SRC =" / files/ftp_upload/4056/4056eq1.jpg "/>
Где, S переменная = (VAR Exp х (п Опыт -1) + вар Cont х (п Cont -1)) / (N + N Exp Cont -2); VAR Exp = максимальное отклонение нормированных размеров колонии двойной мутант; VAR Cont = средний дисперсий в нормализованном двойной мутант размеров колонии от эталонного набора, п = Exp число измерений двойного мутанта размеров колонии, п = Cont среднее число экспериментальных повторяет по всем экспериментам; μ Exp = средний размер нормированного колонии двойные мутанты, и μ = Cont средний нормированных размеров колонию для всех двойных мутантов, вытекающих из одного донора мутантного штамма. S-оценка отражает как статистические доверия предполагаемого взаимодействия digenic, а также биологические силы взаимодействия. Сильная положительная S-оценки указывают облегчения эффектов, сuggesting, что взаимодействующие гены участвуют в том же пути 9, в то время как значительное негативное S-оценки отражают синтетическую болезни или летальности, которые часто указывают на членство в параллельном избыточных путей 9. Для определения путей на уровне функциональных связей, один S-оценка для каждой пары генов испытания производится из окончательного набора данных.
Примечание: В нашем предыдущем исследовании 9, мы обнаружили, что рекомбинация как правило, происходят реже, между генами в течение 30 кб друг от друга. Таким образом, для последующего анализа, после нормализации и оценка поколения, мы удаляем взаимодействий между генами в течение 30 кб друг от друга. В дополнение к ГУ себя, функциональных связей между парами генов могут быть исследованы, глядя на то, как похожи GI профилей из двух генов. GI профиль ген множество всех взаимодействий, что ген со всеми другими генами в геноме за пределамисвязь гена области. Функционально похожие гены, как правило, имеют более высокие корреляции генетических профилей взаимодействия 12, 25. Таким образом, путем расчета коэффициентов корреляции для всех генов в экспериментальном наборе данных можно использовать eSGA для исследования функциональных взаимосвязей между генами, даже лежащие близко друг к другу на хромосоме.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы наметили поэтапное протокол для использования роботов скрининга eSGA для исследования бактериальной функции гена в пути уровне путем опроса GI. Этот подход может быть использован для изучения отдельных генов и целых биологических систем в E. палочки. Осторожно выполнения экспериментальных шаги, описанные выше, включая все необходимые элементы управления и строгого анализа и независимо проверки GI данные являются ключевыми аспектами для успеха eSGA в создании новых функциональных открытий. В дополнение к eSGA, концептуально подобный метод исследования ЖКТ в E. палочки, называемые гигантские палочки 17, могут быть использованы для освещения новых функциональных отношений, которые часто упускаются другие подходы, такие как протеомных 23 или фенотипической 13 залов в одиночку. Тем не менее, как и в любом генома подход, существуют ограничения на применимость eSGA или гигантские кишечной палочки, например, для других видов бактерий. Это отчасти бытьПричиной отсутствия генома одного гена удаления мутант штамма коллекции для большинства видов бактерий, особенно для видов, где направленного мутагенеза затруднено низкой собственной частотой гомологичной рекомбинации. В таких случаях нарушения гена использованием таких методов, как случайная отслеживаются мутагенеза на основе анализа как TnSeq 31 потенциально могут быть использованы для исследования бактериальной функции гена. Обзор новых альтернативных бактериальных генетических процедур отбора, см. обзорную статью по Гагаринова и Эмили (2012) 32.
Хотя GI методы часто показывают много интересных связей указывают на роман механистической связей, интеграции этих данных с другой информацией, такой как фенотипические профилирования 13, физических сетей взаимодействия 22, 23, и GC-вывод ассоциаций может быть особенно информативной. Например, как с Г. И. сетей, GC ассоциации, которые основаны на сохранениигенного порядка (оперона), бактериальные слияния генов, оперона частоты рекомбинации, полученные из межгенные расстояния предсказал оперонов по геномов, а также филогенетических профилей 33 может обеспечить дополнительное понимание того, как бактериальная клетка организует белковых комплексов, в функциональные пути посредника и координации основных клеточных процессов, 12, 23.
E.coli является рабочей лошадкой моделью для понимания молекулярной биологии других грам-отрицательных бактерий. Для этого eSGA GI данные могут быть использованы в сочетании с сравнительной геномики информации (например, филогенетических профилей, профилей экспрессии генов), чтобы исследовать эволюционное сохранение функциональных связей обнаружено eSGA на другие протеобактерий видов и таксонов прокариот. Кроме того, взаимодействие данных, полученных по E. палочки могут быть использованы, чтобы разобраться в архитектуре пути микробов обнаружено metagenoмикрофонов, для которых функциональный аннотации отсутствует. Поскольку многие гены широко сохраняется во всех микробов 23, и потому, что чувствительность к антибиотикам может быть повышена за счет определенных генетических возмущений 34, функциональных связей освещении eSGA может даже потенциально может быть использована для разработки инновационных лекарственной терапии комбинацией.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана за счет средств Геном Канада, Онтарио геномики Института и Канадский институт исследований в области здравоохранения грантов JG и AE AG является получателем стипендии Ванье Канаде Высшее.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| I. Antibiotics | |||
| Chloramphenicol | Bioshop | #CLR201 | |
| Kanamycin | #KAN201 | ||
| Ampicillin | # AMP201 | ||
| 2. Luria-Bertani medium | |||
| LB powder | Bioshop | #LBL405 | |
| Agar | Bioshop | #AGR003 | |
| 3. Bacterial Strains and Plasmids | |||
| Hfr Cavalli strain λred system (JL238) | Babu et al.14. | ||
| pKD3 | E. coli Genetic Stock Centre, Yale | ||
| Keio E. coli F- recipient collection | National BioResource Project (NBRP) of Japan11 | ||
| Hypomorphic E. coli F- SPA-tag strains | Open biosystems; Babu et al.14 | ||
| 4. Primers | |||
| pKD3-based desalted constant primers | F1: 5'-GGCTGACATGGGAATTAGC-3' R1: 5'-AGATTGCAGCATTACACGTCTT-3' |
||
| Desalted custom primers | Cm-R: 5'-TTATACGCAAGGCGACAAGG-3' Cm-F: 5'- GATCTTCCGTCACAGGTAGG-3' |
||
| Desalted custom primers | F2 and R2: 20 nt constant regions based on pKD3 sequence and 45 nt custom homology regions F2 constant region: 5'-CATATGAATATCCTCCTTA-3' R2 constant region: 5'-TGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3'S1 and S2: 27 nt constant regions for priming the amplification of the SPA-Cm cassette and 45 nt custom homology regions S1 constant region: 5'AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3' S2 constant region: 5'- GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT -3' KOCO-F and KOCO-C: 20 nt primers 200 bp away from the non-essential gene deletion site or the essential gene SPA-tag insertion site |
||
| 5. PCR and Electrophoresis Reagents | |||
| Taq DNA polymerase | Fermentas | # EP0281 | |
| 10X PCR buffer | Fermentas | # EP0281 | |
| 10 mM dNTPs | Fermentas | # EP0281 | |
| 25 mM MgCl2 | Fermentas | # EP0281 | |
| Agarose | Bioshop | # AGA002 | |
| Loading dye | NEB | #B7021S | |
| Ethidium bromide | Bioshop | # ETB444 | |
| 10X TBE buffer | Bioshop | # ETB444.10 | |
| Tris Base | Bioshop | # TRS001 | |
| Boric acid | Sigma | # T1503-1KG | |
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | Sigma | # B6768-500G | |
| DNA ladder | NEB | #N3232L | |
| 6. DNA isolation and Clean-up Kits | |||
| Genomic DNA isolation and purification kit | Promega | #A1120 | |
| Plasmid Midi kit | Qiagen | # 12143 | |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | #28104 | |
| 7. Equipment for PCR, Transformation and Replica-pinning | |||
| Thermal cycler | BioRad, iCycler | ||
| Agarose gel electrophoresis | BioRad | ||
| Electroporator | Bio-Rad GenePulser II | ||
| 0.2 cm electroporation cuvette | Bio-Rad | ||
| 42 °C water bath shaker | Innova 3100 | ||
| Beckman Coulter TJ-25 centrifuge | Beckman Coulter | ||
| 32 °C shaker | New Brunswick Scientific, USA | ||
| 32 °C plate incubator | Fisher Scientific | ||
| RoToR-HDA benchtop robot | Singer Instruments | ||
| 96, 384 and 1,536 pin density pads | Singer Instruments | ||
| 96 or 384 long pins | Singer Instruments | ||
| 8. Imaging Equipments | |||
| Camera stand | Kaiser | ||
| Digital camera, 10 megapixel | Any Vendor | ||
| Light boxes, Testrite 16" x 24" units | Testrite | ||
| 9. Pads or Plates Recycling | |||
| 10% bleach | Any Vendor | ||
| 70% ethanol | Any Vendor | ||
| Sterile distilled water | Any Vendor | ||
| Flow hood | Any Vendor | ||
| Ultraviolet lamp | Any Vendor | ||
| 10. Labware | |||
| 50 ml polypropylene tubes | Any Vendor | ||
| 1.5 ml micro-centrifuge tubes | Any Vendor | ||
| 250 ml conical flaks | VWR | # 29140-045 | |
| 15 ml sterile culture tubes | Thermo Scientific | # 366052 | |
| Cryogenic vials | VWR | # 479-3221 | |
| Rectangular Plates | Singer Instruments | ||
| 96-well and 384-well microtitre plates | Singer Instruments | Nunc | |
| Plate roller for sealing multi-well | Sigma | #R1275 | |
| plates | ABgene | # AB-0580 | |
| Adhesive plate seals | Fisher Scientific | # 13-990-14 | |
| -80 °C freezer | Any Vendor | ||
References
- Bandyopadhyay, S., Kelley, R., Krogan, N. J., Ideker, T. Functional maps of protein complexes from quantitative genetic interaction data. PLoS Comput. Biol. 4, e1000065 (2008).
- Costanzo, M., Baryshnikova, A., Myers, C. L., Andrews, B., Boone, C. Charting the genetic interaction map of a cell. Curr. Opin. Biotechnol. 22, 66-74 (2011).
- Costanzo, M., et al. The genetic landscape of a cell. Science. 327, 425-4231 (2010).
- Fiedler, D., et al. Functional organization of the S. cerevisiae phosphorylation network. Cell. 136, 952-963 (2009).
- Roguev, A., et al. Conservation and rewiring of functional modules revealed by an epistasis map in fission yeast. Science. 322, 405-4010 (2008).
- Schuldiner, M., et al. Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile. Cell. 123, 507-519 (2005).
- Wilmes, G. M., et al. A genetic interaction map of RNA-processing factors reveals links between Sem1/Dss1-containing complexes and mRNA export and splicing. Mol. Cell. 32, 735-746 (2008).
- Babu, M., et al. Systems-level approaches for identifying and analyzing genetic interaction networks in Escherichia coli and extensions to other prokaryotes. Mol. Biosyst. 12, 1439-1455 (2009).
- Butland, G., et al. coli synthetic genetic array analysis. Nat. Methods. 5, 789-7895 (2008).
- Typas, A., et al. Regulation of peptidoglycan synthesis by outer-membrane proteins. Cell. 143, 1097-10109 (2010).
- Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol. Syst. Biol. 2, 2006-200008 (2006).
- Babu, M., et al. Genetic interaction maps in Escherichia coli reveal functional crosstalk among cell envelope biogenesis pathways. PLoS Genet. 7, e1002377 (2011).
- Nichols, R. J., et al. Phenotypic landscape of a bacterial cell. Cell. 144, 143-156 (2011).
- Babu, M., Gagarinova, A., Greenblatt, J., Emili, A. Array-based synthetic genetic screens to map bacterial pathways and functional networks in Escherichia coli. Methods Mol Biol. 765, 125-153 (2011).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-665 (2000).
- Yu, D., et al. An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 5978-5983 (2000).
- Typas, A., et al. quantitative analyses of genetic interactions in. E. coli. Nat. Methods. 5, 781-787 (2008).
- Zeghouf, M., et al. Sequential Peptide Affinity (SPA) system for the identification of mammalian and bacterial protein complexes. J. Proteome Res. 3, 463-468 (2004).
- Davierwala, A. P., et al. , 1147-1152 (2005).
- Breslow, D. K., et al. A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome. Nat. Methods. 5, 711-718 (2008).
- Babu, M., et al. Sequential peptide affinity purification system for the systematic isolation and identification of protein complexes from Escherichia coli. Methods Mol. Biol. 564, 373-400 (2009).
- Butland, G., et al. Interaction network containing conserved and essential protein complexes in Escherichia coli. Nature. 433, 531-537 (2005).
- Hu, P., Janga, S. C., Babu, M., Diaz-Mejia, J. J., Butland, G., et al. Global functional atlas of Escherichia coli encompassing previously uncharacterized proteins. PLoS Biol. 7, (2009).
- Anderson, R. P., Roth, J. R. Tandem genetic duplications in phage and bacteria. Annu. Rev. Microbiol. 31, 473-505 (1977).
- Boone, C., Bussey, H., Andrews, B. J. Exploring genetic interactions and networks with yeast. Nat. Rev. Genet. 8, 437-449 (2007).
- Collins, S. R., et al. Functional dissection of protein complexes involved in yeast chromosome biology using a genetic interaction map. Nature. 446, 806-8010 (2007).
- Le Meur, N., Gentleman, R. Modeling synthetic lethality. Genome Biol. 9, R135 (2008).
- Tong, A. H., et al. Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants. Science. 294, 2364-2368 (2001).
- Tong, A. H., et al. Global mapping of the yeast genetic interaction network. Science. 303, 808-813 (2004).
- Wong, S. L., et al. Combining biological networks to predict genetic interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 15682-15687 (2004).
- van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nat. Methods. 6, 767-772 (2009).
- Gagarinova, A., Emili, A. Genome-scale genetic manipulation methods for exploring bacterial molecular biology. Mol. Biosyst. 8, 1626-1638 (2012).
- Dewey, C. N., et al. Positional orthology: putting genomic evolutionary relationships into context. Brief Bioinform. 12, 401-412 (2011).
- St Onge, R. P., et al. Systematic pathway analysis using high-resolution fitness profiling of combinatorial gene deletions. Nat. Genet. 39, 199-206 (2007).
