Summary
Purificazione di affinità di proteine marcate, in combinazione con la spettrometria di massa (APMS) è un potente metodo per la mappatura sistematica delle reti di interazione di proteine e per indagare la base meccanicistica dei processi biologici. Qui, descriviamo un ottimizzato sequenziale peptide affinità (SPA) APMS procedura sviluppata per il batterio
Abstract
Dal momento che la maggior parte dei processi cellulari sono mediate da assemblee macromolecolari, l'identificazione sistematica delle interazioni proteina-proteina (PPI) e l'identificazione della composizione subunità di multi-proteina complessi può fornire indicazioni in funzione del gene e migliorare la comprensione dei sistemi biologici 1, 2. Interazioni fisiche possono essere mappati con alta fiducia vialarge scala isolamento e caratterizzazione di complessi proteici endogeni in quasi fisiologiche condizioni basate su affinità purificazione di proteine cromosomicamente-tag in combinazione con la spettrometria di massa (APMS). Questo approccio è stato applicato con successo in organismi evolutivamente diverse, tra cui il lievito, mosche, vermi, cellule di mammifero, e batteri 1-6. In particolare, abbiamo generato un carbossi-terminale di affinità sequenziale Peptide (SPA) a doppio sistema di etichettatura per l'affinità per la purificazione complessi proteici autoctoni coltivati gram-negativi Escherichia coli, con genetically-trattabili ospitanti ceppi di laboratorio che sono particolarmente adatti per genoma indagini della biologia fondamentale e processi di conservazione di procarioti 1, 2, 7. Nostro SPA-tagging sistema è analogo al metodo di purificazione per affinità tandem originariamente sviluppato per il lievito 8, 9, e consiste di un legame peptidico calmodulina (CBP) seguito dal sito di clivaggio per la proteasi altamente specifico tabacco virus etch (TEV) e tre copie del FLAG epitopo (FLAG 3X), che consente per due turni consecutivi di arricchimento affinità. Dopo l'amplificazione cassetta, prodotti lineari sequenza-specifici della PCR che codifica per la SPA-tag e marcatore di selezione sono integrati ed espressi in cornice come carbossi-terminali fusioni in uno sfondo DY330 che è indotto ad esprimere transitoriamente un efficientissimo sistema di ricombinazione eterologa batteriofago lambda 10. Successiva dual-fase di purificazione utilizzando calmodulina e anti-FLAG perline affinità consente altamente selettivoe il recupero efficiente anche di complessi proteici a basso abbondanza di grandi culture. Spettrometria di massa tandem viene quindi utilizzato per identificare i stabilmente co-purificare proteine con elevata sensibilità (bassi limiti di rilevazione nanogrammi).
Qui, descriviamo dettagliate passo-passo le procedure usiamo comunemente per la codifica sistematica delle proteine, purificazione e di spettrometria di massa basata su analisi dei complessi proteici solubili da E. coli, che possono essere messe in scala e potenzialmente su misura per altre specie batteriche, tra cui alcuni patogeni opportunisti che sono suscettibili di recombineering. Le interazioni risultanti fisiche possono spesso rivelare interessanti elementi inaspettati e le connessioni che suggeriscono nuovi collegamenti meccanicistici. L'integrazione dei dati PPI con alternate dati di associazione molecolare come genetiche (gene-gene) interazioni e genomico-contesto (GC) previsioni può facilitare spiegazione della organizzazione globale molecolare di multi-proteina complessi all'interno di bipercorsi gici. Le reti generate per E. coli può essere utilizzato al fine di conoscere l'architettura funzionale di prodotti genici ortologhi in altri microbi per le quali le annotazioni funzionali attualmente mancano.
Protocol
1. Costruzione di Gene-specifica SPA-tagging in E. coli DY330 Strain
- Il plasmide che comprende il pJL148 SPA-tag sequenza di DNA e l'antibiotico kanamicina cassetta marcatore di resistenza (Kan R) sono usati come stampo nella reazione a catena della polimerasi (PCR) 7. A 45 nt gene-specifico primer forward, situata immediatamente a monte del codone di stop gene bersaglio in frame con un bp 27 ('5'-AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3) innesco tag specifica avanti, e un 45 nt gene-specifico primer reverse, situata immediatamente a valle del codone di stop gene bersaglio in frame con un 27 bp (5'-GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT -3 ') primer reverse tag specifica, sono utilizzati per amplificare la SPA-tag e Kan cassette R dalla pJL148 utilizzando le seguenti condizioni di ciclo di PCR: 94 ° C per 5 min, 30 cicli di 94 ° C per 1 min, 55 ° C per 1 min, 68 ° C per 2 min 10 sec, seguito da 68 ° C per 10 min. Queste sequenze amplificate servire uns substrati per la ectopicamente introdotto λ-Red macchine ricombinazione omologa (vedi sotto).
- Il prodotto PCR viene purificato usando un kit di purificazione Qiaquick PCR per rimuovere i sali che possono interferire con l'elettroporazione. Il prodotto di PCR purificato viene successivamente destinato ad integrare alla estremità 3 '(immediatamente a monte del codone di stop nativo) di un gene specifico in DY330 ceppo in cui viene espresso il Red-λ macchine ricombinazione 10.
- Il DY330 λ-Red ceppo che esprime è cresciuto durante la notte in 2 ml di Luria-Bertani (LB) medio a 32 ° C agitando a 180 giri al minuto. 1 ml della coltura overnight viene successivamente inoculato in 70 ml di terreno LB fresco in beuta da 500 ml. L'inoculo è cresciuto a 32 ° C agitando a 180 rpm fino OD 600 raggiunge ~ 0,8.
- La coltura viene trasferito in una nuova beuta da 250 ml, in cui le cellule sono indotte incubando il pallone in un bagno di acqua a 42 ° C agitando delicatamente a180 rpm per 15 min. Immediatamente dopo l'induzione, il pallone viene incubato in un bagno di ghiaccio slurry acqua per almeno 30 minuti con agitazione.
- La gelida coltura viene immediatamente trasferito in pre-raffreddata tubo da 50 ml in polipropilene e sottoposta a centrifugazione a 3993 xg per 6 minuti a 4 ° C. Il pellet viene risospeso in 50 ml di acqua ghiacciata sterile e centrifugato di nuovo a 3993 xg per 6 minuti a 4 ° C. Il pellet viene risospeso in 1 ml di acqua fredda e trasferito in una provetta 1,5 ml Effendorf, e centrifugato a velocità massima per 20 sec a 4 ° C. Dopo due o tre fasi di lavaggio con acqua gelata, il pellet viene risospeso in 700 finalmente pl di acqua ghiacciata sterile, con conseguente elettro-cellule competenti.
- Tramite elettroporazione, uno microlitri dell'amplicone purificato viene introdotto in 40 ml di elettro-cellule competenti. Le cellule sono elettroporazione in un Bio-Rad GenePulser II con le seguenti impostazioni: 2,5 kV, 25 uF con polsocontrollore di 200 Ω. Dopo ricombinazione omologa e integrazione, i trasformanti che ricombinano con successo il tag / cassetta nel cromosoma sono selezionati in base alla resistenza a Kan (Figura 1A). Trasformanti più sono selezionati per Western blotting per verificare la corretta generazione (cioè segnale positivo) di SPA-tagged proteine di fusione con anticorpo anti-FLAG M2 che è selettiva contro gli epitopi di bandiera della SPA-tag.
- Confermato carbossi terminale SPA-tag ceppo di fusione viene coltivato su larga scala per isolare complessi proteici solubili da cellule raccolte utilizzando il protocollo di purificazione SPA. Lo schema delle fasi coinvolte nella procedura di purificazione di affinità tag è mostrato in Figura 1B.
2. Coltura e sonicazione
- Inoculare 100 pl di una SPA-tag E. glicerolo magazzino coli in 50 ml di brodo di eccezionale (TB) liquido integrato con 50 microlitri di 25 mcg / ml of soluzione Kan in una beuta da 250 ml. Far crescere la coltura durante la notte a 32 ° C.
Nota: Poiché la temperatura-inducibile cassette λ Red in ceppo DY330 è sotto il controllo di un sensibile alla temperatura 10 repressore, il SPA-etichettato ceppo di E. coli è cresciuto a 32 ° C. - Trasferire 10 ml della coltura durante la notte in 990 ml TB fresco supplementato con 25 ug / ml di Kan in un pallone 4 litro. La cultura è cresciuta a 32 ° C con agitazione costante a 250 rpm, da 5 a 6 ore, fino a quando la OD 600 raggiunge ~ 2 a 3.
- Trasferire 1 litro E. coli SPA-tag cultura per pulire le bottiglie di centrifugazione e far girare le cellule a 4 ° C in Beckman J6-HC centrifuga @ 3993 xg per 15 min.
- Il supernatante viene rimosso dalle bottiglie di centrifugazione. Risospendere la E. Pellet cellulari coli con 25 ml di tampone di sonicazione. Assicurarsi di mantenere le bottiglie centrifugazione su ghiaccio in ogni momento.
- Il pellet risospeso ètrasferito a tubo da 50 ml in polipropilene Falcon e congelato in azoto liquido. Le cellule vengono congelate a -80 ° C per uso a lungo termine.
- Prima di sonicazione, le cellule congelate scongelare completamente mantenendo i pellets in ghiaccio. I campioni scongelati vengono trasferiti a una tazza sterile acciaio inox posto sul ghiaccio per sonicazione. La sonda è immersa nel campione e sonicata per 3 min. Un ulteriore 2 min si lascia raffreddare il campione dal surriscaldamento.
- Il lisato cellulare viene sonicato trasferita nel pre-raffreddata tubo di centrifugazione sterile, e sottoposta a centrifugazione a 4 ° C in una centrifuga Beckman con rotore JA-17 @ 35.267 xg (16.000 rpm) per 15 min per due volte.
Nota: Nel caso della purificazione di proteine di membrana, il lisato cellulare viene centrifugata sonicato solo una volta per 15 minuti perché non sapere in quale frazione delle proteine di membrana sono, cioè, sia in pellet o nel surnatante. Quindi, per evitare la perdita di eccesso di memproteine brane, ruotiamo le cellule per 15 min a centrifugazione ad alta velocità e il supernatante viene successivamente elaborato per la purificazione (vedere i passi sotto) dove 1% detersivo viene utilizzato per solubilizzare le proteine di membrana. - Il supernatante dal tubo di centrifugazione viene accuratamente trasferita ad una provetta di polipropilene da 50 ml Falcon e congelati in azoto liquido. L'estratto sonicato cella congelato viene immagazzinato per un periodo massimo di 6 mesi a -80 ° C per utilizzo futuro.
3. Affinity Purification
- Prima dell'uso, 100 pl di perline M2 anti-FLAG sono lavati da 10 volumi di AFC tampone (30 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1% di detergente, e 0,1-0,5 mM TCEP [tris (2-carbossietil) fosfina - acido cloridrico]) senza il detersivo e l'agente riducente TCEP (tris (2-carbossietil) fosfina).
- Il congelato, estratto cellulare viene sonicato scongelato ponendo la provetta in acqua fredda. L'estratto cellulare scongelato è incubato con 3 ml di benzonase nucleasi per 30 min a 4 ° C. A questa miscela, aggiungere detergente non ionico Triton X-100 (concentrazione finale del detersivo dovrebbe essere 0,1%) e 200 microlitri di sospensione anti-FLAG M2 perle agarosio.
Nota: Per tutte le purificazioni di proteine solubili, 0,1% Triton X-100 viene usato per minimizzare adsorbimento non specifico, dove, come per purificare una proteina di membrana, diversi lievi detergenti non ionici, come C12E8 (Octaethylene dodecil etere glicole), DDM ( n-Dodecyl β-D-maltoside) e maltosio-neopentil glicole (MNG) può essere impiegato ad una concentrazione di detersivo 1% per migliorare solubilizzazione. Dal detersivi diversi hanno un diverso grado di efficienza solubilizzazione delle proteine di membrana, si consiglia di eseguire purificazioni di proteine indipendenti utilizzando più di un detersivo. - Il contenuto viene miscelato delicatamente ruotando il tubo per 3 ore a 4 ° C usando un agitatore LabQuake. Dopo 3 ore di rotazione, il tubo viene centrifugato a 1700 xg per 6 min. Il supernatante è quindi removed attenzione, per quanto possibile, senza disturbare il pellet sciolto tallone.
- Il pellet viene risospeso nel supernatante residuo e quindi trasferita in un 0,8 x 4 centimetri Bio-Rad colonna polipropilene prep. Assicurarsi di rimuovere i tappi scarico di fondo della colonna, per consentire gli eluati di drenare dal flusso di gravità. Lavare la colonna con la fase 5 volte scissione TEV.
- Dopo lo scarico eluati lavate, scarico di fondo della colonna viene chiusa. Alla stessa colonna, clivaggio viene eseguito aggiungendo ~ 5 per 10 microlitri (50 unità) di proteasi TEV e 400 pl di tampone 1X AFC sulla colonna. Garantire per chiudere la parte superiore della colonna con un tappo. La colonna contenente le microsfere vengono ruotate delicatamente la notte a 4 ° C per una notte con un agitatore LabQuake.
- Rimuovere il tappo sulla parte superiore e il tappo di scarico nella parte inferiore della colonna, e drenare gli eluati recuperati dopo clivaggio TEV in una colonna di fresco contenente 200 ml di sospensioni calmodulina-sefarosio perline, che viene lavato con 10volumi di tampone calmodulin vincolante.
- Sia la parte superiore e la parte inferiore della colonna sono fissate saldamente, e il contenuto della colonna sono mescolati delicatamente ruotando per 3 ore a 4 ° C usando un agitatore LabQuake.
- Dopo 3 ore di rotazione, l'eluato viene drenato rimuovendo il tappo superiore e il tappo di fondo della colonna. La colonna viene lavata quattro volte con 200 pl di tampone 1X calmodulina vincolante seguito da un lavaggio stringente con 400 microlitri di tampone di lavaggio calmodulina.
- La proteine viene eluita in quattro frazioni di 50 pl in una nuova provetta Eppendorf con 1X tampone di eluizione calmodulina. La frazione eluita è distribuito in due provette Eppendorf puliti in volumi uguali. Entrambi i tubi vengono successivamente essiccate utilizzando un vuoto velocità.
- L'eluato essiccato da una provetta viene utilizzato per l'esecuzione di un gel colorazione con argento, mentre l'altro è memorizzato in -80 ° C, prima di utilizzare la spettrometria di massa.
4. Argento colorazione
- Per argento staining, metà del volume 3X SDS (sodio dodecil solfato) tampone campione viene aggiunto a 50 ml di eluato essiccato. Dopo l'ebollizione della miscela per 5 minuti, i campioni vengono caricati su un gel di poliacrilammide SDS.
- Dopo che il gel ha terminato l'esecuzione, viene accuratamente messi in soluzione di fissaggio (50% metanolo e 10% di acido acetico) e agitata delicatamente su un agitatore rotante per 20 min. Il gel viene lavato in etanolo al 20% per 10 min.
- Il gel viene lavato due volte fissa accuratamente con 500 ml di acqua bidistillata per 10 min per garantire un basso background uniforme.
- Il gel viene poi agitate leggermente in 500 ml di sodio-tiosolfato per 1 min, seguito da due lavaggi con acqua distillata per 20 sec.
- L'acqua viene scartato, e il gel viene incubato in 200 ml di nitrato d'argento 0,1% per 30 min. Dopo questo periodo, il nitrato d'argento viene rimosso e il gel viene lavato con acqua distillata per 20 secondi per rimuovere l'eccesso di nitrato d'argento.
- Il gel viene infine mano agitato in 75 mldella soluzione di sviluppo. Quando l'intensità desiderato è raggiunto, la soluzione di sviluppo è scartato e 80 ml di acido acetico viene aggiunto per arrestare la reazione. Garantire incubare il gel in acido acetico per un minimo di 20 minuti per la visualizzazione corretta di bande di gel.
5. Proteolisi e preparazione del campione per Spettrometria di Massa
- Al campione essiccato, aggiungere 50 microlitri di tampone di digestione e 0,9 ml di 100 mM TCEP-HCl (tris (2-carbossietil) fosfina - acido cloridrico) e incubare la miscela per 45 min a temperatura ambiente per la fase di riduzione. Successivamente, 1 ml di 500 mM iodoacetamide viene aggiunta e incubata in un altro buio per 40 min per permettere alchilazione campione.
- Dopo la seconda fase di incubazione, aggiungere 1 ug di tripsina immobilizzata alla miscela e incubare sia a 37 ° C per 5 ore o per una notte a temperatura ambiente. Garantire per arrestare la reazione aggiungendo 1 ml di acido acetico.
- Pre-bagnare la Millipore Zip-Tip puntale aspirando 10 ml della soluzione di bagnatura e di equilibrio. Dispensare la soluzione ai rifiuti. Successivamente aspirare 10 pl della soluzione di lavaggio e di erogare la soluzione ai rifiuti. Ripetere questa operazione due volte.
- Per il legame efficace della miscela peptide alla punta, pipetta mescolare la miscela peptidica 20 volte. La miscela peptide che aderisce alla punta viene lavato via da aspirare e dispensare la soluzione di lavaggio. Ripetere questa procedura due volte per il legame efficiente della miscela peptide alla punta.
- Con la punta contenente il peptide legato, aspirare 10 pl della soluzione di bagnatura e di equilibrazione, e distribuire in una provetta eppendorf pulita. Ripetere questa operazione due volte. Dopo essiccazione i campioni eluiti a vuoto velocità, i campioni possono essere analizzati immediatamente mediante spettrometria di massa o conservati a -80 ° C prima dell'uso.
6. L'identificazione delle proteine da LTQ Orbitrap Velos spettrometro di massa
Thcomponenti elettronici polipeptidiche dei complessi isolati sono identificati utilizzando un LTQ Orbitrap Velos ibrido spettrometro di massa tandem. Il Orbitrap ha eccezionale potere di risoluzione (> 60.000 completa Mezza Larghezza massima, o FWHM) e accuratezza di massa (<2 ppm), che riduce al minimo MS / MS di campionamento di irrilevanti non specifici contaminanti sfondo rilevati in purificazioni di controllo, mentre l'elevata velocità Velos trappola di ioni componente in grado di rilevare e peptidi abbondanza frammento bassi utilizzando sia il trasferimento di elettroni e dissociazione indotta da collisione modalità di dissociazione. Incontri di alta fiducia tra conseguente MS / MS sono mappati di riferimento E. sequenze proteiche coli con algoritmo di ricerca di database come SEQUEST e ogni sequenza di corrispondenza valutato nel corso di un algoritmo di probabilità come STATQUEST 11. Il numero totale di spettri, unicità sequenza peptidica e contaminanti sfondo comuni rilevati nel controllo negativo (vale a dire. Finto) purificazioni sono considerati per ottenere una bassa empirico falso-discupero tasso. Le seguenti operazioni vengono eseguite per l'identificazione delle proteine:
- Le micro-colonne sono confezionati con ~ 10 cm di 3 micron Luna-C 18 e resina sono interfacciati ad una fonte di ioni Proxeon nanoelectrospray che è posto in linea con lo strumento Orbitrap.
- Un flusso Proxeon nano pompa binaria HPLC vengono usati per fornire uno stabile flusso di punta ~ 300 nl min -1 durante le separazioni peptidici.
- Per raggiungere eluizione peptide, un gradiente di tampone organico è impostato in funzione della complessità del campione. Ad esempio, il seguente gradiente è tipicamente configurato per E. campioni SPA coli: solvente B è aumentato dal 2% al 6% in 1 minuto, al 24% in 38 minuti, al 100% nel prossimo 4 min, detenuta al 100% per 1 minuto, per poi scendere al 2% nel 1 min, e finale premuto al 2% per 15 min. La fase mobile solvente A ha il 95% di acqua gradiente HPLC e il 5% ACN con 0,1% di acido formico, mentre il solvente B ha il 5% di acqua gradiente HPLC e il 95% ACN con 0,1% formico acid. La portata alla punta dell'ago è impostata a 300 nl min -1 per 60 min.
- Come i cicli di spettrometro di massa eseguito attraverso una scansione completa di massa a 60.000 risoluzioni, 10 concomitanti tandem scansioni di massa di frammentazione sono raccolti per le ioni precursori più intense. Esclusione dinamica, selezione massale monoisotopico, e in tempo reale i dati che dipendono dalla caratteristiche dello strumento di acquisizione sono abilitate.
- Gli spettri sono cercati utilizzando un algoritmo di ricerca del database come SEQUEST contro un database di E. sequenze proteiche coli, e il risultato è statisticamente filtrati utilizzando un algoritmo di probabilità come STAQUEST 11 per garantire un basso tasso di scoperta false. Solo la fiducia elevato (99% di probabilità) i candidati sono selezionati, mentre l'incontro che mostra più di 10 ppm di errore di massa rispetto alla massa peptide teorica vengono eliminati da ulteriori considerazioni.
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Discussion
Un aspetto fondamentale della ZPS approccio APMS descritto qui è che la codifica viene effettuata all'interno del contesto naturale cromosomica, in modo da garantire la normale regolazione genica è mantenuto (ad esempio. Promotore esca nativo conservati, quindi i livelli di espressione non è perturbato) e nativo stabilmente associata a complessi proteici sono recuperati a quasi livelli endogeni. Questioni polarità operone inoltre sono evitati includendo un promotore rivolto all'esterno nel marcatore selezionabile. Questo SPA-tagging approccio è abbastanza efficace per purificare i componenti di bassa concentrazione di complessi quasi omogeneità, tra associate alla membrana assemblee, anche se le subunità sono espressi fino a solo poche molecole per cellula batterica. Nel complesso, questo protocollo può essere facilmente in scala-up per la purificazione di grandi insiemi di tag proteine solubili in E. coli o in linea di principio tutte le altre specie batteriche per le quali la codifica tramite recombineering è possibile, o quelli che possiedono naturalmente ad alto trasformazionizione funzionalità, come Acinetobacter, un cavallo di battaglia emergente di genetica batterica, che è stato usato, per esempio, per costruire una libreria di ceppo knockouts genica mirata 13.
Una delle principali preoccupazioni inerenti agli approcci di proteomica su larga scala è l'identificazione di promiscui non specifici interattori e contaminazioni traccia spuria. Nonostante due cicli di arricchimento, nostri purificazioni SPA di routine regolarmente rilevare contaminanti frequenti che di solito alta abbondanza proteine housekeeping, quali le proteine ribosomali e accompagnatori, che si legano in modo non specifico alla resina cromatografica e / o proteine esca. Questo problema può essere attenuato in due modi. In primo luogo, il numero totale spettrale e l'unicità di ogni proteina identificata con un esca particolare viene considerato in rapporto ad una serie più ampia di purificazioni di più esche proteiche non collegati e senza tag (ad esempio. Wild type) ceppi di controllo negativo (vale a dire. Finto compe purificazione per affinitàiments) per ridurre al minimo falsi associazioni positive. In secondo luogo, tutte le interazioni proteina candidati devono essere convalidati utilizzando la codifica reciproca e la purificazione del partner putativo vincolante, con l'obiettivo di conferma indipendente singoli interazioni proteina-proteina per evitare di rari casi in cui la presenza della ZPS-tag perturba incorporazione di proteine native in il gruppo proteina endogena.
Indagini proteomiche APMS a base sono limitati dalla mancanza di sensibilità in termini di identificazione interazioni transitorie o sub-stechiometrica. In tali casi, un singolo passo per le procedure di purificazione può essere utilizzato per migliorare la rilevazione di partner di interazione più deboli. Durante il corso del nostro corso, studio decennio lungo del E. coli interactomi, abbiamo visto le capacità di rilevamento di nuovi spettrometri di massa generazione di migliorare costantemente. Older strumentazione è polarizzato all'identificazione ricorrente di proteine altamente abbondanti, spesso precludendo individuazione di meno abuproteine che interagiscono ndant ma potenzialmente molto importante. Al contrario, il Orbitrap Velos spettrometro di massa ibrido che attualmente in uso è nettamente migliorata risoluzione, accuratezza di massa, e la sensibilità consentendo in tal modo molto più efficiente, il rilevamento elevato throughput di proteine poco abbondanti, comprese le interazioni transitori. Infine, se la natura dell'interazione è completamente sconosciuto si consiglia ai ricercatori di: (i) applicare criteri rigorosi per assegnare punteggi di fiducia a tutti gli incontri putativi di ricerca del database. Proteine con due o più peptidi univoci di solito sono considerati positivi, assumendo ogni partita passa con una soglia minima di rischio cut-off del 99% o maggiore probabilità, (ii) fare in modo di esaminare la specificità di interattori proteici candidati registrati con l'esca taggato in rispetto ai risultati ottenuti con i ceppi di controllo negativo (senza tag esperimenti fittizie) o esche proteiche indipendenti, (iii) reciprocamente confermare potenziali interazioni contenenti una proteina sconosciuta di interest con la creazione del corrispondente elemento di fusione SPA esca per la grande purificazione o convalidare pair-wise interazioni con tradizionale co-immunoprecipitazione con specifiche proteine o anticorpi specifici tag.
Ad oggi, con questo approccio sistematico, siamo riusciti a selezionare e purificare circa i due terzi del ~ 2750 E. coli proteine solubili che rilevabile espressi in coltura in terreno ricco di 1, 2. Abbiamo anche adattato questo stesso metodo di base per isolare sistematicamente associate alla membrana complessi proteici, e stanno cercando di purificare ciascuno dei restanti ~ 1000 E. proteine coli previsto per essere legato alla membrana. Mentre la purificazione di proteine di membrana pone spesso sfide uniche perché spesso non sono efficientemente solubilizzata dal tampone di estrazione che vengono normalmente utilizzare per il metodo SPA, l'aggiunta di detergenti non ionici ai nostri buffer consente la solubilizzazione e la purificazione di una maggioranza dei E. coli </ Em> proteine di membrana che hanno tentato fino ad oggi (Babu et al., Dati non pubblicati).
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato con fondi della Fondazione canadese per l'innovazione, Genome Canada, l'Ontario Genomics Institute, il Ministero della Innovazione, e il Canadian Institutes of Health Research sovvenzione JG e AE The Red-esprime E. coli ceppo DY330 è stato un gentile dono da Donald L. Court (National Cancer Institute, Frederick, MD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| I. Antibiotics | |||
| Kanamycin | Bioshop | #KAN201 | |
| Ampicillin | Bioshop | #AMP201 | |
| 2. Terrific-Broth medium | |||
| Bio-Tryptone | Bioshop | #TRP 402 | |
| Yeast extract | Bioshop | #YEX 555 | |
| Glycerol | Bioshop | #GLY 002 | |
| K2HPO4 | Bioshop | #PPM 302 | |
| KH2PO4 | Bioshop | #PPM 303 | |
| 3. Bacterial Strain and Plasmid | |||
| DY330 | Yu et al. (2000)10 | ||
| pJL148 | Zeghouf et al. (2004)7 | ||
| 4. PCR and Electrophoresis Reagents | |||
| Taq DNA polymerase | Fermentas | # EP0281 | |
| 10 X PCR buffer | Fermentas | # EP0281 | |
| 10 mM dNTPs | Fermentas | # EP0281 | |
| 25 mM MgCl2 | Fermentas | # EP0281 | |
| Agarose | Bioshop | # AGA002 | |
| Loading dye | NEB | #B7021S | |
| Ethidium bromide | Bioshop | # ETB444 | |
| 10X TBE buffer | Thermo Scientific | #28355 | |
| Tris Base | Bioshop | #TRS001 | |
| Boric acid | Bioshop | #BOR001 | |
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | Sigma | # E6768 | |
| DNA ladder | NEB | #N3232L | |
| 5. Plasmid isolation and Clean-up Kits | |||
| Plasmid Midi kit | Qiagen | #12143 | |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | #28104 | |
| 6. PCR and Transformation Equipments | |||
| Thermal cycler | BioRad | iCycler | |
| Agarose gel electrophoresis | BioRad | ||
| Electroporator | Bio-Rad | GenePulser II | |
| 0.2 cm electroporation cuvette | Bio-Rad | ||
| 42 °C water bath shaker | Innova 3100 | ||
| Beckman Coulter TJ-25 centrifuge | Beckman Coulter | TS-5.1-500 | |
| 32 °C Shaker | New Brunswick Scientific, USA | ||
| 32 °C large Shaker | New Brunswick Scientific, USA | ||
| 32 °C plate incubator | Fisher Scientific | ||
| 7. Electrophoresis and Western blotting | |||
| Acrylamide monomer, N,N'- methylenebis-acrylamide | Bio-Rad | #161-0125 | |
| Ammonium persulfate | Bioshop | # AMP001 | |
| n-butanol | Sigma | # B7906 | |
| TEMED | Bioshop | #TEM001 | |
| Whatman No. 1 filter paper | Fischer Scientific | #09-806A | |
| Mini protean 3 cell | Bio-Rad | #165-3301 | |
| iBlot gel transfer device | Invitrogen | #IB1001 | |
| Nitrocellulose membranes | Bio-Rad | #162-0115 | |
| Monoclonal Anti-Flag M2 antibody | Sigma | #F3165 | |
| Horseradish peroxidase | Amersham | #NA931V | |
| Pre-stained protein molecular weight standards | Bio-Rad | #161-0363 | |
| Chemiluminescence reagent | PIERCE | #1856136 | |
| Autoradiography film | Clonex Corp | #CLEC810 | |
| Quick Draw blotting paper | Sigma | #P7796 | |
| C2 platform rocking shaker | New Brunswick Scientific, USA | ||
| 8. Sonication Equipment and Reagents | |||
| Sonicator | Branson Ultrasonic | #23395 | |
| NaCl | Bioshop | #SOD001 | |
| Protease inhibitors | Roche | #800-363-5887 | |
| 0.5 mM TCEP-HCl | Thermo Scientific | #20490 | |
| 9. Affinity Purification Reagents and Equipment | |||
| 0.8 x 4 cm Bio-Rad polypropylene column | Bio-Rad | #732-6008 | |
| Benzonase nuclease | Novagen | #70746 | |
| Anti-FLAG M2 agarose beads | Sigma | #A2220 | |
| Calmodulin-sepharose beads | GE Healthcare | #17-0529-01 | |
| TEV protease | Invitrogen | #12575-015 | |
| Triton X-100 | Sigma | #T9284 | |
| CaCl2 | Sigma | #C2661 | |
| EGTA | Sigma | #E3889 | |
| LabQuake Shaker | Thermolyne | #59558 | |
| 10. Silver Staining Reagents | |||
| Methanol | Bioshop | #MET302 | |
| Acetic acid | Bioshop | t#ACE222 | |
| Sodium-thiosulfate | Sigma | #S-7143 | |
| Silver nitrate | Fischer Scientific | #S181-100 | |
| Formaldehyde | Bioshop | #FOR201 | |
| Sodium carbonate | Bioshop | #SOC512 | |
| 11. Reagents and Equipment for Protein Identification | |||
| Trypsin Gold, Mass Spectrometry Grade | Promega | # V5280 | |
| 50 mM NH4HCO3 | Bioshop | #AMC555 | |
| 1 mM CaCl2 | Bioshop | #CCL302 | |
| Acetonitrile | Sigma | #A998-4 | |
| Formic acid | Sigma | #F0507 | |
| HPLC grade water | Sigma | #95304 | |
| Iodoacetamide | Sigma | #16125 | |
| Millipore Zip-Tip | Millipore | # ZTC18M960 | |
| ~10 cm of 3 μm Luna-C18 resin | Phenomenex | ||
| Proxeon nano HPLC pump | Thermo Fisher Scientific | ||
| LTQ Orbitrap Velos mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| 12. Labware | |||
| 4 liter conical flasks | VWR | #89000-372 | |
| 50 ml polypropylene falcon tubes | Any Vendor | ||
| 1.5 ml micro-centrifuge tubes | Any Vendor | ||
| 250 ml conical flaks | VWR | #29140-045 | |
| 15 ml sterile culture tubes | Thermo Scientific | #366052 | |
| Cryogenic vials | VWR | #479-3221 | |
| -80 °C freezer | Fisher Scientific | #13-990-14 | |
| Speed vacuum system | Thermo Scientific | ||
| Buffers and Solutions 1. 1 liter Terrific Broth (TB) media 11 g Bio-Tryptone 2. Potassium Salt Stock Solution 1.5 M K2HPO4 3. Sonication Buffer 20 mM Tris-HCl (pH 7.9) 4. AFC buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 5. TEV cleavage buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 6. Calmodulin binding buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 7. Calmodulin wash buffer 30 mM Tris-HCl pH 7.9 8. Calmodulin elution buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 9. Developing solution (1L) 37% Formaldehyde 10. Digestion buffer 50 mM NH4HCO3 11. Wetting and Equilibration solution 70% acetonitrile (ACN) in 0.1% formic acid 12. Washing solution 100% H2O in 0.1% formic acid |
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References
- Butland, G., et al. Interaction network containing conserved and essential protein complexes in Escherichia coli. Nature. 433, 531-537 (2005).
- Hu, P., Janga, S. C., Babu, M., Diaz-Mejia, J. J., Butland, G. Global functional atlas of Escherichia coli encompassing previously uncharacterized proteins. PLoS Biol. 7, e1000096 (2009).
- Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, 637-643 (2006).
- Mak, A. B., et al. A lentiviral functional proteomics approach identifies chromatin remodeling complexes important for the induction of pluripotency. Mol. Cell Proteomics. 9, 811-823 (2010).
- Polanowska, J., et al. Tandem immunoaffinity purification of protein complexes from Caenorhabditis elegans. Biotechniques. 36, 778-782 (2004).
- Veraksa, A., Bauer, A., Artavanis-Tsakonas, S. Analyzing protein complexes in Drosophila with tandem affinity purification-mass spectrometry. Dev. Dyn. 232, 827-834 (2005).
- Zeghouf, M., et al. Sequential Peptide Affinity (SPA) system for the identification of mammalian and bacterial protein complexes. J. Proteome Res. 3, 463-468 (2004).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat. Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).
- Yu, D., et al. An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 5978-5983 (2000).
- Kislinger, T., et al. PRISM, a generic large scale proteomic investigation strategy for mammals. Mol. Cell Proteomics. 2, 96-106 (2003).
- Vlasblom, J., et al. GenePro: a Cytoscape plug-in for advanced visualization and analysis of interaction networks. Bioinformatics. 22, 2178-219 (2006).
- de Berardinis, V., et al. A complete collection of single-gene deletion mutants of Acinetobacter baylyi ADP1. Mol. Syst. Biol. 4, 174 (2008).
- Babu, M., et al. Sequential peptide affinity purification system for the systematic isolation and identification of protein complexes from Escherichia coli. Methods Mol. Biol. 564, 373-400 (2009).
