Summary
Affiniteitszuivering van gemerkte eiwitten in combinatie met massaspectrometrie (APM) is een krachtige methode voor systematische mapping van eiwit interactie netwerken en het onderzoeken van de mechanistische basis van biologische processen. Hier beschrijven we een geoptimaliseerde sequentiële peptide affiniteit (SPA) APM procedure ontwikkeld voor de bacterie
Abstract
Aangezien de meeste cellulaire processen gemedieerd worden door macromoleculaire samenstellingen, de systematische identificatie van eiwit-eiwit interacties (PPI) en de identificatie van de subunit samenstelling van multi-eiwit complexen kan inzichtelijk genfuncties en het begrip van biologische systemen 1, 2. Fysieke interacties in kaart worden gebracht met groot vertrouwen vialarge schaal isolatie en karakterisering van endogeen eiwit complexen die bijna fysiologische omstandigheden gebaseerd op affiniteitszuivering van chromosomaal gemerkte eiwitten in combinatie met massaspectrometrie (APM). Deze aanpak is succesvol toegepast in evolutionair verschillende organismen, waaronder gist, vliegen, wormen, zoogdiercellen, bacteriën en 1-6. In het bijzonder hebben wij een gegenereerd carboxy-terminale peptide Sequential Affinity (SPA) dual tagging systeem affiniteit zuiveren natieve eiwitcomplexen uit gekweekte gram-negatieve Escherichia coli, met genetically-handelbaar gastheer laboratoriumstammen die zeer geschikt is voor genoom-brede onderzoeken van de fundamentele biologie en geconserveerde processen van prokaryoten 1, 2, 7. De SPA-merksysteem is analoog aan de tandem affinity purification methode oorspronkelijk ontwikkeld voor gist 8, 9, en bestaat uit een calmoduline-bindend peptide (CBP) gevolgd door de splitsingsplaats voor de zeer specifieke tobacco etch virus (TEV) protease en drie kopieën van de FLAG-epitoop (3x FLAG), waardoor twee opeenvolgende rondes van affiniteitsverrijking. Na cassette amplificatie worden sequentiespecifieke lineaire PCR producten coderen voor de SPA-tag en een selecteerbare marker geïntegreerd en uitgedrukt in frame als carboxyterminale fusies in een DY330 achtergrond die wordt geïnduceerd om op transiënte expressie een efficiënte heterologe bacteriofaag lambda rekombinatiestelsel 10. Dual volgende stappen zuivering met calmoduline en anti-FLAG affiniteit beads kan de zeer selectieveen efficiënte invordering van zelfs lage abundantie heeft eiwitcomplexen van grootschalige culturen. Tandem massaspectrometrie wordt vervolgens gebruikt om de stabiel co-zuivering eiwitten te identificeren met hoge gevoeligheid (laag nanogram detectielimieten).
We beschrijven gedetailleerde stap-voor-stap procedures we vaak gebruikt voor systematische eiwit tagging, zuivering en massaspectrometrie-analyse van oplosbare eiwitcomplexen van E. coli, die kan worden opgeschaald en mogelijk aangepast aan andere bacteriële species, waaronder bepaalde opportunistische pathogenen die vatbaar zijn recombineering. De resulterende fysieke interacties kunnen onthullen vaak interessante onverwachte onderdelen en verbindingen suggereren nieuwe mechanistische links. Integratie van de PPI gegevens met alternatieve moleculaire vereniging gegevens, zoals genetische (gen-gen) interacties en genomische-context (GC) voorspellingen kan opheldering van de wereldwijde moleculaire organisatie van multi-eiwit complexen te vergemakkelijken binnen bische paden. De netwerken gegenereerd voor E. coli kan worden gebruikt om inzicht te krijgen in de functionele architectuur van orthologe genproducten in andere microben die functionele annotaties op dit moment ontbreekt.
Protocol
1. Bouw van Gene-specifieke SPA-tagging in E. coli DY330 Strain
- Het plasmide pJL148 omvat de SPA-tag DNA sequentie en de kanamycine resistentie marker cassette (Kan R) gebruikt als template in polymerase kettingreactie (PCR) amplificatie 7. Een 45 nt genspecifieke forward primer, onmiddellijk stroomopwaarts van het doelgen stopcodon in frame met een 27 bp (5'-AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG 3 ') tag specifieke forward primer en een 45 nt genspecifieke reverse primer, die zich onmiddellijk stroomafwaarts van het doelgen stopcodon in frame met een 27 bp (5'-GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT 3 ') tag specifieke reverse primer, worden gebruikt om de SPA-tag en Kan R cassette uit de pJL148 de volgende PCR fietsomstandigheden amplificeren: 94 ° C gedurende 5 min, 30 cycli van 94 ° C gedurende 1 min, 55 ° C gedurende 1 min, 68 ° C gedurende 2 min 10 sec, gevolgd door 68 ° C gedurende 10 minuten. Deze geamplificeerde sequenties dienen eens substraten voor het ectopisch geïntroduceerd λ-Red homologe recombinatie machines (zie hieronder).
- Het PCR product wordt gezuiverd met een Qiaquick PCR zuiveringssamenstel om zouten die kunnen interfereren met de elektroporatie verwijderen. Het gezuiverde PCR product wordt vervolgens gericht integreren op het 3'-uiteinde (vlak boven de natieve stopcodon) van een specifiek gen in DY330 stam waarin het λ-Red recombinatie machines wordt uitgedrukt 10.
- De DY330 λ-expressie Red stam 's nachts gekweekt in 2 ml Luria-Bertani (LB) medium bij 32 ° C met schudden bij 180 rpm. 1 ml van de overnacht kweek wordt vervolgens geïnoculeerd in 70 ml vers LB medium in 500 ml erlenmeyer. Het inoculum wordt gekweekt bij 32 ° C met schudden bij 180 rpm tot de OD600 bereikt ~ 0.8.
- De kweek wordt overgebracht in een verse erlenmeyer van 250 ml, waarbij de cellen worden geïnduceerd door het incuberen van de kolf in een waterbad bij 42 ° C onder voorzichtig schudden bij180 rpm gedurende 15 minuten. Onmiddellijk na de inductie wordt de kolf geïncubeerd in een ijswater bad slurry gedurende ten minste 30 min met schudden.
- De ijskoude cultuur direct overgebracht in voorgekoeld 50 ml polypropyleen buis en gecentrifugeerd bij 3993 g gedurende 6 min bij 4 ° C. De celpellet wordt geresuspendeerd in 50 ml ijskoud steriel water en gecentrifugeerd wederom op 3993 g gedurende 6 min bij 4 ° C. De cel pellet wordt vervolgens geresuspendeerd in 1 ml koud water en overgebracht naar een 1,5 ml Effendorf buis en gecentrifugeerd bij maximale snelheid gedurende 20 seconden bij 4 ° C. Na twee of drie wasstappen met ijskoud water, wordt de celpellet uiteindelijk geresuspendeerd in 700 ul ijskoud steriel water, waardoor electro-competente cellen.
- Door elektroporatie wordt een ui van de gezuiverde amplicon ingebracht in 40 pi van het elektro-competente cellen. De cellen worden geëlektroporeerd in een Bio-Rad GenePulser II met de volgende instellingen: 2,5 kV, 25 uF met pulsecontroller van 200 Ω. Na homologe recombinatie en integratie, worden de transformanten die met succes gerecombineerd de tag / cassette in het chromosoom geselecteerd op resistentie tegen Kan (Figuur 1A). Meerdere transformanten worden geselecteerd voor Western blotting de juiste generatie (ie positief signaal) van SPA-gelabeld fusie-eiwitten met anti-FLAG M2 antilichaam dat selectief tegen het FLAG epitopen van het SPA-tag te verifiëren.
- Bevestigd carboxyterminale SPA-tag fusie stam gekweekt op grote schaal oplosbare eiwitcomplexen isoleren van geoogste cellen met de SPA zuiveringsprotocol. De omtrek van de stappen van de affiniteitsmerker zuiveringswerkwijze wordt in figuur 1B.
2. Het kweken en Sonicatie
- Enten 100 ul van een SPA-gelabeld E. coli glycerolvoorraad in 50 ml Terrific Broth (TB) vloeibaar medium aangevuld met 50 ul van 25 ug / ml of Kan oplossing in een erlenmeyer van 250 ml. 'S nachts groeien de cultuur bij 32 ° C.
Opmerking: Omdat de temperatuur-induceerbare λ Red cassette in stam DY330 onder controle van een temperatuurgevoelige repressor 10 is de SPA-gelabelde E. coli stam gekweekt bij 32 ° C. - Breng 10 ml van de overnacht kweek in 990 ml vers TB aangevuld met 25 ug / ml Kan in een 4 liter kolf. De cultuur wordt gekweekt bij 32 ° C onder constant schudden bij 250 rpm, 5 tot 6 uur, totdat de OD 600 reikt tot ~ 2 tot 3.
- Breng de 1 liter E. coli SPA-tag cultuur centrifugatie flessen reinigen en de cellen draaien bij 4 ° C in Beckman J6 HC-centrifuge @ 3993 xg gedurende 15 minuten.
- Het supernatant wordt uit de centrifugatie flessen. Resuspendeer de E. coli cel pellets met 25 ml sonicatiebuffer. Zorg ervoor dat u de centrifugeren flessen op ijs te houden te allen tijde.
- De geresuspendeerde pellet isovergebracht naar 50 ml Falcon tube polypropyleen en bevroren met vloeibare stikstof. De bevroren cellen worden opgeslagen bij -80 ° C voor langdurig gebruik.
- Voorafgaand aan sonicatie, volledig ontdooien van de bevroren cellen door hem de pellets op ijs. Het ontdooide monsters worden overgebracht naar een steriele roestvrij stalen beker geplaatst op ijs sonicatie. De sonde is ondergedompeld in het monster en gesonificeerd gedurende 3 minuten. Nog 2 min mag het monster koelen van oververhitting.
- De gesoniceerde cellysaat overgebracht in de voorgekoeld steriele centrifugebuis en gecentrifugeerd bij 4 ° C in Beckman centrifuge met een JA-17 rotor @ 35.267 xg (16.000 rpm) gedurende 15 minuten tweemaal.
Opmerking: Bij membraan eiwitzuivering de gesoniceerde cellysaat slechts eenmaal gecentrifugeerd gedurende 15 min omdat we niet weten welk deel de membraaneiwitten zijn, dat is, in de pellet of in de supernatantfractie. Dus om overmatig verlies van mem te voorkomenbraan eiwitten spinnen we de cellen gedurende 15 minuten bij hoge snelheid te centrifugeren en de supernatant wordt vervolgens verwerkt voor zuivering (zie stappen) waarbij 1% detergent wordt gebruikt om het membraan eiwitten oplosbaar. - Het supernatans van de centrifugebuis zorgvuldig overgebracht naar een 50 ml polypropyleen Falcon buis en bevroren met vloeibare stikstof. De gesoniceerde bevroren celextract wordt opgeslagen voor een periode van maximaal 6 maanden bij -80 ° C voor toekomstig gebruik.
3. Affiniteitszuivering
- Voor gebruik wordt 100 ui anti-flag M2 beads gewassen met 10 volumes van AFC buffer (30 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1% detergent en 0,1-0,5 mm TCEP [tris (2-carboxyethyl) fosfine - zoutzuur]) zonder het wasmiddel en het reductiemiddel TCEP (tris (2-carboxyethyl) fosfine).
- De bevroren, gesonificeerd celextract wordt ontdooid door het plaatsen van de buis in koud water. Het ontdooide celextract geïncubeerd met 3 pl benzonase nuclease gedurende 30 min bij 4 ° C. Aan dit mengsel voegt niet-ionische detergens Triton X-100 (eindconcentratie van het wasmiddel moet 0,1%) en 200 ul suspensies van anti-flag M2 agarosekorrels.
Opmerking: Alle oplosbare proteïne zuiveringen, 0,1% Triton X-100 wordt gebruikt om niet-specifieke adsorptie te minimaliseren waar als voor zuiveren van een membraaneiwit verschillende mild niet-ionische detergenten, zoals C12E8 (Octaethylene glycol dodecyl ether), DDM ( n-Dodecyl β-D-maltoside) en maltose-neopentylglycol (MNG) kan worden gebruikt op een 1% detergens concentratie oplosbaar verbeteren. Aangezien verschillende detergentia hebben verschillende oplosbaar efficiëntie van membraaneiwitten, wordt aanbevolen onafhankelijke eiwit reinigingen die meer dan een wasmiddel voeren. - De inhoud wordt voorzichtig gemengd door draaiing van de buis gedurende 3 uur bij 4 ° C met een LabQuake shaker. Na 3 uur rotatie wordt de buis gecentrifugeerd bij 1700 xg gedurende 6 minuten. De supernatant wordt vervolgens rzorgvuldig emoved, zoveel mogelijk, zonder de losse hiel pellet.
- De pellet wordt geresuspendeerd in de resterende supernatant en vervolgens overgebracht naar een 0,8 x 4 cm Bio-Rad polypropyleen prep kolom. Zorgen voor de bodemuitlaat stekkers van de kolom te verwijderen, zodat de eluaten uitlekken door zwaartekracht. Was de kolom 5 maal met TEV decollete stap.
- Na het aftappen van de gewassen eluaten is de bodem uitgang van de kolom gesloten. Om dezelfde kolom wordt splitsing uitgevoerd door toevoeging ~ 5 10 pi (50 eenheden) TEV protease en 400 ul 1X AFC buffer op de kolom. Verzekeren naar de top van de kolom af te sluiten met een kap. De kolom met de kralen worden zachtjes geroteerd overnacht bij 4 ° C gedurende de nacht met een LabQuake shaker.
- Verwijder de dop op de bovenkant en de uitlaat plug op de bodem van de kolom en laat de eluaten teruggewonnen na TEV splitsing in een verse kolom met 200 ul suspensies van calmoduline-sepharose kralen, dat wordt gewassen met 10volumes van calmoduline bindende buffer.
- Zowel de bovenkant en de onderkant van de kolom stevig vastgemaakt, en de inhoud in de kolom worden voorzichtig gemengd door roteren gedurende 3 uur bij 4 ° C met een LabQuake shaker.
- Na 3 uur rotatie, wordt het eluaat afgetapt door de dop en de bodemplug van de kolom. De kolom wordt viermaal gewassen met 200 ul 1X calmoduline bindingsbuffer gevolgd door een stringent wassen met 400 ul wasbuffer calmodulin.
- Het gebonden eiwit wordt geëlueerd in vier fracties van 50 ul in een nieuwe Eppendorf buis met 1X calmodulin elutiebuffer. De geëlueerde fractie wordt verdeeld in twee schone Eppendorf buizen in gelijke volumes. Beide buizen worden vervolgens gedroogd met een speed vacuüm.
- De gedroogde eluaat van een buis wordt gebruikt voor het uitvoeren van een zilverkleuring gel, terwijl de andere staat op -80 ° C, vóór gebruik van massaspectrometrie.
4. Zilverkleuring
- Voor zilver staining, is het halve volume 3X SDS (natriumdodecylsulfaat) monsterbuffer toegevoegd aan 50 ul van de gedroogde eluaat. Na het koken het mengsel gedurende 5 minuten worden de monsters geladen op een SDS polyacrylamide gel.
- Nadat de gel is voltooid, wordt het zorgvuldig geplaatst in fixeeroplossing (50% methanol en 10% azijnzuur) en voorzichtig geschud op een roterende schudinrichting gedurende 20 minuten. De gel wordt vervolgens gespoeld in 20% ethanol gedurende 10 minuten.
- De vaste gel tweemaal grondig gewassen met 500 ml dubbel gedestilleerd water gedurende 10 min om laag uniform achtergrondniveaus.
- De gel wordt vervolgens voorzichtig geroerd in 500 ml natrium-thiosulfaat gedurende 1 min, gevolgd door twee wasstappen met gedestilleerd water gedurende 20 sec.
- Het water wordt verwijderd en de gel geïncubeerd in 200 ml 0,1% zilvernitraat gedurende 30 minuten. Na die tijd wordt de zilvernitraat verwijderd en de gel wordt gewassen met gedestilleerd water gedurende 20 seconden om de overmaat zilvernitraat te verwijderen.
- De gel wordt tenslotte met de hand geroerd in 75 mlvan de ontwikkeloplossing. Wanneer de gewenste intensiteit is bereikt, wordt de ontwikkeloplossing verwijderd en 80 ml azijnzuur toegevoegd om de reactie te stoppen. Zorgen voor de gel in azijnzuur incuberen gedurende ten minste 20 minuten voor een goede visualisatie van gel bands.
5. Proteolyse en Monstervoorbereiding voor Massaspectrometrie
- Het gedroogde monster, voeg 50 ul van de digestiebuffer en 0,9 pi van 100 mM TCEP-HCl (tris (2-carboxyethyl) fosfine - zoutzuur) en incubeer het mengsel gedurende 45 min bij kamertemperatuur de reductiestap. Vervolgens wordt 1 pi 500 mM iodoacetamide toegevoegd en geïncubeerd in het donker nog 40 min om voor monster alkylering.
- Na de tweede ronde van incubatie, voeg 1 ug geïmmobiliseerd trypsine aan het mengsel en incubeer ofwel bij 37 ° C gedurende 5 uur of overnacht bij kamertemperatuur. Zorgen de reactie te stoppen door 1 pi azijnzuur.
- Pre-nat de Millipore Zip-Tip pipetpunt door opzuigen 10 pi van de bevochtiging en equilibratie oplossing. Breng de oplossing voor afval. Vervolgens zuigen 10 ul van de wasoplossing en afzien van de oplossing te verspillen. Herhaal deze stap tweemaal.
- Voor efficiënte binding van het peptide mengsel aan de tip, pipet mengen peptidemengsel 20 keer. Het peptide mengsel dat gehandeld op grond van de tip wordt weggespoeld door opzuigen en doseren van de wasoplossing. Tweemaal Herhaal deze procedure voor efficiënte binding van het peptide mengsel aan de tip.
- Met de punt met het gebonden peptide, zuig 10 ul van de bevochtiging en equilibratie oplossing en afvullen in een schone Eppendorf buis. Herhaal deze stap twee keer. Na drogen van de geëlueerde monsters in snelheid vacuum kunnen de monsters worden onmiddellijk geanalyseerd met massaspectrometrie of bewaard bij -80 ° C voor gebruik.
6. Eiwit Identificatie door LTQ Orbitrap Velos Massa Spectrometer
The polypeptidecomponenten van de geïsoleerde complexen worden geïdentificeerd met een LTQ Orbitrap Velos hybride tandem massaspectrometer. De Orbitrap heeft uitzonderlijke oplossend vermogen (> 60.000 volledige breedte half maximum, of FWHM) en massa nauwkeurigheid (<2 ppm) dat MS / MS bemonstering van irrelevante niet-specifieke achtergrond verontreinigingen gedetecteerd in controle zuiveringen minimaliseert, terwijl de hoge snelheid Velos ionenval component kan detecteren en fragment lage abundantie peptiden met behulp van zowel elektronen overdracht dissociatie en botsing geïnduceerde dissociatie modi. Veel vertrouwen wedstrijden onder gevolg MS / MS spectra worden toegewezen aan referentie E. coli eiwit sequenties met behulp van database-zoekalgoritme zoals Sequest en elke overeenkomende volgorde geëvalueerd tijdens een waarschijnlijkheid algoritme als STATQUEST 11. Het totale aantal spectra, peptidesequentie uniciteit en gemeenschappelijke achtergrond verontreinigingen gedetecteerd in negatieve controle (dwz. Mock) zuiveringen worden beschouwd als een lage empirisch vals-display te bereikenking, tarief. De volgende stappen worden uitgevoerd voor eiwit identificatie:
- De micro-kolommen gepakt met ~ 10 cm van 3 urn Luna-C18 hars en zijn verbonden met een Proxeon Nanoelectrospray ionenbron die wordt geplaatst in overeenstemming met de Orbitrap instrument.
- Een Proxeon nano stroom binaire HPLC pomp wordt gebruikt om een stabiele tip debiet van ~ 300 nl min -1 geleverd gedurende het peptide scheidingen.
- Om peptide elutie te bereiken, is een organische buffer gradiënt opgezet volgens de steekproef complexiteit. Bijvoorbeeld, de volgende gradiënt doorgaans ingesteld voor E. coli SPA monsters: solvent B wordt verhoogd van 2% tot 6% in 1 min, tot 24% in 38 min, tot 100% in komende 4 min, 100% gehouden gedurende 1 min, vervolgens wordt verlaagd tot 2% in 1 min, en laatste houden op 2% gedurende 15 minuten. De mobiele fase oplosmiddel A heeft 95% HPLC gradiënt water en 5% ACN met 0,1% mierenzuur, terwijl oplosmiddel B over 5% gradiënt HPLC water en 95% ACN met 0,1% mierenzuur acid. Het debiet bij punt van de naald is ingesteld op 300 nl min -1 gedurende 60 minuten.
- Zoals de massaspectrometer cycli doorlopen een volledige massa scan op 60.000 resoluties, worden 10 gelijktijdige tandem fragmentatie massa scans verzameld voor de meest intense precursorionen. Dynamische uitsluiting, mono-isotopische massa selectie, en real-time data-afhankelijke acquisitie instrument zijn ingeschakeld.
- De spectra worden doorzocht met een database zoekalgoritme zoals Sequest met een database van E. coli eiwitsequenties en het resultaat statistisch gefilterd met een waarschijnlijkheid algoritme zoals STAQUEST 11 een lage valse ontdekking te garanderen. Alleen hoge betrouwbaarheid (99% kans) kandidaten worden geselecteerd, terwijl wedstrijden die meer dan 10 ppm massa fout ten opzichte van de theoretische peptide massa worden niet verder onderzocht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een belangrijk aspect van de SPA-gebaseerde APM's beschreven aanpak is dat tagging wordt uitgevoerd binnen de natuurlijke chromosomale context, waardoor waarborging van de normale genregulatie wordt gehandhaafd (dwz. Inheemse aas promotor bewaard gebleven, vandaar expressie niveaus niet wordt verstoord) en native stabiel-geassocieerde eiwitcomplexen worden teruggewonnen op bijna endogene niveaus. Operon polariteit problemen zijn ook voorkomen door een buitenwaarts gerichte promoter in de selecteerbare marker. Deze SPA-tagging benadering is effectief genoeg om de componenten van lage abundantie tot bijna homogeniteit complexen, waaronder membraangeassocieerde samenstellingen, zuiveren zelfs wanneer de subeenheden zijn uitgedrukt tot slechts een paar moleculen per bacteriële cel. Overall, dit protocol gemakkelijk opgeschaald worden voor het zuiveren van grote sets van gelabelde oplosbare eiwitten in E. coli of in principe elke andere bacteriële soorten waarvoor tagging via recombineering mogelijk is, of degenen die door de natuur zijn hoge transformatietie vermogen, zoals Acinetobacter, een opkomende werkpaard van bacteriële genetica, dat gebruikt is bijvoorbeeld een stam bibliotheek van gerichte gen knockouts 13 bouwen.
Een grote zorg die inherent zijn aan grootschalige proteomische benadering is de identificatie van promiscue niet-specifieke interactoren en valse sporen van verontreiniging. Ondanks twee ronden van verrijking, onze routine SPA zuiveringen regelmatig detecteren frequent verontreinigingen die gewoonlijk hoge overvloed housekeeping eiwitten, zoals ribosomale eiwitten en chaperones, die niet-specifiek aan het chromatografische hars en / of aas eiwitten. Dit probleem kan worden beperkt op twee manieren. Eerst wordt het totale aantal spectrale en uniekheid van elk eiwit geïdentificeerd met een bepaald aas beschouwd ten opzichte van een groter aantal zuiveringen van meerdere onafhankelijke eiwitlokaas en van ongemerkte (ie. Wild type) negatieve controle stammen (dwz. Mock affiniteitszuivering experiments) om valse positieve associaties te minimaliseren. Ten tweede moet alle kandidaat eiwitinteracties worden gevalideerd met wederzijdse tagging en zuivering van het vermoedelijke bindingspartner, met het doel onafhankelijk bevestiging individuele eiwit-eiwit interacties zeldzame gevallen waarin de aanwezigheid van de SPA-tag opname van natieve eiwitten verstoort voorkomen in het endogene eiwit samenstel.
APM-based proteomics onderzoeken worden beperkt door het gebrek aan gevoeligheid in termen van het identificeren voorbijgaande of sub-stoichiometrische interacties. In dat geval kan een fase zuivering procedures worden gebruikt om detectie van zwakkere interactiepartners verbeteren. In de loop van onze voortdurende, tien jaar lange studie van de E. coli interactoom, hebben we gezien de detectie mogelijkheden van de nieuwe generatie massaspectrometers gestaag te verbeteren. Oudere instrumentatie is partijdig terugkerende identificatie van zeer overvloedige proteïnen, vaak verzet tegen de detectie van minder abundant maar potentieel zeer belangrijke interacterende eiwitten. Omgekeerd is de Orbitrap Velos hybride massaspectrometer die we momenteel gebruiken is sterk verbeterd oplossend, nauwkeurigheid van massa's, en de gevoeligheid waardoor veel efficiënter, high throughput detectie van lage abundantie heeft eiwitten, met inbegrip van voorbijgaande interacties. Ten slotte, als de aard van de interactie is volledig onbekend raden wij onderzoekers om: (i) van toepassing strenge criteria om het vertrouwen scores toe te kennen aan alle mogelijke database wedstrijden. Eiwitten met twee of meer unieke peptiden worden meestal als positief beschouwd, in de veronderstelling elke wedstrijd gaat met een minimale kans op drempel cut-off van 99% of hoger kans, (ii) zorg ervoor dat de specificiteit van de kandidaat-eiwit interactoren opgenomen met de gelabelde aas in onderzoeken vergelijking met resultaten verkregen met negatieve controle gecodeerde stammen (mock experimenten) of ongerelateerd eiwitlokaas, (iii) samengebouwd bevestigen potentiële interacties met een onbekend eiwit van onderest door het creëren van de overeenkomstige SPA tag aas fusie voor grootschalige zuivering of valideren paarsgewijze interacties met behulp van traditionele co-immunoprecipitatie met eiwit specifieke of tag specifieke antilichamen.
Tot op heden, het gebruik van deze systematische aanpak, zijn we erin geslaagd om te taggen en te zuiveren ongeveer twee derde van de ~ 2.750 E. coli oplosbare eiwitten die detecteerbaar onder cultuur uitgedrukt in rijk medium 1, 2. We hebben ook aangepast dezelfde basismethode systematisch isoleren membraan geassocieerde eiwitcomplexen en proberen nu elk van de overige ~ 1.000 E. zuiveren coli eiwitten voorspeld dat membraangebonden. Hoewel de zuivering van membraanproteïnen vaak vormt unieke uitdagingen omdat ze vaak niet efficiënt opgelost door de extractiebuffer die we normaal gebruiken voor de SPA-werkwijze, de toevoeging van niet-ionische detergenten onze buffers kunnen de oplosbaarheid en zuivering van een meerderheid van de E. coli </ Em> membraaneiwitten hebben we geprobeerd tot nu toe (Babu et al.., Ongepubliceerde gegevens).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de middelen van de Canadese Stichting voor Innovatie, Genome Canada, de Ontario Genomics Institute, de Ontario ministerie van Innovatie, en de Canadese Institutes of Health Research subsidie aan JG en AE The Red-expressie E. coli-stam DY330 was een vriendelijke gift van Donald L. Hof (National Cancer Institute, Frederick, MD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| I. Antibiotics | |||
| Kanamycin | Bioshop | #KAN201 | |
| Ampicillin | Bioshop | #AMP201 | |
| 2. Terrific-Broth medium | |||
| Bio-Tryptone | Bioshop | #TRP 402 | |
| Yeast extract | Bioshop | #YEX 555 | |
| Glycerol | Bioshop | #GLY 002 | |
| K2HPO4 | Bioshop | #PPM 302 | |
| KH2PO4 | Bioshop | #PPM 303 | |
| 3. Bacterial Strain and Plasmid | |||
| DY330 | Yu et al. (2000)10 | ||
| pJL148 | Zeghouf et al. (2004)7 | ||
| 4. PCR and Electrophoresis Reagents | |||
| Taq DNA polymerase | Fermentas | # EP0281 | |
| 10 X PCR buffer | Fermentas | # EP0281 | |
| 10 mM dNTPs | Fermentas | # EP0281 | |
| 25 mM MgCl2 | Fermentas | # EP0281 | |
| Agarose | Bioshop | # AGA002 | |
| Loading dye | NEB | #B7021S | |
| Ethidium bromide | Bioshop | # ETB444 | |
| 10X TBE buffer | Thermo Scientific | #28355 | |
| Tris Base | Bioshop | #TRS001 | |
| Boric acid | Bioshop | #BOR001 | |
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | Sigma | # E6768 | |
| DNA ladder | NEB | #N3232L | |
| 5. Plasmid isolation and Clean-up Kits | |||
| Plasmid Midi kit | Qiagen | #12143 | |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | #28104 | |
| 6. PCR and Transformation Equipments | |||
| Thermal cycler | BioRad | iCycler | |
| Agarose gel electrophoresis | BioRad | ||
| Electroporator | Bio-Rad | GenePulser II | |
| 0.2 cm electroporation cuvette | Bio-Rad | ||
| 42 °C water bath shaker | Innova 3100 | ||
| Beckman Coulter TJ-25 centrifuge | Beckman Coulter | TS-5.1-500 | |
| 32 °C Shaker | New Brunswick Scientific, USA | ||
| 32 °C large Shaker | New Brunswick Scientific, USA | ||
| 32 °C plate incubator | Fisher Scientific | ||
| 7. Electrophoresis and Western blotting | |||
| Acrylamide monomer, N,N'- methylenebis-acrylamide | Bio-Rad | #161-0125 | |
| Ammonium persulfate | Bioshop | # AMP001 | |
| n-butanol | Sigma | # B7906 | |
| TEMED | Bioshop | #TEM001 | |
| Whatman No. 1 filter paper | Fischer Scientific | #09-806A | |
| Mini protean 3 cell | Bio-Rad | #165-3301 | |
| iBlot gel transfer device | Invitrogen | #IB1001 | |
| Nitrocellulose membranes | Bio-Rad | #162-0115 | |
| Monoclonal Anti-Flag M2 antibody | Sigma | #F3165 | |
| Horseradish peroxidase | Amersham | #NA931V | |
| Pre-stained protein molecular weight standards | Bio-Rad | #161-0363 | |
| Chemiluminescence reagent | PIERCE | #1856136 | |
| Autoradiography film | Clonex Corp | #CLEC810 | |
| Quick Draw blotting paper | Sigma | #P7796 | |
| C2 platform rocking shaker | New Brunswick Scientific, USA | ||
| 8. Sonication Equipment and Reagents | |||
| Sonicator | Branson Ultrasonic | #23395 | |
| NaCl | Bioshop | #SOD001 | |
| Protease inhibitors | Roche | #800-363-5887 | |
| 0.5 mM TCEP-HCl | Thermo Scientific | #20490 | |
| 9. Affinity Purification Reagents and Equipment | |||
| 0.8 x 4 cm Bio-Rad polypropylene column | Bio-Rad | #732-6008 | |
| Benzonase nuclease | Novagen | #70746 | |
| Anti-FLAG M2 agarose beads | Sigma | #A2220 | |
| Calmodulin-sepharose beads | GE Healthcare | #17-0529-01 | |
| TEV protease | Invitrogen | #12575-015 | |
| Triton X-100 | Sigma | #T9284 | |
| CaCl2 | Sigma | #C2661 | |
| EGTA | Sigma | #E3889 | |
| LabQuake Shaker | Thermolyne | #59558 | |
| 10. Silver Staining Reagents | |||
| Methanol | Bioshop | #MET302 | |
| Acetic acid | Bioshop | t#ACE222 | |
| Sodium-thiosulfate | Sigma | #S-7143 | |
| Silver nitrate | Fischer Scientific | #S181-100 | |
| Formaldehyde | Bioshop | #FOR201 | |
| Sodium carbonate | Bioshop | #SOC512 | |
| 11. Reagents and Equipment for Protein Identification | |||
| Trypsin Gold, Mass Spectrometry Grade | Promega | # V5280 | |
| 50 mM NH4HCO3 | Bioshop | #AMC555 | |
| 1 mM CaCl2 | Bioshop | #CCL302 | |
| Acetonitrile | Sigma | #A998-4 | |
| Formic acid | Sigma | #F0507 | |
| HPLC grade water | Sigma | #95304 | |
| Iodoacetamide | Sigma | #16125 | |
| Millipore Zip-Tip | Millipore | # ZTC18M960 | |
| ~10 cm of 3 μm Luna-C18 resin | Phenomenex | ||
| Proxeon nano HPLC pump | Thermo Fisher Scientific | ||
| LTQ Orbitrap Velos mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| 12. Labware | |||
| 4 liter conical flasks | VWR | #89000-372 | |
| 50 ml polypropylene falcon tubes | Any Vendor | ||
| 1.5 ml micro-centrifuge tubes | Any Vendor | ||
| 250 ml conical flaks | VWR | #29140-045 | |
| 15 ml sterile culture tubes | Thermo Scientific | #366052 | |
| Cryogenic vials | VWR | #479-3221 | |
| -80 °C freezer | Fisher Scientific | #13-990-14 | |
| Speed vacuum system | Thermo Scientific | ||
| Buffers and Solutions 1. 1 liter Terrific Broth (TB) media 11 g Bio-Tryptone 2. Potassium Salt Stock Solution 1.5 M K2HPO4 3. Sonication Buffer 20 mM Tris-HCl (pH 7.9) 4. AFC buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 5. TEV cleavage buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 6. Calmodulin binding buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 7. Calmodulin wash buffer 30 mM Tris-HCl pH 7.9 8. Calmodulin elution buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 9. Developing solution (1L) 37% Formaldehyde 10. Digestion buffer 50 mM NH4HCO3 11. Wetting and Equilibration solution 70% acetonitrile (ACN) in 0.1% formic acid 12. Washing solution 100% H2O in 0.1% formic acid |
|||
References
- Butland, G., et al. Interaction network containing conserved and essential protein complexes in Escherichia coli. Nature. 433, 531-537 (2005).
- Hu, P., Janga, S. C., Babu, M., Diaz-Mejia, J. J., Butland, G. Global functional atlas of Escherichia coli encompassing previously uncharacterized proteins. PLoS Biol. 7, e1000096 (2009).
- Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, 637-643 (2006).
- Mak, A. B., et al. A lentiviral functional proteomics approach identifies chromatin remodeling complexes important for the induction of pluripotency. Mol. Cell Proteomics. 9, 811-823 (2010).
- Polanowska, J., et al. Tandem immunoaffinity purification of protein complexes from Caenorhabditis elegans. Biotechniques. 36, 778-782 (2004).
- Veraksa, A., Bauer, A., Artavanis-Tsakonas, S. Analyzing protein complexes in Drosophila with tandem affinity purification-mass spectrometry. Dev. Dyn. 232, 827-834 (2005).
- Zeghouf, M., et al. Sequential Peptide Affinity (SPA) system for the identification of mammalian and bacterial protein complexes. J. Proteome Res. 3, 463-468 (2004).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat. Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).
- Yu, D., et al. An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 5978-5983 (2000).
- Kislinger, T., et al. PRISM, a generic large scale proteomic investigation strategy for mammals. Mol. Cell Proteomics. 2, 96-106 (2003).
- Vlasblom, J., et al. GenePro: a Cytoscape plug-in for advanced visualization and analysis of interaction networks. Bioinformatics. 22, 2178-219 (2006).
- de Berardinis, V., et al. A complete collection of single-gene deletion mutants of Acinetobacter baylyi ADP1. Mol. Syst. Biol. 4, 174 (2008).
- Babu, M., et al. Sequential peptide affinity purification system for the systematic isolation and identification of protein complexes from Escherichia coli. Methods Mol. Biol. 564, 373-400 (2009).
