Summary
טיהור זיקה של חלבונים מתויגים בשילוב עם ספקטרומטריית מסה (APMS) היא שיטה רבה עצמה למיפוי השיטתי של רשתות אינטראקצית חלבון ועל חקירת הבסיס המכאני של תהליכים ביולוגיים. כאן, אנו מתארים פפטיד הליך אופטימיזציה רציפת זיקה (SPA) APMS פתח לחיידק
Abstract
מאחר שרוב התהליכים תאיים מתווכים על ידי אסיפות macromolecular, זיהוי השיטתי של אינטראקציות בין חלבונים (PPI) וזיהוי של רכב המקטע של חלבון רב קומפלקסים יכולים לספק תובנות לגבי תפקוד גן ולשפר את ההבנה של מערכות ביולוגיות 1, 2. אינטראקציות גופניות יכולות להיות ממופות עם בידוד גבוה ביטחון vialarge היקף ואפיון של קומפלקסי חלבונים אנדוגניים בתנאים כמעט פיסיולוגיים המבוססים על טיהור זיקה של חלבונים מתויגים-כרומוזומלית בשילוב עם ספקטרומטריית מסה (APMS). גישה זו יושמה בהצלחה באורגניזמים אבולוציונית מגוונים, כולל שמרים, זבובים, תולעים, תאי יונקים, וחיידקים 1-6. בפרט, לנו שנוצרנו מערכת תיוג כפולה זיקת Carboxy-מסוף פפטיד סדרתית (SPA) לקומפלקסי חלבוני ילידי זיקה לטיהור מחיידקי Escherichia גרם שלילי בתרבית, באמצעות geזני netically-צייתנים מארחים מעבדה שמתאימה היטב לחקירות הגנום של הביולוגיה הבסיסית ותהליכים משתמרים של 1 פרוקריוטים, 2, 7. מערכת ספא התיוג שלנו היא מקבילה לשיטת טיהור הזיקה מקביל פותחה במקור עבור שמרים 8, 9, והוא מורכב מcalmodulin מחייב פפטיד (CBP) ואחריו אתר המחשוף לטבק וירוס לחרוט (TEV) פרוטאז מאוד הספציפי ושלושה עותקים דגל epitope (FLAG 3X), ומאפשר לשני סיבובים רצופים של העשרת זיקה. לאחר הגברת קלטת, מוצרי PCR יניארי רצף ספציפי קידוד SPA-התג וסמן בחירה משולבים ובאים לידי ביטוי במסגרת כמו fusions Carboxy-מסוף בDY330 רקע שמושרה transiently לבטא מערכת יעילה ביותר Heterologous bacteriophage מבדה רקומבינציה 10. טיהור כפולה צעד בעקבות שימוש בחרוזי זיקה אנטי FLAG calmodulin ומאפשרת סלקטיביתוהחלמה יעילה של קומפלקסי חלבונים אפילו שפע נמוכים מתרבויות בקנה מידה גדולה. טנדם ספקטרומטריית מסה לאחר מכן נעשתה שימוש כדי לזהות את החלבונים ביציבות שיתוף לטיהור עם רגישות גבוהה (מגבלות זיהוי Nanogram נמוכות).
כאן, אנו מתארים את תהליכי צעד אחר צעד מפורטים אנחנו בדרך כלל משתמשים לתיוג חלבון, טיהור ושיטתית ניתוח ספקטרומטריית מבוססת של קומפלקסי חלבונים מסיסים מE. חיידק, שניתן לשנות את הגודל ופוטנציאל מותאם למיני חיידקים אחרים, כוללים פתוגנים מסוימים אופורטוניסטיים נוחות לrecombineering. האינטראקציות הפיזיות הנובעות לעתים קרובות יכולות לחשוף מרכיבים בלתי צפויים וחיבורים מעניינים המצביעים על קישורים מכניסטית רומן. אינטגרציה של נתוני PPI עם נתוני עמותה מולקולריים חלופיים כגון אינטראקציות גנטיות (גני גן) וגנומי להקשר (GC) תחזיות יכולות להקל הבהרה של הארגון המולקולרי הגלובלי של מתחמים רבים בחלבונים בתוך דומסלולי ological. הרשתות נוצרו עבור E. coli ניתן להשתמש כדי לקבל תובנה האדריכלות הפונקציונלית של מוצרי הגן orthologous בחיידקים אחרים שלהסברים פונקציונליים כרגע חסרים.
Protocol
1. בניית SPA תיוג ג'ין הספציפי בE. DY330 זני חיידק
- PJL148 פלסמיד הכולל את רצף הדנ"א SPA-תג וקלטת kanamycin אנטיביוטיקת התנגדות סמן (קאן R) משמש כתבנית בתגובת שרשרת פולימרז (PCR) הגברה 7. פריימר 45 nt גן ספציפי קדימה, הממוקם באופן מיידי במעלה זרם של קודון עצירת גן המטרה במסגרת עם 27 פריימר נ"ב (-3 5'-AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG ') תג מסוים קדימה, ופריימר 45 nt גן ספציפי הפוך, הממוקמים באופן מיידי במורד זרם של קודון עצירת גן המטרה במסגרת עם פריימר הפוך תג מסוים 27 נ"ב (-3 5'-GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT '), משמש כדי להגביר SPA-התג וקלטת R קאן מpJL148 באמצעות התנאים הבאים PCR האופניים: 94 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; 30 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות, 55 ° C עבור 1 דקות, 68 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות 10 שניות, ואחריו 68 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. רצפים אלה משמשים מוגבריםשל מצעים לλ-Red ההומולוגי רקומבינציה המכונות הציגו ectopically (ראה להלן).
- מוצר ה-PCR הוא מטוהר באמצעות ערכת טיהור PCR Qiaquick להסיר מלחים שעשויים להפריע לelectroporation. מוצר ה-PCR המטוהרים הוא ממוקד לאחר מכן לשלב בקצה 3 '(מייד במעלה זרם של קודון העצירה המקורית) של גן ספציפי בDY330 מתח שבו מכונות רקומבינציה-λ האדומות באו לידי ביטוי 10.
- DY330 הזן מבטא λ-האדום הוא גדל בלילה 2 וריא-Bertani בינוני מ"ל (LB) בשעת 32 ° C על ידי רועד ב 180 סל"ד. 1 מ"ל של תרבות הלילה הוא מחוסן לאחר מכן לתוך מדיום LB 70 מ"ל טרי בבקבוק 500 מיליליטר חרוטים. הבידוד הוא גדל ב 32 ° C על ידי רועד ב 180 סל"ד עד 600 OD מגיע ~ 0.8.
- התרבות מועברת לבקבוק 250 מיליליטר חרוטים טרי, שבו התאים הנגרמים על ידי דוגר את הבקבוק באמבט מים ב 42 ° C על ידי רועד בעדינות180 סל"ד במשך 15 דקות. מייד לאחר הגיוס, שמכל ההדגרה באמבט מי קרח slurry לפחות 30 דקות עם רעד.
- התרבות הקרה כקרח מועברת באופן מיידי לצינור פוליפרופילן מראש מקורר 50 מ"ל ונתונים לצנטריפוגה XG ב 3993 עבור 6 דקות ב 4 ° C. התא הגלול הוא resuspended במי 50 מ"ל קר כקרח סטרילית וcentrifuged שוב ב3993 XG ל6 דקות ב 4 ° C. התא היא גלולה אז resuspended ב 1 מ"ל של מים קרים והועברה לצינור 1.5 מ"ל Effendorf, וcentrifuged במהירות מרבית ל20 שניות ב 4 ° C. לאחר שניים או שלושה צעדי שטיפה במים קרים כקרח, התא הגלול הוא resuspended לבסוף ב700 μl של מים סטריליים קרים כקרח, וכתוצאה מכך תאי אלקטרו מוסמכים.
- באמצעות electroporation, μl אחד amplicon המטוהר מוחדר 40 μl של תאי אלקטרו המוסמכים. תאי electroporated בBio-Rad GenePulser שני עם ההגדרות הבאות: 2.5 ק, 25 μF עם דופקבקר של 200 Ω. לאחר הומולוגיים רקומבינציה ואינטגרציה, את transformants שrecombined התג / קלטת לכרומוזום בהצלחה הם מבוססים על התנגדות לקאן (איור 1 א). transformants המרובה נבחר למערב סופג כדי לאמת את הדור הנכון (כלומר איתות חיובית) של ספא בתיוג חלבוני היתוך עם נוגדן אנטי-M2 דגל שהוא סלקטיבי נגד אפיטופים דגל SPA-התג.
- זן אשר Carboxy מסוף SPA-תג היתוך בתרבית בקנה מידה גדולה לבודד מתחמי חלבון מסיסים מתאים נקצרו באמצעות פרוטוקול טיהור הספא. המתווה של השלבים הכרוכים בהליך טיהור תג הזיקה מוצגת בתרשים 1B.
2. Culturing וSonication
- לחסן 100 μl של ה-SPA מתויג מניית גליצרול coli לתוך 50 מיליליטר מרק נהדר (TB) נוזל בתוספת 50 μl של 25 מיקרוגרם / המ"ל oפתרון f קאן בבקבוק 250 מיליליטר חרוטים. לגדול תרבות הלילה ב 32 ° C.
הערה: מאחר שהקלטת האדומה טמפרטורה המושרית λ במתח DY330 היא תחת השליטה של repressor רגיש לטמפרטורה 10, זן ספא מתויג-E. coli הוא גדל ב 32 ° C. - העברת 10 מ"ל של תרבות הלילה לשחפת טריה 990 מ"ל בתוספת 25 מיקרוגרם / מ"ל של קן בבקבוק 4 ליטר. התרבות היא גדלה ב 32 ° C עם הרעד קבוע ב 250 סל"ד, ל5-6 שעות, עד שמגיע לOD 600 ~ 2 עד 3.
- להעביר 1 הליטר E. coli תרבות ספא תג לנקות בקבוקי צנטריפוגה ולסובב את התאים ב 4 ° C בקמן J6-HC צנטריפוגה @ 3993 XG במשך 15 דקות.
- Supernatant הוא להסיר את בקבוקי צנטריפוגה. Resuspend E. כדורים סלולריים coli עם 25 מ"ל של חיץ sonication. ודא לשמור את בקבוקי צנטריפוגה על קרח בכל העת.
- Resuspended הגלולה היאהועבר לצינור 50 מ"ל פוליפרופילן פלקון והוקפא באמצעות חנקן נוזלי. התאים הקפואים מאוחסנים ב-80 ° C לשימוש לטווח ארוך.
- לפני sonication, להפשיר את התאים הקפואים לחלוטין על ידי שמירה על את הכדורים על קרח. הפשירו הדגימות מועברות לכוס נירוסטה סטרילית הונחה על קרח לsonication. החללית היא שקועה לתוך המדגם וsonicated ל3 דקות. 2 דקות נוספות מותר לקרר את הדגימה מהתחממות יתר.
- Lysate התא sonicated מועבר לתוך צינור צנטריפוגה סטרילית מראש המצונן, ונתונים לצנטריפוגה ב 4 ° C בצנטריפוגה קמן באמצעות-17 JA הרוטור @ 35267 XG (16,000 סל"ד) במשך 15 דקות פעמים.
הערה: במקרה של טיהור חלבוני קרום, lysate התא sonicated הוא centrifuged רק פעם אחת במשך 15 דקות כי אנחנו לא יודעים שבחלק מהחלבונים בממברנה הם, כי הוא, או בגלולה או בשבריר supernatant. אז כדי למנוע אובדן עודף של ממחלבוני brane, אנחנו לסובב את התאים למשך 15 דקות בצנטריפוגה במהירות גבוהה וsupernatant הוא המשך עיבוד לטיהור (ראה הנחיות בהמשך) שבו חומר ניקוי 1% משמש לsolubilize את החלבונים בממברנה. - Supernatant מצינור צנטריפוגה מועבר בזהירות לצינור 50 מ"ל פוליפרופילן פלקון והוקפא באמצעות חנקן נוזלי. תמצית התא קפואה sonicated מאוחסנת לתקופה מקסימלית של 6 חודשים ב-80 ° C לשימוש עתידי.
3. טיהור זיקה
- לפני שימוש, 100 μl של חרוזי M2 אנטי דגל נשטפים על ידי 10 כרכים של ה-AFC חיץ (30 mM טריס-HCl, 150 mM NaCl, 0.1% חומרי ניקוי, והמ"מ TCEP 0.1-0.5 [טריס (2-carboxyethyl) phosphine - חומצה הידרוכלורית]) ללא חומר הניקוי וצמצום הסוכן TCEP (טריס (2-carboxyethyl) phosphine).
- תמצית התא קפואה, sonicated מופשרת על ידי נחת הצינור במים קרים. תמצית התא המופשר הוא מודגרות עם 3 μl של benzonase nuclease למשך 30 דקות ב 4 ° C. לתערובת זו, להוסיף חומר ניקוי לא יוני טריטון X-100 (ריכוז סופי של חומר הניקוי צריך להיות 0.1%) ו 200 השעיות μl של חרוזים נגד דגל M2 agarose.
הערה: לכל החלבון המסיס בטהרה, 0.1% Triton X-100 משמשים כדי למזער ספיחה לא ספציפית, שבו כמו לטיהור חלבון קרום, חומרי ניקוי שונים קלים שאינם יוניים, כגון C12E8 (אתר dodecyl גליקול Octaethylene), DDM ( n-Dodecyl β-D-maltoside) ומלטוז-neopentyl גליקול (MNG) ניתן להשתמש בחומר ניקוי 1% ריכוז כדי לשפר solubilization. מאז חומרי ניקוי שונים שמשתנים יעילות solubilization של חלבונים בממברנה, מומלץ לבצע טהרת חלבון עצמאית באמצעות חומר ניקוי יותר מפעם אחת. - התוכן הוא מעורב בעדינות על ידי ההחלפה של הצינור עבור 3 שעות ב 4 ° C באמצעות LabQuake מטרף. לאחר 3 שעות של סיבוב, צינור centrifuged ב1700 XG ל6 דקות. Supernatant הוא ולאחר מכן removed בזהירות, עד כמה שניתן, מבלי להפריע לגלולת החרוז הרופפת.
- הגלולה היא resuspended בsupernatant שנותר ולאחר מכן הועברה ל0.8 4 עמודת x סנטימטר Bio-Rad פוליפרופילן הכנה. ודא להסיר את התקעים לשקע תחתית הטור, כדי לאפשר את eluates לניקוז על ידי זרימת כוח הכביד. לשטוף את העמודה 5 פעמים עם צעד המחשוף TEV.
- לאחר ייבוש eluates הרחוץ, שקע תחתית העמודה סגור. לאותה העמודה, מחשוף מבוצע על ידי הוספה ~ 5-10 μl (50 יחידות) של פרוטאז TEV ו400 μl של חיץ AFC 1X על העמודה. ודא כדי לסגור את החלק העליון של העמודה עם כובע. העמודה המכילה את החרוזים מסובבים בעדינות בין הלילה ב 4 ° C למשך הלילה באמצעות LabQuake מטרף.
- הסר את הכובע על הראש והתקע לשקע בתחתית הטור, ולנקז את eluates התאושש לאחר מחשוף TEV לטור טרי מכיל 200 השעיות μl של חרוזי calmodulin-sepharose, שנשטפה על ידי 10כרכים של חיץ מחייב calmodulin.
- שניהם העליונים והתחתונים של העמודה מהודקות בחוזקה, ואת התוכן בעמודה מעורבב בעדינות על ידי החלפה ל3 שעות ב 4 ° C באמצעות LabQuake מטרף.
- לאחר 3 שעות של סיבוב, eluate מנוקז על ידי הסרת המכסה העליון ותקע תחתית הטור. הטור הוא שטף ארבע פעמים עם 200 μl של חיץ מחייב 1X calmodulin אחרי שטיפה קפדנית 1 עם 400 μl של חיץ לשטוף calmodulin.
- החלבון הוא המאוגד eluted בארבעה חלקים של 50 μl בצינור אפנדורף טרי באמצעות חיץ 1X calmodulin elution. שבריר eluted מופץ בשני צינורות Eppendorf נקיים בכמויות שווות. שני הצינורות הם יבשים לאחר מכן באמצעות ואקום מהירות.
- Eluate המיובש מצינור אחד משמש להפעלת ג'ל כסף מכתים, ואילו השני הוא מאוחסן ב-80 ° C, לפני השימוש בספקטרומטריית מסות.
4. כתמי כסף
- לכסף staining, חצי נפח 3X חיץ המדגם SDS (סולפט dodecyl נתרן) הוא הוסיף 50 μl של eluate המיובש. לאחר רתחת התערובת במשך 5 דקות, הדגימות מועמסות על ג'ל SDS polyacrylamide.
- לאחר סיום פעולתו ג'ל, הוא הניח בזהירות לתוך תמיסת קיבוע (מתנול 50% וחומצה אצטית 10%) והנסער בעדינות על שייקר סיבובי במשך 20 דקות. אז ג'ל נשטף באתנול 20% למשך 10 דקות.
- ג'ל רחץ הקבוע פעמים ביסודיות עם 500 מ"ל של מים מזוקקים פעמים למשך 10 דקות, כדי להבטיח רקע אחיד נמוך.
- אז ג'ל נסער בעדינות נתרן תיוסולפט 500 מ"ל לדקה 1, ואחרי שני צעדי שטיפה במים מזוקקים ל20 שניות.
- המים שנזרקו, וג'ל הוא מודגרות ב200 מ"ל של 0.1% כסף חנק למשך 30 דקות. לאחר הזמן, הכסף חנק מוסר וג'ל רחץ במים מזוקקים למשך 20 שניות כדי להסיר את עודפי הכסף חנק.
- ג'ל לבסוף יד נסער ב75 מ"להפתרון של הפיתוח. כאשר העצמה הרצויה מושגת, פתרון הפיתוח נמחק ו80 מ"ל של חומצה אצטית נוסף כדי לעצור את התגובה. ודא כדי לדגור ג'ל בחומצה אצטית למינימום של 20 דקות להדמיה תקינה של להקות ג'ל.
5. Proteolysis ודוגמא הכנה להמונית ספקטרומטריית
- לדוגמא המיובשת, להוסיף 50 μl של חיץ העיכול ו0.9 μl של 100 מ"מימ TCEP-HCl (טריס (2-carboxyethyl) phosphine - חומצה הידרוכלורית) ו דגירה את התערובת במשך 45 דקות בטמפרטורת חדר עבור שלב הירידה. בשלב בא, μl 1 מתוך iodoacetamide mM 500 מוסיף ודגר בחושך במשך 40 דקות נוספות כדי לאפשר לאלקילציה מדגם.
- לאחר הסיבוב השני של דגירה, להוסיף מיקרוגרם 1 מתוך טריפסין המשותק לתערובת ולדגור גם על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 שעות או למשך הלילה בטמפרטורת חדר. ודא כדי לעצור את התגובה על ידי הוספת μl 1 של חומצה אצטית.
- טרום הרטוב Millipoמיקוד-עצה מחדש קצה פיפטה ידי aspirating 10 μl של פתרון איזון וההרטבה. לוותר פתרון לטמיון. כתוצאה מכך לשאוב 10 μl של פתרון הכביסה ולוותר פתרון לטמיון. חזרו על פעולה זו פעמים.
- לכריכה יעילה של תערובת פפטיד לקצה, פיפטה לערבב את תערובת פפטיד 20 פעמים. תערובת פפטיד שדבק בקצה היא שטפה את ידי aspirating וניפוק פתרון הכביסה. חזור על תהליך זה פעמים לכריכה יעילה של תערובת פפטיד לקצה.
- עם קצה המכיל את פפטיד המאוגד, לשאוב 10 μl של פתרון איזון וההרטבה, ולוותר לתוך צינור Eppendorf נקי. חזור על פעולה זו פעמים. לאחר ייבוש דגימות eluted בואקום מהירות, הדגימות ניתן לנתח באופן מיידי על ידי ספקטרומטריית מסה או מאוחסנות ב-80 ° C לפני שימוש.
6. זיהוי חלבון על ידי LTQ Orbitrap לוס ההמוני ספקטרומטר
הדואר רכיבי פוליפפטיד של המתחמים המבודדים מזוהים באמצעות ספקטרומטר LTQ Orbitrap לוס ההיברידי טנדם המוני. Orbitrap יש כוח יוצא דופן לפתרון (> 60000 מרביים מלא רוחב חצי, או FWHM) ודיוק מסה (<2 עמודים לדקה) שממזער דגימת MS / MS של מזהמים שאינם ספציפיים רקע לא רלוונטיים שאותרו בטהרת בקרה, תוך מלכודת המהירות הגבוהה ולוס היון רכיב יכול לזהות ופפטידים שפע נמוכים בר באמצעות שני אלקטרוני העברת מצבי התנגשות מושרה דיסוציאציה דיסוציאציה ו. התאמות ברמת ודאות גבוהה בין MS כתוצאה / MS ספקטרום ממופות להתייחסות E. רצפי חלבוני coli באמצעות אלגוריתם חיפוש מסד נתונים כמו SEQUEST וכל רצף התאמה הוערך במהלך אלגוריתם הסתברות כמו 11 STATQUEST. סה"כ מספר ספקטרום ייחוד, פפטיד רצף ומזהמי רקע משותפים אותרו בשליטה שלילית (כלומר. מדומה) טהרה נחשבים להשגה שגויה דיס האמפירי נמוךשיעור covery. השלבים הבאים מבוצעים לזיהוי חלבון:
- מייקרו העמודות עמוסות ~ 10 סנטימטר של 3 מיקרומטר לון-C 18 ושרף הם interfaced למקור יון nanoelectrospray Proxeon הממוקם בקו אחד עם מכשיר Orbitrap.
- משאבת Proxeon ננו זרימת ינארי HPLC משמשת כדי לספק קצב זרימה יציב של קצה ~ 300 nl דקות -1 בהפרדות פפטיד.
- כדי להשיג elution פפטיד, שיפוע חיץ אורגני מוגדר בהתאם למורכבות המדגם. לדוגמה, השיפוע הבא מוגדר בדרך כלל עבור E. דגימות SPA coli: B ממס עלה מ 2% עד 6% בדקות 1, עד 24% ב38 דקות, עד 100% ב 4 דקות הבאות, שנערכו ב 100% ל1 דקות, ולאחר מכן ירד ל 2% בדקות 1, ואחרון להחזיק ברמה של 2% במשך 15 דקות. השלב הנייד ממס יש 95% מי HPLC שיפוע ו5% ACN עם חומצה פורמית 0.1%, ואילו ב 'ממס יש 5% מי HPLC שיפוע ו95% ACN עם 0.1% פורמית ACIד. קצב הזרימה בקצה המחט מוגדר עד 300 דקות nl -1 עבור 60 דקות.
- ככל שמחזורי ספקטרומטר המסה להפעיל באמצעות סריקה המונית אחד מלאה בהחלטות 60000, 10 סריקות המוניות פיצול טנדם נלוות נאספות ליונים המבשרים האינטנסיביים ביותר. הדרה דינמית, סלקציה המונית monoisotopic, ותכונות בזמן אמת נתונים תלויי רכישת מכשיר מופעלת.
- הספקטרומים חפשו באמצעות אלגוריתם חיפוש של מסד נתונים כמו SEQUEST מול מסד נתונים של ה רצפי coli חלבון, והתוצאה הם מסוננים באמצעות אלגוריתם סטטיסטי הסתברות כגון 11 STAQUEST כדי להבטיח שיעור גילוי שווא נמוך. רק אמון גבוה (99% הסתברות) מועמדים נבחרים, ואילו התאמות מראות שגיאה המונית יותר מ 10 עמודים לדקה בהשוואה למסת פפטיד התיאורטית מסולקות משיקול נוסף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
היבט מרכזי של גישת APMS ספא המבוססת המתוארים כאן הוא שהתיוג מתבצע במסגרת כרומוזומלית הטבעית, ובכך להבטיח רגולציה של גנים נורמליות נשמר (כלומר אמרגן פיתיון ילידים. נשמר, ומכאן רמות הביטוי אינה מוטרדות) וילידים הקשורים ביציבות קומפלקסי חלבונים הם התאוששו ברמה קרובה לאנדוגניים. נושאי קוטביות אופרון גם הם נמנעו על ידי כולל אמרגן כלפי חוץ בכיוון בסמן הבחירה. גישה זו SPA התיוג היא יעילה מספיק כדי לטהר את הרכיבים של קומפלקסים נמוכי שפע להומוגניות קרובה, כוללים מכלולי קרום קשור, גם אם את היחידות לידי ביטוי עד רק כמה מולקולות לתא חיידק. באופן כללי, פרוטוקול זה יכול להיות בקלות מוגדלת לטיהור גדולה סטים של חלבונים מסיסים מתויגים בE. חיידק או בעיקרון transforma כל מין אחר לחיידקים שהתיוג באמצעות recombineering אפשרי, או את אלה שposses גבוה באופן טבעייכולת tion, כמו Acinetobacter, סוס עבודה מתפתחת של גנטיקה של חיידקים, שכבר משמש, למשל, לבניית ספריית זן של knockouts גן ממוקד 13.
חשש טבוע גישות proteomic בקנה מידה גדולה מרכזי הוא זיהוי של interactors אינו ספציפיים המופקרים וזיהום עקבות מזויף. למרות שני סיבובים של העשרה, טהרת SPA השגרתית שלנו מזהה באופן קבוע מזהמים תכופים שהן בדרך כלל חלבוני משק בית גבוה שפע, כגון חלבוני ריבוזומלי ומלווים, שאינם נקלטים באופן ספציפי לשרף הכרומטוגרפיה וחלבונים / או פיתיון. בעיה זו יכולה להיות מתנה בשתי דרכים. ראשית, המספר הכולל של רוח הרפאים וייחודו של כל חלבון מזוהה עם פיתיון בפרט נחשבו יחסית למגוון רחב יותר של טהרה של פיתיונות חלבון שאינם קשורים מרובים ומ( כלומר. סוג פרוע) לא מתויג זני בקרה שליליים (כלומר. Exper טיהור זיקה המדומהiments) כדי לצמצם אסוציאציות חיוביות כוזבות. שנית, כל אינטראקציות חלבון המועמד צריכות להיות מאומתות באמצעות תיוג וטיהורו של השותף מחייב המשוער הדדיים, במטרת אינטראקציות אישיות באופן עצמאי המאשרים חלבונים כדי להימנע ממקרים נדירים שבם הנוכחות של SPA-תג perturbs שילוב של חלבונים לילידים הרכבת החלבון אנדוגני.
סקרי proteomic APMS מבוססים מוגבלים על ידי חוסר הרגישות במונחים של זיהוי אינטראקציות חולפות או תת stoichiometric. במקרים כאלה, הליכי טיהור יחידה צעדים יכולים לשמש כדי לשפר את זיהוי של שותפי אינטראקציה חלשות. במהלך המחקר המתמשך שלנו, העשור הארוך של א ' coli interactome, שראינו את יכולות זיהוי של ספקטרומטרים המוניים הדור החדשים לשפר בהתמדה. מכשור ישן יותר מוטה לזיהוי חוזר של חלבונים הנפוצים ביותר, ולעתים קרובות המונע זיהוי של אבו פחותחלבוני ndant אבל פוטנציאל חשובים מאוד באינטראקציה. לעומת זאת, Orbitrap לוס ספקטרומטר מסה ההיברידית אנו משתמשים כיום יש רזולוציה השתפרה במידה ניכרת, דיוק המוני, ובכך מאפשרים זיהוי רגישות הרבה יותר יעיל, תפוקה גבוהה של חלבוני שפע נמוכים, כוללים אינטראקציות חולפות. לבסוף, אם אופי האינטראקציה הוא ידוע לחלוטין אנו ממליצים לחוקרים: (i) להחיל קריטריונים מחמירים כדי להקצות עשרות ביטחון לכל משחקי חיפוש במאגר המשוערים. חלבונים עם שניים או יותר פפטידים ייחודיים נחשבים בדרך כלל חיובי, בהנחה שכל משחק עובר בסף סבירות מינימום חתוך של 99% או הסתברות גדולה יותר (ii) לוודא לבחון את הספציפיות של interactors חלבון המועמד הקליטו עם הפיתיון מתויג ב השוואה לתוצאות שהושגו עם זנים שליליים בקרה לא מתויגים (ניסויים מדומים) או פיתיונות חלבון שאינם קשורים, (iii) מאשרת הדדית אינטראקציות פוטנציאליות המכילות חלבון לא ידוע של ביןest ידי יצירת ההיתוך המקביל SPA תג הפיתיון לטיהור בקנה מידה גדולה או לאמת אינטראקציות זוג חכמים באמצעות שיתוף immunoprecipitation המסורתי עם חלבון או נוגדנים ספציפיים תג ספציפיים.
נכון להיום, שימוש בגישה המערכתית הזו, שהצלחנו לתייג ולטהר סביב שני שלישים מ~ 2750 E. חלבונים מסיסים coli שהביעו detectably תחת התרבות במדיום עשיר 1, 2. יש לנו גם להתאים אותה שיטה בסיסית זה באופן שיטתי לבודד קומפלקסי חלבוני קרום הקשורים, וכעת הם מנסים לטהר את כל אחד מהנותרים ~ 1000 E. חלבוני coli צפוי להיות מחויב הממברנה. בעוד הטיהור של חלבונים בממברנה לעתים קרובות מציבה אתגרים ייחודיים משום שהם לעתים קרובות לא solubilized יעילות על ידי חיץ החילוץ שאנו נוהגים להשתמש בשיטת SPA, התוספת של חומרי ניקוי שאינם יוניים למאגרים שלנו מאפשרת solubilization והטיהור של רוב ה coli </ Em> חלבוני קרום שניסינו עד כה (באבו et al., נתונים שלא פורסמו).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי כספים מהקרן הקנדית עבור חדשנות, הגנום קנדה, אונטריו מכון Genomics, אונטריו משרד החדשנות, ומכון הקנדי לבריאות מחקר המענק לJG ו AE אדום מבטא א coli הזן DY330 היה מתנה מסוג דונלד ל בית המשפט (המכון הלאומי לסרטן, פרדריק, מרילנד).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| I. Antibiotics | |||
| Kanamycin | Bioshop | #KAN201 | |
| Ampicillin | Bioshop | #AMP201 | |
| 2. Terrific-Broth medium | |||
| Bio-Tryptone | Bioshop | #TRP 402 | |
| Yeast extract | Bioshop | #YEX 555 | |
| Glycerol | Bioshop | #GLY 002 | |
| K2HPO4 | Bioshop | #PPM 302 | |
| KH2PO4 | Bioshop | #PPM 303 | |
| 3. Bacterial Strain and Plasmid | |||
| DY330 | Yu et al. (2000)10 | ||
| pJL148 | Zeghouf et al. (2004)7 | ||
| 4. PCR and Electrophoresis Reagents | |||
| Taq DNA polymerase | Fermentas | # EP0281 | |
| 10 X PCR buffer | Fermentas | # EP0281 | |
| 10 mM dNTPs | Fermentas | # EP0281 | |
| 25 mM MgCl2 | Fermentas | # EP0281 | |
| Agarose | Bioshop | # AGA002 | |
| Loading dye | NEB | #B7021S | |
| Ethidium bromide | Bioshop | # ETB444 | |
| 10X TBE buffer | Thermo Scientific | #28355 | |
| Tris Base | Bioshop | #TRS001 | |
| Boric acid | Bioshop | #BOR001 | |
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | Sigma | # E6768 | |
| DNA ladder | NEB | #N3232L | |
| 5. Plasmid isolation and Clean-up Kits | |||
| Plasmid Midi kit | Qiagen | #12143 | |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | #28104 | |
| 6. PCR and Transformation Equipments | |||
| Thermal cycler | BioRad | iCycler | |
| Agarose gel electrophoresis | BioRad | ||
| Electroporator | Bio-Rad | GenePulser II | |
| 0.2 cm electroporation cuvette | Bio-Rad | ||
| 42 °C water bath shaker | Innova 3100 | ||
| Beckman Coulter TJ-25 centrifuge | Beckman Coulter | TS-5.1-500 | |
| 32 °C Shaker | New Brunswick Scientific, USA | ||
| 32 °C large Shaker | New Brunswick Scientific, USA | ||
| 32 °C plate incubator | Fisher Scientific | ||
| 7. Electrophoresis and Western blotting | |||
| Acrylamide monomer, N,N'- methylenebis-acrylamide | Bio-Rad | #161-0125 | |
| Ammonium persulfate | Bioshop | # AMP001 | |
| n-butanol | Sigma | # B7906 | |
| TEMED | Bioshop | #TEM001 | |
| Whatman No. 1 filter paper | Fischer Scientific | #09-806A | |
| Mini protean 3 cell | Bio-Rad | #165-3301 | |
| iBlot gel transfer device | Invitrogen | #IB1001 | |
| Nitrocellulose membranes | Bio-Rad | #162-0115 | |
| Monoclonal Anti-Flag M2 antibody | Sigma | #F3165 | |
| Horseradish peroxidase | Amersham | #NA931V | |
| Pre-stained protein molecular weight standards | Bio-Rad | #161-0363 | |
| Chemiluminescence reagent | PIERCE | #1856136 | |
| Autoradiography film | Clonex Corp | #CLEC810 | |
| Quick Draw blotting paper | Sigma | #P7796 | |
| C2 platform rocking shaker | New Brunswick Scientific, USA | ||
| 8. Sonication Equipment and Reagents | |||
| Sonicator | Branson Ultrasonic | #23395 | |
| NaCl | Bioshop | #SOD001 | |
| Protease inhibitors | Roche | #800-363-5887 | |
| 0.5 mM TCEP-HCl | Thermo Scientific | #20490 | |
| 9. Affinity Purification Reagents and Equipment | |||
| 0.8 x 4 cm Bio-Rad polypropylene column | Bio-Rad | #732-6008 | |
| Benzonase nuclease | Novagen | #70746 | |
| Anti-FLAG M2 agarose beads | Sigma | #A2220 | |
| Calmodulin-sepharose beads | GE Healthcare | #17-0529-01 | |
| TEV protease | Invitrogen | #12575-015 | |
| Triton X-100 | Sigma | #T9284 | |
| CaCl2 | Sigma | #C2661 | |
| EGTA | Sigma | #E3889 | |
| LabQuake Shaker | Thermolyne | #59558 | |
| 10. Silver Staining Reagents | |||
| Methanol | Bioshop | #MET302 | |
| Acetic acid | Bioshop | t#ACE222 | |
| Sodium-thiosulfate | Sigma | #S-7143 | |
| Silver nitrate | Fischer Scientific | #S181-100 | |
| Formaldehyde | Bioshop | #FOR201 | |
| Sodium carbonate | Bioshop | #SOC512 | |
| 11. Reagents and Equipment for Protein Identification | |||
| Trypsin Gold, Mass Spectrometry Grade | Promega | # V5280 | |
| 50 mM NH4HCO3 | Bioshop | #AMC555 | |
| 1 mM CaCl2 | Bioshop | #CCL302 | |
| Acetonitrile | Sigma | #A998-4 | |
| Formic acid | Sigma | #F0507 | |
| HPLC grade water | Sigma | #95304 | |
| Iodoacetamide | Sigma | #16125 | |
| Millipore Zip-Tip | Millipore | # ZTC18M960 | |
| ~10 cm of 3 μm Luna-C18 resin | Phenomenex | ||
| Proxeon nano HPLC pump | Thermo Fisher Scientific | ||
| LTQ Orbitrap Velos mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| 12. Labware | |||
| 4 liter conical flasks | VWR | #89000-372 | |
| 50 ml polypropylene falcon tubes | Any Vendor | ||
| 1.5 ml micro-centrifuge tubes | Any Vendor | ||
| 250 ml conical flaks | VWR | #29140-045 | |
| 15 ml sterile culture tubes | Thermo Scientific | #366052 | |
| Cryogenic vials | VWR | #479-3221 | |
| -80 °C freezer | Fisher Scientific | #13-990-14 | |
| Speed vacuum system | Thermo Scientific | ||
| Buffers and Solutions 1. 1 liter Terrific Broth (TB) media 11 g Bio-Tryptone 2. Potassium Salt Stock Solution 1.5 M K2HPO4 3. Sonication Buffer 20 mM Tris-HCl (pH 7.9) 4. AFC buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 5. TEV cleavage buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 6. Calmodulin binding buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 7. Calmodulin wash buffer 30 mM Tris-HCl pH 7.9 8. Calmodulin elution buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 9. Developing solution (1L) 37% Formaldehyde 10. Digestion buffer 50 mM NH4HCO3 11. Wetting and Equilibration solution 70% acetonitrile (ACN) in 0.1% formic acid 12. Washing solution 100% H2O in 0.1% formic acid |
|||
References
- Butland, G., et al. Interaction network containing conserved and essential protein complexes in Escherichia coli. Nature. 433, 531-537 (2005).
- Hu, P., Janga, S. C., Babu, M., Diaz-Mejia, J. J., Butland, G. Global functional atlas of Escherichia coli encompassing previously uncharacterized proteins. PLoS Biol. 7, e1000096 (2009).
- Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, 637-643 (2006).
- Mak, A. B., et al. A lentiviral functional proteomics approach identifies chromatin remodeling complexes important for the induction of pluripotency. Mol. Cell Proteomics. 9, 811-823 (2010).
- Polanowska, J., et al. Tandem immunoaffinity purification of protein complexes from Caenorhabditis elegans. Biotechniques. 36, 778-782 (2004).
- Veraksa, A., Bauer, A., Artavanis-Tsakonas, S. Analyzing protein complexes in Drosophila with tandem affinity purification-mass spectrometry. Dev. Dyn. 232, 827-834 (2005).
- Zeghouf, M., et al. Sequential Peptide Affinity (SPA) system for the identification of mammalian and bacterial protein complexes. J. Proteome Res. 3, 463-468 (2004).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat. Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).
- Yu, D., et al. An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 5978-5983 (2000).
- Kislinger, T., et al. PRISM, a generic large scale proteomic investigation strategy for mammals. Mol. Cell Proteomics. 2, 96-106 (2003).
- Vlasblom, J., et al. GenePro: a Cytoscape plug-in for advanced visualization and analysis of interaction networks. Bioinformatics. 22, 2178-219 (2006).
- de Berardinis, V., et al. A complete collection of single-gene deletion mutants of Acinetobacter baylyi ADP1. Mol. Syst. Biol. 4, 174 (2008).
- Babu, M., et al. Sequential peptide affinity purification system for the systematic isolation and identification of protein complexes from Escherichia coli. Methods Mol. Biol. 564, 373-400 (2009).
