Formuleringer til frysetørring af bakterier og deres indflydelse på Cell Survival

Summary

Frysetørring er ofte en nem og bekvem måde at opnå tørre produkter af levedygtige bakterieceller. Et spørgsmål i processen er celleoverlevelse. Vi detaljer her en fremgangsmåde til at undersøge, hvordan celleoverlevelse under frysetørring påvirkes af egenskaberne af den anvendte formulering.

Abstract

Cellular vand kan fjernes reversibelt inaktivere mikroorganismer for at lette opbevaring. En sådan metode til fjernelse er frysetørring, hvilket betragtes som en blid dehydrering metode. For at lette celle overlevelse under tørring er cellerne ofte formuleret på forhånd. Formuleringen danner en matrix, der integrerer cellerne og beskytter dem mod forskellige skadelige spændinger pålagt celler under frysning og tørring. Vi præsenterer her en generel metode til at vurdere overlevelsen af ​​celler efter frysetørring og vi illustrere det ved at sammenligne de opnåede resultater med fire forskellige formuleringer: disaccharidet saccharose indholdet af saccharose afledt polymer Ficoll PM400, og de respektive polysaccharider hydroxyethylcellulose (HEC ) og hydroxypropylmethylcellulose (HPMC), på to bakteriestammer, P. putida KT2440 og A. chlorophenolicus A6. I dette arbejde har vi illustrere, hvordan man forbereder formuleringer til frysetørring og hvordan at undersøge mekaismer celle overlevelse efter rehydrering ved at karakterisere formuleringen hjælp af differential (DSC), overfladespænding målinger, røntgen analyse og elektronmikroskopi, og som vedrører disse data til overlevelsesrater. Polymererne blev valgt for at få en monomer struktur af de respektive polysaccharid ligner saccharose til en varierende grad. Med denne metode opsætning viste vi, at polymerer kan understøtte celleoverlevelse så effektivt som disaccharider, hvis visse fysiske egenskaber af formuleringen kontrolleres ^1..

Protocol

1.. Dyrkning og høst af P. putida

1. Forbered en starter kultur af Pseudomonas putida ved at inokulere 100 ml tryptisk soja-bouillon (TSB) med en koloni af P. putida-celler dyrket på agar suppleret med tryptisk soja-bouillon (TSA). Holde kulturen ved 30 ° C på en ryster bord sat til 130 rpm.
2. Efter 7 timer overføre en portion fra starter kultur svarende til 1/10 af det endelige volumen af ​​den primære kultur til frisk TSB-medium. Holde cellerne ved 30 ° C på en ryster bord ved 130 rpm i 16 timer.
3. Efter 16 timers vækst høstes cellerne ved centrifugering cellekulturen ved 1.500 xg i 20 minutter ved stuetemperatur. Supernatanten dekanteres fra og vaske cellerne ved resuspendere cellepelleten er i en NaCl-opløsning, der er isotonisk til vækstmediet. I dette tilfælde en 150 mM NaCI opløsning blev anvendt. Cellerne centrifugeres derefter en gang mere, og supernatanten dekanteres før resuspendering af cellerne i formuleringen medium,se trin 3.2.

2.. Dyrkning af andre arter

1. At tilpasse protokollen til andre bakteriearter de dyrkning og høst procedurer skal ændres i overensstemmelse med kravene i den pågældende art. For at undgå osmotisk chok ved håndtering af cellerne under høsten og vasketrinnet (r), osmolaliteten af ​​opløsningerne skal stemme overens med vækstmediet ved høst.

3.. Formulering af celler

1. Forbered formuleringen løsninger ved at afveje de respektive matrixkomponenter og opløse dem i vand. For at opnå isotoniske betingelser, enten justere mængden af ​​excipiens eller tilføje NaCl eller en anden celle kompatibel opløste at nå den ønskede osmolalitet. For stoffer med lav molekylvægt, såsom disaccharider beløbene kan nemt justeres til at nå isotoniske forhold. For stoffer som polymerer, som er af høj molekylvægt, har tonicitet justeres med celle kompatible, sålut, fx NaCl eller disaccharider. Bemærk at enhver tilføjelse af et stof vil påvirke de fysiske egenskaber af formuleringen, hvilket igen kan påvirke frysetørring adfærd og celleoverlevelse.
2. Dekanteres vaskevandet (i dette tilfælde NaCl) og re-suspendere cellerne i de respektive formulering medier.
3. Sørg for, at cellerne er homogent spredt. Formuleringer af lav viskositet hvirvles hvorimod formuleringer af højere viskositeter blandes med ved tilsætning, f.eks. En omrører og ryste beholderen indtil homogen blanding er opnået.
4. Opdel formuleringerne i fryse-tørretumbler hætteglas. Hætteglassene skal vejes tom med prøven før og efter frysetørring for at beregne mængden af ​​vand, der fjernes under frysetørring.
5. Tilføj gummipropper til glassene Hvis hætteglassene skal forsegles inde i fryse-tørretumbler, se trin 4.3.
6. Opregne de celler i hver formulering før frysetørring, se trin 6.
</ Ol>

4.. Frysetørring

1. Frysetørring betingelser skal tilpasses de fysiske egenskaber af formuleringen. Den vigtigste parameter er i dette tilfælde glasovergangstemperaturen Tg af formuleringen, betegnes Tg «for fryse-koncentrerede prøve at angive, at vandet stadig er til stede. Tg «i fryse-koncentrerede formulering er let måles ved hjælp af differential scanning kalorimetri (DSC), se trin 7.
2. Justere parametrene for frysetørringsprocessen, således at temperaturen af prøven er altid under Tg af prøven, og at trykket i kammeret muliggør en hurtig sublimering af is, dvs primær tørring, og resterende vand i formuleringen, dvs sekundær tørring. Hvis prøven temperaturen er over Tg 'under tørringsprocessen er der en stor risiko for sammenstyrtning af prøven, som i væsentligt omfang kan nedsætte den cellulære overlevelse.
3. For at beskytte de tørre produkter efter freeze-tørring af prøven atmosfæren skal kontrolleres. Hvis det er muligt, forsegle prøverne i frysetørrer før vakuummet bliver frigivet ved slutningen af ​​frysetørring cyklus. Alternativt hætteglassene kan fyldes med en foretrukken atmosfære. Det er vigtigt at undgå at udsætte prøver til de omgivende betingelser som fugt eller oxygen til stede i opbevaringsatmosfæren vil påvirke overlevelsen af ​​cellerne.
4. Afveje hætteglas.

5.. Rehydrering

1. Rehydrere prøverne med demineraliseret og sterilt vand. Den mængde vand, der skal tilsættes, bør være det samme som det beløb fjernes under frysetørring og beregnes ud fra vægten af ​​de tomme hætteglas, den samme hætteglas med prøven før og efter frysetørring. Vortex prøverne nu og igen da indtil de løsninger forekommer homogene.

6.. Enumeration

1. Trække 100 pi fra hver prøve og gøre 10 gange serielle fortyndinger. Fra fortyndinger af inteResten 100 ul udplades på TSA-plader. Pladerne inkuberes ved den ønskede temperatur og tid.

7.. Karakterisering af Formulering af Frysning Behavior

1. Tag en lille mængde, 5 - 10 mg af prøven og sætte det i en DSC-aluminium gryde med låg. Forbered en tom gryde som reference.
2. Indstil DSC temperaturen scan program. Den kølende program er indstillet til at efterligne frysetrinnet i frysetørring program. Dette sker som køling kinetik kan påvirke Tg «af de hydratiserede formuleringer. Før opvarmning scanning begynder nedbringe temperaturen til et godt stykke under den forventede Tg «af de undersøgte formuleringer, normalt -100 ° C.
3. Vælg en passende opvarmningshastighed, normalt en opvarmningshastighed på 5 - 40 ° C / min anvendes. Den registrerede varmestrømmen signal udtrykkes i watt og vil blive påvirket af opvarmningshastigheden. En højere opvarmningshastighed vil give et større signal af Tg «.
4. Indstil temperaturområde, så jegt dækker både Tg «og smeltning af formuleringen.

8.. Overfladespænding Målinger af Hydratiserede Formulations

1. Forsøgsopstillingen anvendes i dette eksperiment er ifølge Nouy metode til at måle overflade.
2. Rengør platin ring og målebeholderen omhyggeligt. Skibet er skyllet med acetone, aftørres med en fnugfri serviet, og derefter brændes på indersiden med en farveløs flamme. Ringen lyser rødt i en farveløs flamme.
3. Fylde karret med opløsningen og lad overfladen bundfælde sig, før måling. For løsninger, hvor ligevægt tilstand er opnået efter en lang tid, fx polymerer vil simple setup bruges her levere kvalitative data.
4. For formuleringer med høje viskositeter, fx opløsninger af 2% (w / w) HEC eller HPMC, overfladespændingen skal måles på løsninger af lavere koncentrationer, og derefter ekstrapoleret. Dette kan gøres ved at udnytte den kendsgerning, atfaldet i niveauer af overfladespænding off ved koncentrationer under 0,5% (w / w).

9.. X-ray Analyse af Dry Formulations

1. Tag en lille mængde af matrix / bakterier og indlæse det på en prøve holder.
2. Monter prøve holderen i X-ray-diffraktometer.
3. At analysere krystallinsk fase til stede i prøven EVA programpakke fra Bruker kan anvendes.

10.. Elektronmikroskopi

1. Tag en lille mængde af matrix / bakterier ud af hætteglassene og løse det på en SEM-stub.
2. Indlæse SEM indehaveren i sputter-coater (Thermo VGScientific polaron SC7640 anvendes i nærværende arbejde) og pels prøven med et par nm af Au / Pd eller Pt. I disse eksperimenter sputtering parametre var: 1.900 V, 20 mA, og 20 sek, for ~ 5 - 10 nm Au / Pd belægning. Belægningen reducerer elektriske opladning under billedet erhvervelsen. Det anbefales at starte med et tyndt lag, og hvis opladningen fortsætter og forårsager billedeartefakter, bør prøven coates igen.
3. Indlæse SEM holderen i SEM kammeret. Vælg passende imaging parametre. For det instrument, der anvendes i figur 2 (FEI Strata DB235) brugte vi 5 kV accelererende spænding, spotsize 3, en arbejdsgruppe afstand på 5 mm og den sekundære elektron detektor.
4. Eventuelt er det muligt at anvende Fokuseret Ion Beam at skære tværsnit af bakterierne indlejret i polymeren at afsløre yderligere detaljer.

Representative Results

Tabel 1 viser data vedrørende formulering sammensætning, termiske hændelser indspillet af DSC ved opvarmning af frosne formuleringer, struktur af de tørre prøver og overfladespændingen af formuleringen løsninger. _Tg 'af saccharose er bestemt til -40 ° C ^{2, 3} og kan være vanskelig at opdage for saccharose koncentrationer under 20% w / w. Den termiske begivenhed på -35 ° C er sandsynligvis relateret til udbrud af is opløsning ^2.. Den krystallinske struktur påvist ved røntgen i HEC og HPMC prøver og også set i SEM (se figur 2b og 2c) overlapper med den normale krystalform af NaCl.

1A viser overlevelsesdata for gramnegative P. putida og grampositive A. chlorophenolicus formuleret i de forskellige saccharid baserede formuleringer. Bemærk, at tendensen i, hvor godt formuleringerne understøtter celle overlevelse er den samme for both bakteriearter. Plottet vist i figur 1B illustrerer sammenhængen mellem frysetørring overlevelse og overfladespændinger formuleringerne.

Figur 2 viser SEM-billeder af de tørre formuleringer. For de fire polymerer er vist her, har den dannede matrix fremkomsten af ​​"sprøde papir": sammenkoblede glatte plader, hvor bakterierne er indlejret, og viser sig som bølger. For Ficoll og Saccharose, er arkene omkring 1 um tyk og 10 - 20 um bred, med Ficoll har en glattere overflade. HPMC og HEC danner meget tyndere plader, muligvis på grund af det faktum, at mængden af polymer er mindre i disse cellulose-baserede formuleringer end i de andre (tabel 1). Desuden blev saltkrystaller observeret for HEC og HPMC, med sidstnævnte viser en større mængde af bundfald på overfladen af ​​de polymere ark. Bakterier er lettere ses i cellulosebaserede formuleringer fordi arkene er thindvendig. I Saccharose og Ficoll, er de for det meste observeret som korrugering af de ellers glatte overflader.

Formulering sammensætning	Termiske hændelser detekteret i frosne formuleringer	Struktur af tør formulering	Overfladespænding utørrede formuleringer (mN m -1)
10% sucrose	indsættende is opløsning, -35 ° C	amorf saccharose	72 ± 0,1
10% Ficoll, 150 mM NaCI	Tg ', -22 ° C	amorf Ficoll	68 ± 0,3
2% HEC, 150 mM NaCI	eutektisk smeltning af is og NaCl, -28 ° C	amorf HEC, krystallinsk NaCI	64 ± 0,6
2% HPMC, 150 mM NaCI	eutektisk smeltning af is og NaCl, -27 ° C	52 ± 0,8

Tabel 1. Sammensætningen af de forskellige formuleringer og egenskaber af vandige eller tørre formuleringer. De polymerkoncentrationer af HEC og HPMC blev maksimeret for at opnå en tyk nok matrix dække af bakterier, men stadig har en brugbar løsning med hensyn til viskositet.

Figur 1.. A) Overlevelse satser frysetørret P. putida (hvid) og A. chlorophenolicus (grå), når formuleret i løsninger baseret på den disaccharidet saccharose eller polymererne Ficoll, HEC og HPMC, B) Sammenhæng mellem celle overlevelse efter frysetørring og overfladespændingen af de un-tørrede formuleringer.

Figur 2. SEM billeder af P. putida i fire forskellige formuleringer: a) saccharose b), Ficoll, c), HEC, d) HPMC. Bakterierne er svære at se i a) og b), fordi polymerplade er ganske tyk og kan indhylle bakterier fuldstændigt, i c) og d) bakterierne dukke op mere fremtrædende plads på overfladen. I d), kan de skelnes fra den store mængde salt udfældes på grund af deres form og kontrast, som de vises som aflange, mørke blodlegemer.

Discussion

Motivet for denne undersøgelse var at undersøge nogle formulerings egenskaber, der kan være af betydning for celle overlevelse under frysetørring. Selv om den iboende tørring tolerance varierer mellem forskellige arter, som illustreret i figur 1A, er tendensen, hvor godt de forskellige formuleringer bærecellen overlevelse er ens. Det er informativt at starte med en sammenligning af saccharose og Ficoll. Det menes, at en afgørende faktor for en formulering at understøtte celleoverlevelse er evnen af ​​formuleringen bestanddelen (e) til at erstatte vand i løbet af dehydrering, og opretholder således strukturen af ​​proteiner og membraner af cellen også i tør tilstand. Disaccharider, såsom sucrose, men også trehalose vise denne ejendom, mens polymerer såsom polysaccharid stivelse ikke ^5,11. Polymerer anses for store til at interagere med membranlipider på samme måde som disaccharider. En anden egenskab vigtig for en vellykket frysetørretning af mikroorganismer er evnen af den bærende matrix til forglasse (dvs.. bliver amorfe faststoffer) under frysetørring. Den amorfe struktur er til gavn for afskærmning og holde separerede celler. Interessant begge disaccharider og polymerer let forglasse hvis frysetørring korrekt udført. Vores resultater viser, at både sucrose og Ficoll formuleringer bliver amorf efter frysetørring, se tabel 1, og støtte celleoverlevelse lige godt. Der er dog væsentlige forskelle mellem de to saccharider. I modsætning til saccharose, er Ficoll molekyle med en molekylvægt på 400 kDa, for stor til at erstatte vand i interaktionerne med lipidmembraner under frysetørring ^{4, 5.} Desuden er som Ficoll molekyler udelukkes fra det periplasmatiske rum af gramnegative bakterier, igen på grund af deres størrelse ^6, cellulære optagelse af Ficoll er usandsynlig. Baseret på dette, foreslår vi, at den beskyttende effekt bestemded af saccharose formulering er ikke primært skyldes cellulære optagelse af disaccharidet, vigtige for vand kapacitet af intracellulære strukturer ^{7, 8.} Snarere evnen Ficoll at understøtte celleoverlevelse har at gøre med egenskaber der er fælles for både Ficoll og saccharose formulering, fx amorf struktur.

Fokus på polymererne, er det klart fra figur 1A, at evnen af de polymere formuleringer til støtte celleoverlevelse varierer. Røntgen-analyse viste, at NaCl krystalliseret under frysetørring og levede med den ellers amorf struktur af HEC og HPMC-formuleringer. Ingen krystallinske materiale blev påvist i Ficoll baseret formulering. NaCl kan danne komplekser med de hydroxyldele i kulhydrater ^{9, 10.} I Ficoll og HEC-baserede formuleringer NaCl til hydroxyldelen molforholdet var 01:11 og 01:01, henholdsvis forklarer, hvorfor der ikke krystallisering blev opdageti Ficoll-baserede formulering. Faseadskillelsen mellem NaCl og cellulosepolymerer blev også observeret i DSC-undersøgelser. En eutektisk smeltning blev registreret ved opvarmning af frosne HEC og HPMC-formuleringer, der angiver, at faseseparationen finder sted i den frosne tilstand. Morfologi og mikrostruktur af formuleringen er afsløret ved SEM billeddannelse (fig. 2) og bekræfter DSC og X-ray data. Bakterieceller set rager fra arkene med deponerede NaCl krystaller klart synlig på overfladen af ​​HEC-sheets. Baseret på ligheden mellem overlevelsesprocenten for bakterier formuleret i HEC-løsningen og Ficoll løsninger i forhold til HPMC vi konkludere, at staten af ​​salt, også spredt som krystaller eller opløst i polymeren, ikke korrelerer med celle overlevelse. I stedet celleoverlevelse viser et forhold til overfladespænding af formuleringerne, se figur 1B. For lavere overfladespændinger, lower overlevelsesrater registreres for bakterier. Bemærk dog, at den målte overfladespænding viser samspillet mellem de opløste stoffer, dvs saccharose og polymerer og opløsningsmidlet molekyle. Stadig det giver mulighed for en indirekte spekulationer om, at overflade-aktivitet af polymerer kan være relateret til deres tendens til at interagere med celleoverflader i en destabiliserende måde. Efterhånden som koncentrationen af ​​opløste stoffer stiger under frysning, kan de negative virkninger potenseres forklare, hvorfor den negative virkning af overfladeaktive polymerer ikke ses, når kun lagring af bakterier i fuldt fugtgivende formuleringer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ficoll PM 400	GE-healthcare	17-0300-10
HEC (Natrosol-M Pharm Grade)	Ashland		Gift from Ashland
HPMC (Methocel F4M)	Dow		Gift from the Department of Pharmacy, Uppsala University
Sucrose	Sigma-Aldrich	S2395
NaCl	Sigma-Aldrich	71376
Tryptic Soy broth	Merck	105459
Tryptic Soy Agar	Merck	105458
Lyostar II	FTS Kinetics	N.A.
Pyris Diamond DSC	Perkin-Elmer	N.A.
Bruker AXS SMART CCD 1k Diffractometer	Bruker	N.A
Dual-beam FEI Strata DB235 FIB/SEM	FEI	N.A
Krüss Educational Tensiometer	Krüss	N.A.