Summary
Affinitätsreinigung von markierten Proteinen in Kombination mit der Massenspektrometrie (APMS) ist eine leistungsfähige Methode für die systematische Kartierung von Protein-Wechselwirkung Netzwerken und zur Untersuchung der mechanistischen Grundlagen von biologischen Prozessen. Hier beschreiben wir eine optimierte sequentielle Peptid Affinität (SPA) APMS Verfahren für das Bakterium entwickelt
Abstract
Da die meisten zellulären Prozesse werden von makromolekularen Anordnungen, die systematische Identifikation von Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPI) und die Identifizierung der Untereinheitzusammensetzung von Multi-Protein-Komplexen Einblick in Genfunktion Verfügung stellen können und besseren Verständnis der biologischen Systeme 1, 2 vermittelt wird. Physikalische Wechselwirkungen können mit hoher Konfidenz vialarge angelegte Isolierung und Charakterisierung von endogenen Proteinkomplexe unter nahezu physiologischen Bedingungen auf Affinitätsreinigung chromosomal-markierte Proteine in Kombination mit Massenspektrometrie (APMS) basierend abgebildet werden. Dieser Ansatz ist erfolgreich in evolutionär diversen Organismen, einschließlich Hefe, Fliegen, Würmern, Säugetierzellen, Bakterien und 1-6 aufgebracht. Insbesondere haben wir eine Carboxy-terminale Peptid Sequentielle Affinity (SPA) dualen Markierungssystem für Affinitäts-Reinigungskatalysator native Protein-Komplexen aus kultivierten gramnegativen Escherichia coli erzeugt wird, unter Verwendung genetically Spann Gastlabor Stämme, die für genomweite Untersuchungen der grundlegenden Biologie und konservierte Prozesse der Prokaryoten 1, 2, 7 gut geeignet. Unsere SPA-Kennzeichnungssystem ist analog zu dem Tandem Affinitätsreinigung Methode ursprünglich für Hefe 8, 9 entwickelt, und besteht aus einem Calmodulin-Bindungspeptid (CBP) durch die Spaltstelle für die hochspezifische Tobacco Etch Virus (TEV)-Protease gefolgt und drei Kopien des FLAG-Epitop (3X FLAG), so dass für zwei aufeinanderfolgende Runden von Affinitätsanreicherung. Nach Kassette Amplifikation werden sequenzspezifische lineare PCR-Produkte Codieren des SPA-tag und einen selektierbaren Marker integriert und ausgedrückt in Rahmen als carboxyterminale Fusionen in einem Hintergrund, der DY330 veranlaßt transient exprimieren ein hocheffizientes heterologe Bakteriophagen Lambda Rekombinationssystem 10 ist. Nachfolgende Dual-Schritt-Reinigung mit Calmodulin und anti-FLAG Affinitätsbeads ermöglicht die hochselektiveund effizienten Beitreibung sogar geringer Menge Protein-Komplexe von großen Kulturen. Tandem-Massenspektrometrie wird dann verwendet, um die stabil co-reinigenden Proteine mit hoher Empfindlichkeit (niedrige Nachweisgrenzen Nanogramm) zu identifizieren.
Hier beschreiben wir detaillierte Schritt-für-Schritt-Verfahren, die wir üblicherweise für die systematische Protein-Tagging, Reinigung und Massenspektrometrie-basierte Analyse von löslichem Protein-Komplexen aus E. verwenden coli, die bis skaliert werden und kann potenziell auf andere Bakterienarten, einschließlich bestimmter opportunistischer Krankheitserreger, die zugänglich Recombineering zugeschnitten sind. Die resultierenden physikalischen Wechselwirkungen zeigen oft interessante unerwartete Komponenten und Verbindungen hindeutet neuartige mechanistische Links. Integration der PPI-Daten mit alternativen molekulare Assoziation Daten wie genetische (Gen-Gen-) Wechselwirkungen und genomische-Kontext (GC) Prognosen Aufklärung der globalen molekulare Organisation von Multi-Protein-Komplexe in bi erleichtern kanngische Wege. Die Netzwerke für E. erzeugten coli können verwendet werden, um einen Einblick in die funktionelle Architektur von orthologen Genprodukte in anderen Mikroben für die funktionelle Annotationen derzeit fehlen gewinnen.
Protocol
Ein. Bau von Gen-spezifische SPA-Tagging in E. coli DY330 Stamm
- Das Plasmid pJL148 umfassend den SPA-tag-DNA-Sequenz und die Kanamycin Antibiotikaresistenzmarker Kassette (Kan R) als Matrize in der Polymerasekettenreaktion (PCR)-Amplifikation 7 verwendet. A 45 nt genspezifischen Vorwärtsprimer, unmittelbar stromaufwärts des Zielgens Stoppcodon im Leserahmen mit einem 27 bp (5'-AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3 ') tag spezifischen Vorwärtsprimer befindet, und eine 45 nt genspezifischen Rückwärtsprimer, der unmittelbar stromabwärts des Zielgens Stoppcodon im Leserahmen mit einem 27 bp (5'-GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT -3 ') tag spezifischen Rückwärtsprimer, werden verwendet, um den SPA-tag und Kan ® Kassette aus dem pJL148 mit nachfolgenden PCR amplifizieren Zyklusbedingungen: 94 ° C für 5 min, 30 Zyklen von 94 ° C für 1 min, 55 ° C für 1 min, 68 ° C für 2 Min. 10 Sek., um 68 ° C für 10 min folgte. Diese verstärkten Sequenzen dienen as Substrate für die ektopisch eingeführt λ-Rot-Rekombination homologer Maschinen (siehe unten).
- Das PCR-Produkt wird unter Verwendung einer QIAquick-PCR, um Salze, die mit der Elektroporation stören können, zu entfernen. Das gereinigte PCR-Produkt wird anschließend zur gezielten am 3'-Ende (unmittelbar stromaufwärts des nativen Stopcodon) eines spezifischen Gens in DY330 Stamm, in dem der λ-Rot-Rekombination Maschinen 10 exprimiert wird integrieren.
- Die DY330 λ-Red exprimierenden Stamm wird über Nacht in 2 ml Luria-Bertani (LB)-Medium bei 32 ° C gewachsen durch Schütteln bei 180 UpM. 1 ml der Übernacht-Kultur wird anschliessend in 70 ml frischem LB-Medium in 500 ml Erlenmeyerkolben inokuliert. Das Inokulum wird bei 32 ° C durch Schütteln bei 180 rpm, bis die OD 600 erreicht ~ 0,8 gewachsen.
- Die Kultur wird in einem frischen 250 ml Erlenmeyerkolben, wo die Zellen durch Inkubation der Kolben im Wasserbad auf 42 ° C durch vorsichtiges Schütteln bei induziert übertragen180 rpm für 15 min. Unmittelbar nach der Induktion wird die Flasche in einem Eiswasser-Bad Aufschlämmung für mindestens 30 min unter Schütteln inkubiert.
- Das eiskalte Kultur wird sofort in vorgekühlte 50 ml Polypropylen-Röhrchen transferiert und einer Zentrifugation bei 3993 × g für 6 Minuten bei 4 ° C. Das Zellpellet wird in 50 ml eiskaltem sterilen Wasser resuspendiert und erneut zentrifugiert bei 3993 xg für 6 Minuten bei 4 ° C. Das Zellpellet anschließend in 1 ml kaltem Wasser resuspendiert und in einem 1,5 ml Röhrchen Effendorf und zentrifugiert bei maximaler Geschwindigkeit für 20 sec bei 4 ° C. Nach zwei oder drei Waschschritten mit eiskaltem Wasser, wird das Zellpellet schließlich in 700 ul eiskaltem, sterilen Wasser resuspendiert, was in elektro-kompetenten Zellen.
- Durch Elektroporation wird ein ul des gereinigten Amplikon in 40 ul der elektro-kompetenten Zellen eingeführt. 2,5 kV, 25 uF mit Puls: Die Zellen werden in einem Bio-Rad GenePulser II mit folgenden Einstellungen elektroporiertSteuerung von 200 Ω. Nach homologer Rekombination und Integration werden die Transformanten, die erfolgreich rekombiniert das Tag / Kassette in das Chromosom basierend auf Resistenz gegen Kan (Abbildung 1A) ausgewählt ist. Mehrere Transformanten werden für Western Blotting, um die korrekte Erzeugung (dh positive Signal) von SPA-markierte Fusionsproteine mit anti-FLAG M2-Antikörper, die selektiv gegen die FLAG-Epitope des SPA-tag ist verifizieren ausgewählt.
- Bestätigt carboxyterminalen SPA-tag-Fusion-Stamm in großem Maßstab zu löslichem Protein-Komplexen aus geernteten Zellen unter Verwendung des SPA Aufreinigungsprotokolls isolieren kultiviert. Der übersicht der Schritte in dem Reinigungsverfahren Affinitätsmarkierung involviert ist in 1B gezeigt.
2. Kultivierung und Beschallung
- Beimpfen 100 ul einer SPA-markierten E. coli Glycerin Lager in 50 ml Terrific Broth (TB) Flüssigmedium mit 50 ul von 25 ug / ml o ergänztf Kan Lösung in einem 250 ml Erlenmeyerkolben. Die Kultur über Nacht bei 32 ° C.
Anmerkung: Da die Temperatur-induzierbare λ Red Kassette in Stamm DY330 steht unter der Kontrolle eines temperatursensitiven Repressors 10 wird die SPA-markierten E.coli-Stamm bei 32 ° C gezüchtet - Übertragen 10 ml der Übernacht-Kultur in 990 ml frischem TB mit 25 ug / ml Kan in einem 4-Liter-Kolben ergänzt. Die Kultur wird bei 32 ° C unter konstantem Schütteln bei 250 Upm für 5 bis 6 Stunden gezüchtet, bis die OD 600 erreicht auf ~ 2 bis 3 ist.
- Übertragen Sie die 1 Liter E. coli SPA-tag Kultur einer Zentrifugierung Flaschen zu reinigen und Spin der Zellen bei 4 ° C im Beckman Zentrifuge J6-HC @ 3993 × g für 15 min.
- Der Überstand wird von den Flaschen entfernt Zentrifugation. Resuspendieren E. coli-Zellpellets mit 25 ml Beschallungspuffer. Stellen Sie sicher, um die Zentrifugation Flaschen auf Eis zu allen Zeiten zu halten.
- Die resuspendierten Pelletübertragen zu 50 ml Falcon-Röhrchen aus Polypropylen und mit flüssigem Stickstoff eingefroren. Die eingefrorenen Zellen werden bei -80 ° C für die langfristige Verwendung gelagert.
- Vor Beschallung, tauen die gefrorenen Zellen vollständig, indem die Pellets auf Eis. Die aufgetauten Proben werden in ein steriles Edelstahlbecher auf Eis platziert Ultraschallbehandlung übertragen. Die Sonde wird in die Probe eingetaucht und für 3 min mit Ultraschall behandelt. Eine zusätzliche 2 Minuten läßt man die Probe vor Überhitzung zu kühlen.
- Das beschallte Zellysat wird in die vorgekühlte sterile Zentrifugenröhrchen gegeben und einer Zentrifugation bei 4 ° C im Beckman Zentrifuge mit einem Rotor JA-17 @ 35.267 xg (16.000 UpM) 15 min zweimal.
Hinweis: Im Falle der Membran Proteinreinigung, die beschallte Zelllysat nur einmal für 15 min zentrifugiert, weil man nicht weiß, in welcher Fraktion sich die Membranproteine sind, das heißt, entweder im Pellet oder in der Überstandsfraktion. Um zu vermeiden, überschießende Verlust des memMembran-Proteine, drehen wir die Zellen für 15 min bei hoher Geschwindigkeit zentrifugiert und der Überstand wird anschließend zur Reinigung weiterverarbeitet (siehe nachstehend beschrieben), wenn 1% Detergens verwendet wird, um die Membranproteine zu solubilisieren. - Der Überstand der Zentrifugation wird vorsichtig Röhre zu einem 50 ml Polypropylen-Falcon-Röhrchen überführt und mit flüssigem Stickstoff eingefroren. Die beschallte gefrorenen Zellextrakt wird höchstens für einen Zeitraum von 6 Monaten bei -80 ° C für eine spätere Verwendung gespeichert werden.
3. Affinitätsreinigung
- Vor der Verwendung werden 100 ul Anti-Flag-M2-Kügelchen von 10 Volumen AFC-Puffer (30 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1% Detergenz und 0,1-0,5 mM TCEP [Tris (2-carboxyethyl) phosphin gewaschen - Salzsäure]) ohne Reinigungsmittel und das Reduktionsmittel TCEP (Tris (2-carboxyethyl) phosphin).
- Der gefrorene, beschallte Zellextrakt wird, indem das Röhrchen in kaltem Wasser aufgetaut. Die aufgetauten Zellen Extrakt wird mit 3 ul von Benzo inkubiertnase Nuklease 30 Minuten bei 4 ° C. Zu dieser Mischung hinzuzufügen nichtionischen Detergens Triton X-100 (Endkonzentration des Detergens 0,1% betragen sollte) und 200 ul Suspensionen von Anti-Flag-M2-Agarose-Kügelchen.
Anmerkung: Für alle löslichen Proteins Reinigungen, 0,1% Triton X-100 wird verwendet, um nicht-spezifische Adsorption, zu minimieren, wo als zur Reinigung eines Membranproteins, verschiedenen milden nicht-ionischen Detergenzien, wie etwa C12E8 (Octaethylenglykol dodecylether), DDM ( n-Dodecyl β-D-maltosid) und Maltose-Neopentylglykol (MNG) können bei einer 1% Detergens Konzentration eingesetzt werden, um die Solubilisierung zu verbessern. Da verschiedene Wasch variierenden haben Solubilisierung Effizienz der Membranproteine, ist es empfehlenswert, unabhängige Reinigungen Protein mit mehr als einem Detergens durchzuführen. - Der Inhalt wird sanft durch Drehen des Rohres während 3 Stunden bei 4 ° C unter Verwendung eines LabQuake Schüttler gemischt. Nach 3 Stunden der Drehung ist das Rohr bei 1.700 xg für 6 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wird dann rsorgfältig emoved so viel wie möglich, ohne die lose Perlen Pellet.
- Das Pellet wird in dem verbleibenden Überstand resuspendiert und anschließend in einem 0,8 x 4 cm Bio-Rad Polypropylen prep Spalte. Sicherzustellen, um den Bodenauslaß Stopfen aus der Säule zu entfernen, damit sich die Eluate durch Schwerkraft abfließen. Die Säule wird 5 mal mit TEV-Spaltung Schritt.
- Nach dem Ablassen der gewaschenen Eluate wird der untere Auslass der Säule geschlossen. Um die gleiche Spalte wird die Spaltung durch Zugabe ~ 5 bis 10 ul (50 Einheiten) von TEV-Protease und 400 ul 1X AFC-Puffer auf die Säule durchgeführt. Sicherzustellen, um den Kopf der Kolonne mit einer Kappe zu schließen. Die Spalte mit den Perlen vorsichtig gedreht Nacht bei 4 ° C über Nacht mit einem LabQuake Shaker.
- Entfernen der Kappe auf der Oberseite und dem Auslass Stopfen am unteren Ende der Säule, und die Eluate nach dem Drain-TEV-Spaltung in eine frische Säule mit 200 ul Suspensionen von Calmodulin-Sepharose-Kügelchen, die um 10 gewaschen wird zurückgewonnenVolumina von Calmodulin Bindungspuffer.
- Sowohl die Ober-und die Unterseite der Säule dicht befestigt, und der Inhalt in der Kolonne werden sanft durch Drehen für 3 Stunden bei 4 ° C unter Verwendung eines LabQuake Schüttler gemischt.
- Nach 3 Stunden der Drehung wird das Eluat durch Entfernen der oberen Kappe und der unteren Stopfen der Säule abgelassen. Die Spalte wird viermal mit 200 ul 1X Calmodulin Bindungspuffer durch ein stringentes Waschen mit 400 ul Calmodulin Waschpuffer gewaschen.
- Das gebundene Protein wird in vier Fraktionen von 50 ul in ein frisches Eppendorf-Röhrchen mit 1X Calmodulin Elutionspuffer eluiert. Die eluierte Fraktion wird in zwei saubere Eppendorf-Röhrchen in gleichen Volumina verteilt. Sowohl die Rohre anschließend getrocknet unter Verwendung einer Geschwindigkeit Vakuum.
- Das getrocknete Eluat von einem Rohr für den Betrieb eines Silberfärbung Gel verwendet, während die andere in -80 ° C gelagert wird, vor der Verwendung der Massenspektrometrie.
4. Silberfärbung
- Für Silber staining, wird die Hälfte des Volumens von 3X SDS (Natriumdodecylsulfat) Probenpuffer auf 50 ul des getrockneten Eluat gegeben. Nach Kochen der Mischung für 5 min werden die Proben auf einem SDS-Polyacrylamid-Gel geladen.
- Nachdem das Gel ausgeführt wurde, wird es vorsichtig in Fixierlösung gelegt (50% Methanol und 10% Essigsäure) und vorsichtig auf einem Schüttler für 20 min gerührt. Das Gel wird dann in 20% Ethanol für 10 min gespült.
- Die feste Gel wird zweimal gründlich mit 500 ml doppelt destilliertem Wasser für 10 Minuten gewaschen, um niedrige einheitlichen Hintergrund zu gewährleisten.
- Das Gel wird dann vorsichtig in 500 ml Natrium-Thiosulfat für 1 min, gefolgt von zwei Waschschritten mit destilliertem Wasser für 20 Sekunden gefolgt gerührt.
- Das Wasser wird verworfen, und das Gel wird in 200 ml 0,1% Silbernitratlösung für 30 min inkubiert. Nach dieser Zeit wird die Silbernitratlösung entfernt und das Gel mit destilliertem Wasser für 20 sec. gewaschen, um den Überschuss an Silbernitrat entfernen.
- Das Gel wird schließlich in 75 ml Hand geschütteltder Entwicklungslösung. Wenn die gewünschte Intensität erreicht ist, wird die Entwicklungslösung verworfen und 80 ml Essigsäure wird zugegeben, um die Reaktion zu stoppen. Sicherzustellen, um das Gel in Essigsäure für mindestens 20 min für die richtige Darstellung der Gelbanden inkubieren.
5. Proteolyse und Probenvorbereitung für die Massenspektrometrie
- Um der getrockneten Probe werden 50 ul der Verdauung Puffer und 0,9 ul 100 mM TCEP-HCl (Tris (2-Carboxyethyl) phosphin - Salzsäure) und inkubieren Sie die Mischung für 45 min bei Raumtemperatur für den Reduktionsschritt. Anschließend wird 1 ul 500 mM Iodacetamid zugegeben und in dunklen weitere 40 min zur Probe Alkylierung ermöglichen.
- Nach der zweiten Runde der Inkubation geben 1 ug immobilisiertem Trypsin zu dem Gemisch und inkubieren entweder bei 37 ° C für 5 Stunden oder über Nacht bei Raumtemperatur. Stellen Sie sicher, um die Reaktion durch Zugabe von 1 ul Essigsäure stoppen.
- Vornässen Millipore Zip-Tip Pipettenspitze durch Absaugen 10 ul der Benetzung und Äquilibrierungslösung. Verzichten die Lösung zu verschwenden. Anschließend absaugen 10 ul der Waschlösung und verzichten die Lösung zu verschwenden. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.
- Für eine effiziente Bindung des Peptids Mischung bis zur Spitze, mischen Pipette die Peptidmischung 20 mal. Das Peptidgemisch, dass zur Spitze geklebt wird durch Ansaugen und Abgeben der Waschlösung gewaschen. Wiederholen Sie diesen Vorgang zweimal für eine effiziente Bindung des Peptid-Gemisch an der Spitze.
- Mit der Spitze mit dem gebundenen Peptid absaugen 10 ul der Benetzung und Äquilibrierungslösung und verzichten in ein sauberes Eppendorf-Röhrchen. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal. Nach dem Trocknen der eluierten Proben in der Geschwindigkeit Vakuum kann die Proben sofort durch Massenspektrometrie analysiert oder bei -80 ° C vor der Verwendung.
6. Protein Identifizierung durch LTQ Orbitrap Velos Massenspektrometer
The Polypeptid Komponenten der isolierten Komplexe werden anhand eines LTQ Orbitrap Velos Hybrid-Tandem-Massenspektrometer. Die Orbitrap hat außergewöhnliche Auflösungsvermögen (> 60.000 Full Width Half Maximum oder FWHM) und Masse Genauigkeit (<2 ppm), die MS / MS Probenahme von irrelevanten unspezifischen Hintergrund Verunreinigungen unter Kontrolle Reinigungen erkannt minimiert, während die High-Speed-Velos Ionenfalle Komponente erkennt und Fragment niedriger Häufigkeit Peptide unter Verwendung sowohl Elektronentransfer-Dissoziation und Kollisions-induzierte Dissoziation Modi. Hohes Vertrauen Spiele unter resultierenden MS / MS-Spektren mit Referenz E. kartiert coli Protein-Sequenzen mit Datenbank-Suchalgorithmus wie SEQUEST und jeder passenden Sequenz während einer Wahrscheinlichkeit Algorithmus wie STATQUEST 11 ausgewertet. Die gesamte Spektren Zahl Peptidsequenz Einzigartigkeit und gemeinsamen Hintergrund Kontaminanten in negative Kontrolle (dh. Mock) Reinigungen erkannt werden als eine geringe empirische falsch-dis zu erreichenErholung bewerten. Die folgenden Schritte sind für die Protein-Identifizierung durchgeführt:
- Die Mikro-Säulen sind mit ~ 10 cm von 3 um Luna-C 18-Harz gepackt sind und eine Schnittstelle mit einem Proxeon Nanoelektrospray Ionenquelle, die in Übereinstimmung mit dem Instrument Orbitrap platziert wird.
- Eine nano Proxeon Strömung binäre HPLC-Pumpe wird verwendet, um eine stabile Spitze Flussrate von ~ 300 nl min -1 während der Peptidtrennungen liefern.
- Um Peptid-Elution zu erreichen, wird eine organische Puffergradienten bis nach dem Muster der Komplexität gesetzt. Zum Beispiel wird die folgende Gradienten in der Regel bis zum E. eingestellt coli SPA Proben: Lösungsmittel B wird von 2% bis 6% in 1 min erhöht, um 24% in 38 min, bis 100% in den nächsten 4 min, bei 100% für 1 min gehalten, dann sank auf 2% in 1 min, und abschließende Halten bei 2% für 15 min. Die mobile Phase Lösungsmittel A hat 95% HPLC Gradient Wasser und 5% ACN mit 0,1% Ameisensäure, während Lösungsmittel B hat 5% HPLC Gradient Wasser und 95% ACN mit 0,1% Ameisensäure acid. Die Strömungsgeschwindigkeit an der Spitze der Nadel auf 300 nl min -1 für 60 min eingestellt.
- Da die Massenspektrometer Zyklen durch einen vollen Scan Masse bei 60.000 Auflösungen ausführen, werden 10 gleichzeitige Tandem-Massenspektrum Abtastungen für die intensivsten Prekursorionen gesammelt. Dynamische Ausgrenzung, monoisotopische Masse Auswahl und Echtzeit-Daten-abhängigen Akquise-Instrument sind aktiviert.
- Die Spektren werden mit Hilfe einer Datenbank gesucht Suchalgorithmus wie SEQUEST gegen eine Datenbank von E. coli-Protein-Sequenzen, und das Ergebnis wird statistisch filtriert unter Verwendung eines Wahrscheinlichkeitsmodells Algorithmus wie STAQUEST 11, um eine niedrige False Fündigkeitsquote gewährleisten. Nur hohes Vertrauen (99% Wahrscheinlichkeit) Kandidaten ausgewählt, während Spiele zeigen mehr als 10 ppm Masse Fehler im Vergleich zu den theoretischen peptide mass von der weiteren Betrachtung ausgeschlossen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ein wichtiger Aspekt des SPA-basierte APMS hier beschriebene Ansatz ist, dass Tagging innerhalb der natürlichen chromosomalen Kontext durchgeführt wird, wodurch eine normale Genregulation wird beibehalten (dh Muttersprache. Köder Promoter erhalten, damit Expression nicht gestört wird) und native stabil-assoziierten Protein-Komplexe werden bei nahezu endogenen zurückgewonnen. Operon Polarität Probleme werden ebenfalls durch Einschließen eines nach außen gerichteten Promotor in der Selektionsmarker vermieden. Diese SPA-Tagging Ansatz ist effektiv genug, um die Komponenten mit niedrigem Abundanz Komplexen zur Homogenität, einschließlich membranassoziierten Baugruppen, zu reinigen, auch wenn die Untereinheiten auf nur wenigen Molekülen pro Bakterienzelle exprimiert werden. Insgesamt kann dieses Protokoll einfach skaliert-up für Reinigung großer Mengen von markierten löslichen Proteinen in E. coli oder im Prinzip alle anderen bakteriellen Spezies, für die Tagging via Rekombination möglich ist, oder diejenigen, die besitzen natürlich hohen Transformationtion Fähigkeit wie Acinetobacter, einem aufsteigenden Arbeitspferd Bakteriengenetik, die verwendet wurde, zum Beispiel, um eine Bibliothek von Stamm gerichteten Gens Vorprägungen 13 aufzubauen.
Ein wichtiges Anliegen inhärent großflächigen Proteomics ist die Identifikation von nicht-spezifischen promiskuitiven Interaktoren und unechten Spurenverunreinigung. Trotz zwei Runden der Anreicherung, unsere Routine SPA Aufreinigungen regelmäßig detektieren häufigen Verunreinigungen, die üblicherweise hohe Fülle Housekeeping Proteine wie ribosomale Proteine und Chaperonen, die nicht-spezifisch an das chromatographische Harz und / oder Köder-Proteine. Dieses Problem kann auf zweierlei Weise vermindert werden. Zunächst wird die Gesamt-Spektralenergie Anzahl und Einzigartigkeit jedes Protein mit einer bestimmten Köder identifiziert relativ zu einem breiteren Spektrum von Reinigungen von mehreren unabhängigen und von Proteinködern unbezeichnet (dh. Wildtyp) Negativkontrolle Stämmen (dh. Mock Affinitätsreinigung experiments) zu falsch positiven Assoziationen zu minimieren. Zweitens sollten alle Kandidaten-Protein-Wechselwirkungen validiert mit reziproken Tagging und Aufreinigung des putativen Bindungspartner, mit dem Ziel, unabhängig bestätigt einzelne Protein-Protein-Wechselwirkungen auf seltene Fälle, in denen die Präsenz des SPA-tag stört Einarbeitung von nativen Proteinen in vermeiden das endogene Proteinassemblierung.
APMS-basierte Proteomik Umfragen werden durch den Mangel an Sensibilität in Bezug auf die Identifizierung vorübergehend oder substöchiometrischen Interaktionen begrenzt. In solchen Fällen kann einstufiges Reinigungsverfahren zur Detektion von schwächeren Interaktionspartner zu verbessern. Im Laufe unserer laufenden, jahrzehntelangen Erforschung der E. coli Interaktom haben wir gesehen, die Erkennung Fähigkeiten der neuen Generation Massenspektrometer stetig zu verbessern. Ältere Instrumentierung wiederkehrende Identifizierung sehr reichlich Proteine voreingenommen, oft entgegensteht Nachweis von weniger abundant aber potenziell sehr wichtig interagierende Proteine. Umgekehrt Velos die Orbitrap Hybrid-Massenspektrometer verwenden wir derzeit hat sich deutlich verbessert Auflösung, Massengenauigkeit und Empfindlichkeit wodurch wesentlich effizienter, hohen Durchsatz Erkennung geringer Menge Proteine, einschließlich transiente Interaktionen. Schließlich, wenn die Art der Wechselwirkung ist völlig unbekannt, empfehlen wir Forscher: (i) gelten strenge Kriterien, um das Vertrauen Partituren auf alle vermeintlichen Datenbank-Suche Spiele zuweisen. Proteine mit zwei oder mehr einzigartige Peptide sind in der Regel als positiv, vorausgesetzt, jedes Spiel geht mit einem Minimum Wahrscheinlichkeit Schwelle Cut-off von 99% oder höhere Wahrscheinlichkeit, (ii) sicherstellen, um die Spezifität der Kandidaten-Protein Interaktionspartner mit dem markierten Köder aufgenommen zu untersuchen Vergleich zu den Ergebnissen mit Negativkontrolle untagged Stämme (mock Experimente) oder unabhängige Proteinködern erhalten, (iii) wechselseitig bestätigen mögliche Wechselwirkungen, die eine unbekannte Protein von Interest, indem die entsprechende SPA tag Köder Fusion für großflächige Reinigung oder validieren paarweise Wechselwirkungen mit herkömmlichen Co-Immunopräzipitation mit Protein spezifisch oder tag-spezifischen Antikörpern.
Bis heute, mit diesem systematischen Ansatz, haben wir es geschafft, taggen und rund zwei Drittel der ~ 2.750 E. reinigen coli lösliche Proteine, die nachweisbar unter Kulturbedingungen in Vollmedium 1, 2 ausgedrückt. Wir haben auch diesen gleichen grundlegenden Methode geeignet ist, systematisch zu isolieren membranassoziiertes Protein-Komplexen und werden nun versucht, jeden der verbleibenden ~ 1.000 E. reinigen coli-Proteinen vorhergesagt wird membrangebunden. Während die Reinigung von Membranproteinen stellt oft besondere Herausforderungen, da sie oft nicht effizient mit dem Extraktionspuffer solubilisiert, die wir normalerweise für den SPA Methode zu verwenden, ermöglicht die Zugabe von nicht-ionischen Detergenzien in unseren Puffern die Solubilisierung und Reinigung einer Mehrheit der E. coli </ Em> Membranproteine haben wir bisher versucht (Babu et al., Unveröffentlichte Daten).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Mittel aus dem kanadischen Stiftung für Innovation, Genome Canada, Ontario Genomics Institute, Ontario Ministerium für Innovation, und der kanadischen Institutes of Health Research Stipendium JG und AE The Red-exprimierenden E. unterstützt coli-Stamm DY330 war eine Art Geschenk von Donald L. Court (National Cancer Institute, Frederick, MD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| I. Antibiotics | |||
| Kanamycin | Bioshop | #KAN201 | |
| Ampicillin | Bioshop | #AMP201 | |
| 2. Terrific-Broth medium | |||
| Bio-Tryptone | Bioshop | #TRP 402 | |
| Yeast extract | Bioshop | #YEX 555 | |
| Glycerol | Bioshop | #GLY 002 | |
| K2HPO4 | Bioshop | #PPM 302 | |
| KH2PO4 | Bioshop | #PPM 303 | |
| 3. Bacterial Strain and Plasmid | |||
| DY330 | Yu et al. (2000)10 | ||
| pJL148 | Zeghouf et al. (2004)7 | ||
| 4. PCR and Electrophoresis Reagents | |||
| Taq DNA polymerase | Fermentas | # EP0281 | |
| 10 X PCR buffer | Fermentas | # EP0281 | |
| 10 mM dNTPs | Fermentas | # EP0281 | |
| 25 mM MgCl2 | Fermentas | # EP0281 | |
| Agarose | Bioshop | # AGA002 | |
| Loading dye | NEB | #B7021S | |
| Ethidium bromide | Bioshop | # ETB444 | |
| 10X TBE buffer | Thermo Scientific | #28355 | |
| Tris Base | Bioshop | #TRS001 | |
| Boric acid | Bioshop | #BOR001 | |
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | Sigma | # E6768 | |
| DNA ladder | NEB | #N3232L | |
| 5. Plasmid isolation and Clean-up Kits | |||
| Plasmid Midi kit | Qiagen | #12143 | |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | #28104 | |
| 6. PCR and Transformation Equipments | |||
| Thermal cycler | BioRad | iCycler | |
| Agarose gel electrophoresis | BioRad | ||
| Electroporator | Bio-Rad | GenePulser II | |
| 0.2 cm electroporation cuvette | Bio-Rad | ||
| 42 °C water bath shaker | Innova 3100 | ||
| Beckman Coulter TJ-25 centrifuge | Beckman Coulter | TS-5.1-500 | |
| 32 °C Shaker | New Brunswick Scientific, USA | ||
| 32 °C large Shaker | New Brunswick Scientific, USA | ||
| 32 °C plate incubator | Fisher Scientific | ||
| 7. Electrophoresis and Western blotting | |||
| Acrylamide monomer, N,N'- methylenebis-acrylamide | Bio-Rad | #161-0125 | |
| Ammonium persulfate | Bioshop | # AMP001 | |
| n-butanol | Sigma | # B7906 | |
| TEMED | Bioshop | #TEM001 | |
| Whatman No. 1 filter paper | Fischer Scientific | #09-806A | |
| Mini protean 3 cell | Bio-Rad | #165-3301 | |
| iBlot gel transfer device | Invitrogen | #IB1001 | |
| Nitrocellulose membranes | Bio-Rad | #162-0115 | |
| Monoclonal Anti-Flag M2 antibody | Sigma | #F3165 | |
| Horseradish peroxidase | Amersham | #NA931V | |
| Pre-stained protein molecular weight standards | Bio-Rad | #161-0363 | |
| Chemiluminescence reagent | PIERCE | #1856136 | |
| Autoradiography film | Clonex Corp | #CLEC810 | |
| Quick Draw blotting paper | Sigma | #P7796 | |
| C2 platform rocking shaker | New Brunswick Scientific, USA | ||
| 8. Sonication Equipment and Reagents | |||
| Sonicator | Branson Ultrasonic | #23395 | |
| NaCl | Bioshop | #SOD001 | |
| Protease inhibitors | Roche | #800-363-5887 | |
| 0.5 mM TCEP-HCl | Thermo Scientific | #20490 | |
| 9. Affinity Purification Reagents and Equipment | |||
| 0.8 x 4 cm Bio-Rad polypropylene column | Bio-Rad | #732-6008 | |
| Benzonase nuclease | Novagen | #70746 | |
| Anti-FLAG M2 agarose beads | Sigma | #A2220 | |
| Calmodulin-sepharose beads | GE Healthcare | #17-0529-01 | |
| TEV protease | Invitrogen | #12575-015 | |
| Triton X-100 | Sigma | #T9284 | |
| CaCl2 | Sigma | #C2661 | |
| EGTA | Sigma | #E3889 | |
| LabQuake Shaker | Thermolyne | #59558 | |
| 10. Silver Staining Reagents | |||
| Methanol | Bioshop | #MET302 | |
| Acetic acid | Bioshop | t#ACE222 | |
| Sodium-thiosulfate | Sigma | #S-7143 | |
| Silver nitrate | Fischer Scientific | #S181-100 | |
| Formaldehyde | Bioshop | #FOR201 | |
| Sodium carbonate | Bioshop | #SOC512 | |
| 11. Reagents and Equipment for Protein Identification | |||
| Trypsin Gold, Mass Spectrometry Grade | Promega | # V5280 | |
| 50 mM NH4HCO3 | Bioshop | #AMC555 | |
| 1 mM CaCl2 | Bioshop | #CCL302 | |
| Acetonitrile | Sigma | #A998-4 | |
| Formic acid | Sigma | #F0507 | |
| HPLC grade water | Sigma | #95304 | |
| Iodoacetamide | Sigma | #16125 | |
| Millipore Zip-Tip | Millipore | # ZTC18M960 | |
| ~10 cm of 3 μm Luna-C18 resin | Phenomenex | ||
| Proxeon nano HPLC pump | Thermo Fisher Scientific | ||
| LTQ Orbitrap Velos mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| 12. Labware | |||
| 4 liter conical flasks | VWR | #89000-372 | |
| 50 ml polypropylene falcon tubes | Any Vendor | ||
| 1.5 ml micro-centrifuge tubes | Any Vendor | ||
| 250 ml conical flaks | VWR | #29140-045 | |
| 15 ml sterile culture tubes | Thermo Scientific | #366052 | |
| Cryogenic vials | VWR | #479-3221 | |
| -80 °C freezer | Fisher Scientific | #13-990-14 | |
| Speed vacuum system | Thermo Scientific | ||
| Buffers and Solutions 1. 1 liter Terrific Broth (TB) media 11 g Bio-Tryptone 2. Potassium Salt Stock Solution 1.5 M K2HPO4 3. Sonication Buffer 20 mM Tris-HCl (pH 7.9) 4. AFC buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 5. TEV cleavage buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 6. Calmodulin binding buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 7. Calmodulin wash buffer 30 mM Tris-HCl pH 7.9 8. Calmodulin elution buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 9. Developing solution (1L) 37% Formaldehyde 10. Digestion buffer 50 mM NH4HCO3 11. Wetting and Equilibration solution 70% acetonitrile (ACN) in 0.1% formic acid 12. Washing solution 100% H2O in 0.1% formic acid |
|||
References
- Butland, G., et al. Interaction network containing conserved and essential protein complexes in Escherichia coli. Nature. 433, 531-537 (2005).
- Hu, P., Janga, S. C., Babu, M., Diaz-Mejia, J. J., Butland, G. Global functional atlas of Escherichia coli encompassing previously uncharacterized proteins. PLoS Biol. 7, e1000096 (2009).
- Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, 637-643 (2006).
- Mak, A. B., et al. A lentiviral functional proteomics approach identifies chromatin remodeling complexes important for the induction of pluripotency. Mol. Cell Proteomics. 9, 811-823 (2010).
- Polanowska, J., et al. Tandem immunoaffinity purification of protein complexes from Caenorhabditis elegans. Biotechniques. 36, 778-782 (2004).
- Veraksa, A., Bauer, A., Artavanis-Tsakonas, S. Analyzing protein complexes in Drosophila with tandem affinity purification-mass spectrometry. Dev. Dyn. 232, 827-834 (2005).
- Zeghouf, M., et al. Sequential Peptide Affinity (SPA) system for the identification of mammalian and bacterial protein complexes. J. Proteome Res. 3, 463-468 (2004).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat. Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).
- Yu, D., et al. An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 5978-5983 (2000).
- Kislinger, T., et al. PRISM, a generic large scale proteomic investigation strategy for mammals. Mol. Cell Proteomics. 2, 96-106 (2003).
- Vlasblom, J., et al. GenePro: a Cytoscape plug-in for advanced visualization and analysis of interaction networks. Bioinformatics. 22, 2178-219 (2006).
- de Berardinis, V., et al. A complete collection of single-gene deletion mutants of Acinetobacter baylyi ADP1. Mol. Syst. Biol. 4, 174 (2008).
- Babu, M., et al. Sequential peptide affinity purification system for the systematic isolation and identification of protein complexes from Escherichia coli. Methods Mol. Biol. 564, 373-400 (2009).
