Formuleringer for frysetørking av bakterier og deres innflytelse på Cell Survival

Summary

Frysetørking er ofte en enkel og praktisk måte å få tørre produkter av levedyktige bakterieceller. Et problem i prosessen er celle overlevelse. Vi detalj her en fremgangsmåte for å undersøke hvordan celleoverlevelse under frysetørking er påvirket av egenskapene til formuleringen benyttes.

Abstract

Cellular vann kan fjernes reversibelt å inaktivere mikroorganismer for å lette lagring. En slik fremgangsmåte brukes er frysetørking, som er ansett som en mild metode for dehydrering. For å legge til rette for celle overlevelse under tørking, blir cellene ofte formulert på forhånd. Formuleringen danner en matriks som bygger inn i cellene og beskytter dem fra forskjellige skadelige påkjenninger på cellene i løpet av frysing og tørking. Her presenteres en generell metode for å vurdere overlevelse av celler etter frysetørking og illustrere er det funnet ved å sammenligne resultatene oppnådd med fire forskjellige formuleringer: disakkaridet sakkarose, sukrose avledet polymer Ficoll PM400, og de respektive polysakkarider hydroksyetylcellulose (HEC ) og hydroksypropylmetylcellulose (HPMC), på to bakteriestammer, P. putida KT2440 og A. chlorophenolicus A6. I dette arbeidet illustrere hvordan vi skal forberede formuleringer for frysetørking og hvordan å undersøke mechanismer av celleoverlevelse etter rehydratisering ved karakteriserer formulering ved hjelp av differensial scanning kalorimetri (DSC), overflatespenning målinger, røntgen-analyse, og elektronmikroskopi og å relatere disse dataene til overlevelse. Polymerene som ble valgt for å få et monomert struktur av de respektive polysakkarid likner sukrose i varierende grader. Ved hjelp av denne metode oppsett vi viste at polymerene kan støtte celleoverlevelse så effektivt som disakkarider dersom visse fysikalske egenskaper av formuleringen blir styrt ^en.

Protocol

En. Dyrking og høsting av P. putida

1. Forbered en forrett kultur Pseudomonas putida ved inoculating 100 ml tryptisk kjøttkraft (TSB) med en koloni av P. putida celler dyrket på agar supplert med tryptisk soyavekstmedium (TSA). Hold kultur ved 30 ° C på en ristende bord satt til 130 rpm.
2. Etter 7 timer overføre en alikvot fra den starterkultur ekvivalent til 1/10 av det endelige volum av hoved kultur til frisk TSB-medium. Hold cellene ved 30 ° C på en ryster ved 130 opm bord i 16 timer.
3. Etter 16 timers vekst av cellene høstet ved sentrifugering cellekulturen ved 1500 xg i 20 min ved RT. Dekanter supernatanten og vask cellene ved å re-suspenderes cellepelleten i en NaCl-løsning som er isoton med vekstmediet. I dette tilfellet en 150 mM NaCl-oppløsning ble anvendt. Cellene blir deretter sentrifugert en gang til og supernatanten dekanteres før oppslemme cellene i formuleringen medium,se trinn 3.2.

2. Dyrking av andre arter

1. Å tilpasse protokollen til andre bakteriearter dyrking og innhøsting prosedyrer bør endres i henhold til kravene i denne arten. For å unngå osmotisk sjokk ved håndtering cellene under innhøstingen og vasking trinn (s), må osmolalitet av løsningene for å matche den vekstmedium ved innhøsting.

3. Formulering av cellene

1. Klargjør formulering løsninger ved veiing ut de respektive matrikskomponenter og oppløse dem i vann. For å oppnå isotoniske betingelser, enten å justere mengden av hjelpestoff eller legge til NaCl eller en annen celle-kompatibel oppløst stoff for å oppnå den ønskede osmolalitet. For stoffer med lav molekylvekt slik som disakkarider beløpene kan lett justeres for å oppnå isotoniske betingelser. For stoffer som polymerer som er av høy molekylvekt, har de tonisitet kan justeres med celle-kompatibelt, sålutt, f.eks NaCl eller disakkarider. Legg merke til at en hvilken som helst tilsetning av et stoff som vil påvirke de fysikalske egenskaper av formuleringen, noe som igjen kan påvirke frysetørking oppførsel og celleoverlevelse.
2. Dekanter vaske-løsning (i dette tilfellet NaCl) og resuspendere cellene i de respektive formulering media.
3. Sørg for at cellene er homogent fordelt. Formuleringer av lav viskositet ble virvlet, mens formuleringer med høyere viskositeter er blandet med ved å legge til, f.eks., En rørestav og riste beholderen inntil homogen blanding er oppnådd.
4. Fordel formuleringene i fryse-tørketrommel hetteglass. De ampuller skal veies tom, med prøven før og etter fryse-tørking for å beregne mengden av vann som fjernes i løpet av frysetørking.
5. Legg gummipropp til hetteglass hvis hetteglass tettes inne i fryse-tørketrommel, se trinn 4.3.
6. Nummerere cellene i hver formulering før frysetørking, se trinn 6.
</ Ol>

4. Frysetørking

1. De fryse-tørking betingelser må justeres til de fysikalske egenskaper av formuleringen. Den viktigste parameter er i dette tilfelle den glassovergangstemperatur, Tg, basert på preparatet, betegnet Tg 'for fryse-konsentrerte prøve for å indikere at fremdeles inneholder vann. Den Tg 'av fryse-konsentrerte formulering ble enkelt målt ved hjelp av differensial scanning kalorimetri (DSC), se trinn 7.
2. Justere parametrene av fryse-tørkingen, slik at temperaturen av prøven alltid er under Tg-verdien for prøven og at kammeret trykket gir en rask sublimasjon av is, dvs. primær tørking, og resterende vann i formuleringen, dvs. sekundær tørking. Dersom prøven temperaturen er over Tg 'under tørkeprosessen er det stor fare for strukturell kollaps av prøven som kan betydelig redusere den cellulære overlevelse.
3. For å beskytte de tørre produktene etter freeze-tørke prøven atmosfæren må kontrolleres. Hvis mulig, forsegle prøvene i fryse-tørk før vakuumet slippes ved enden av fryse-tørking syklus. Alternativt ampullene kan være fylt med en foretrukket atmosfære. Det er viktig å unngå å utsette prøvene med omgivelsesbetingelsene som fuktighet eller oksygen er tilstede i atmosfæren lagring vil påvirke overlevelsen av cellene.
4. Vei ampullene.

5. Rehydrering

1. Rehydrere prøvene med avionisert og sterilt vann. Mengden av vann som skal tilføyes, bør være den samme som mengden fjernet under frysetørking og beregnes ut fra vekten av den tomme ampulle, det samme ampulle med prøven før og etter frysetørking. Vortex prøvene nå og igjen da til løsningene vises homogen.

6. Oppregning

1. Tegn 100 pl fra hver prøve, og gjøre 10-ganger seriefortynninger. Fra fortynninger av inteResten 100/il er belagt på TSA-plater. Platene blir inkubert ved den temperatur og tid som kreves.

7. Karakterisering av Utforming av underkjølt Behavior

1. Ta en liten mengde, 5 - 10 mg, av prøven og legge den i en DSC-aluminium kjele med lokk. Forbered en tom pan som referanse.
2. Sett DSC temperatur scan program. Avkjølingen program er satt til å etterligne frysing trinn i frysetørking program. Dette gjøres som kjøle-kinetikken kan påvirke Tg 'av de hydratiserte formuleringer. Før oppvarmingen starter skanningen få ned temperaturen til godt under den forventede Tg 'av de undersøkte formuleringer, normalt -100 ° C.
3. Velge en passende oppvarmingshastighet, normalt en oppvarmingshastighet på 5 - 40 ° C / min benyttes. Den innspilte varmestrømmen signal er uttrykt i watt, og vil være påvirket av den oppvarmingshastighet. En høyere oppvarmingshastighet vil gi et større signal av Tg '.
4. Sett temperaturområde slik at jegt dekker både Tg 'og smeltepunktet av formuleringen.

8. Overflatespenning Målinger av de hydratiserte Formuleringer

1. Det eksperimentelle oppsettet som brukes i dette eksperimentet er i henhold til du Nouy metode for å måle overflate.
2. Rengjør platina ring og måling fartøy nøye. Skipet skylles med aceton, tørkes av med en klut som ikke loer, og deretter brent på innsiden med en fargeløs flamme. Ringen lyser rødt i en fargeløs flamme.
3. Fyll karet til løsningen og la overflaten avgjøre før måling. For løsninger hvor likevekt tilstand er nådd bare etter en lang tid, f.eks polymerer, vil den enkle oppsettet som brukes her gi kvalitative data.
4. For formuleringer med høye viskositeter, f.eks oppløsninger av 2% (vekt / vekt) HEC eller HPMC, har overflaten spenning som skal måles på oppløsninger av lavere konsentrasjoner og deretter avledes. Dette kan gjøres ved å utnytte det faktum atfallet i overflatespenning flater ut ved konsentrasjoner lavere enn 0,5% (vekt / vekt).

9. Røntgenanalyse av de tørre formuleringer

1. Ta en liten mengde matrix / bakterier og legger det på en prøve holderen.
2. Fest prøven holderen i X-ray-diffraktometer.
3. For å analysere noen krystallinsk fase tilstede i prøven EVA-program-pakken fra Bruker kan brukes.

10. Elektron mikroskopi

1. Ta en liten mengde matrise / bakterier ut av ampuller og fikse det på en SEM spire.
2. Laste SEM holder i frese-coater (Thermo VGScientific Polaron SC7640 brukes i dette arbeidet) og frakk prøven med et par nm av Au / Pd eller Pt. I disse eksperimentene sputtering parametre var: 1900 V, 20 mA, og 20 sek, for en ~ 5 - 10 nm Au / Pd-belegg. Belegget reduserer elektrisk lading under bildet oppkjøpet. Det anbefales å starte med et tynt lag, og hvis lading vedvarer og forårsaker bildegjenstander, bør prøven belegges på nytt.
3. Laste SEM holder i SEM kammeret. Velg riktige bildebehandling parametere. For det instrument som benyttes i figur 2 (FEI Strata DB235) brukte vi 5 kV akselererende spenning, 3 spotsize, en arbeidsavstand på 5 mm og den sekundære elektron detektor.
4. Alternativt er det mulig å bruke den fokuserte ionestrålen å kutte tverrsnitt av bakteriene innleiret i polymeren for å avdekke ytterligere detaljer.

Representative Results

Tabell 1 viser data for formulering sammensetning, termiske registrerte hendelser ved DSC ved oppvarming av frosne formuleringer, strukturen av de tørre prøver og overflatespenningen til formuleringen løsningene. Den T _g 'av sukrose er bestemt til -40 ° C ^{2, 3} og kan være vanskelig å oppdage for sukrose konsentrasjoner under 20% vekt / vekt. Den termiske arrangement på -35 ° C har trolig sammenheng med utbruddet av is oppløsning ^to. Den krystallinske struktur detekteres med røntgen, i HEC og HPMC prøver og også sett i SEM (se figur 2b og 2c) overlapper med den normale krystallform av NaCl.

Figur 1A viser overlevelse data for Gram-negative P. putida og Gram-positive A. chlorophenolicus formulert i de forskjellige sakkarid-baserte formuleringer. Legg merke til at trenden i hvor godt formuleringene støtte celle overlevelse er den samme for Bøth bakterier arter. Plottet vist i Figur 1B illustrerer korrelasjonen mellom frysetørking overlevelse og Overflatespenningen i formuleringene.

Figur 2 viser SEM-bilder av de tørre formuleringer. For de fire polymerer som vises her, har matrisen dannet utseende "skarp papir": sammenhengende glatt ark der bakteriene er innebygd og vise seg som corrugations. For Ficoll og sukrose, idet arkene er omtrent 1 mikrometer tykke og 10 - 20 mikrometer brede, med Ficoll har en jevnere overflate. HPMC og HEC danner mye tynnere ark, eventuelt på grunn av det faktum at mengden av polymer er mindre i disse cellulose-baserte formuleringer enn i de andre (tabell 1). Videre ble det observert saltkrystaller for HEC og HPMC, med sistnevnte som viser en større mengde av bunnfall på overflaten av polymer-arkene. Bakterier er lettere sett i cellulose baserte formuleringer fordi arkene er thindre. I sukrose og Ficoll, blir de for det meste observert som korrugeringen av den ellers glatte overflater.

Formulering sammensetning	Termiske hendelser påvist i frosne formuleringer	Oppbygging av tørr formulering	Overflatespenningen i utørket formuleringer (Mn m -1)
10% Sukrose	angrep av is oppløsning, -35 ° C	amorfe sukrose	72 ± 0,1
10% Ficoll, 150 mM NaCl	T g ', -22 ° C	amorfe Ficoll	68 ± 0.3
2% HEC, 150 mM NaCl	eutectic smelting av is og NaCl, -28 ° C	amorfe HEC, krystallinsk NaCl	64 ± 0,6
2% HPMC, 150 mM NaCl	eutektisk smelting av is, og NaCl, -27 ° C	52 ± 0,8

Tabell 1. Sammensetningen av de forskjellige formuleringer og egenskapene til de vandige eller tørre formuleringer. Polymer-konsentrasjonen av HEC og HPMC ble maksimert for å oppnå en tykk nok matrise dekke av bakteriene, men likevel ha en gjennomførbar løsning med hensyn til viskositet.

Figur 1. A) Overlevelse av frysetørket P. putida (hvit) og A. chlorophenolicus (grå) når de formuleres i løsninger basert på disakkaridet sakkarose eller polymerene Ficoll, HEC og HPMC, B) Korrelasjon mellom celleoverlevelse etter frysetørking og overflatespenningen i de un-tørkede formuleringer.

Figur 2. SEM bilder av P. putida i fire forskjellige formuleringer: a) sukrose, b) Ficoll, c) HEC, d) HPMC. Bakteriene er vanskelige å se på a) og b) fordi polymerfolie er ganske tykk, og kan innhylle bakteriene helt, i c) og d) bakteriene vises mer tydelig på overflaten. I d), kan de skilles fra den store mengden av saltet utfelles på grunn av sin form og kontrast, slik de vises som avlange, mørke legemer.

Discussion

Motivet for denne studien var å undersøke noen formulering egenskaper som kan ha betydning for celle overlevelse under frysetørking. Selv om den iboende tørking toleranse varierer mellom forskjellige arter, som illustrert i figur 1A, utviklingen av hvor godt de forskjellige formuleringer støtte celleoverlevelse er lik. Det er informativ å starte med et forhold mellom sukrose og Ficoll. Det antas at en viktig faktor for en formulering for å støtte celleoverlevelse er evnen til formuleringen ingrediens (er) for å erstatte vann under dehydrering, og dermed opprettholde strukturen av proteiner og membraner i cellen også i tørr tilstand. Disakkarider slik som sukrose, men også trehalose viser denne egenskap, mens polymerer som for eksempel polysakkaridet stivelse ikke ^5,11. Polymerer anses for store til å samvirke med membranlipider på samme måte som disakkarider. En annen egenskap viktig for en vellykket fryse-tørkeing av mikroorganismer er evnen av den understøttende matriks for å vitrify (ie. blitt amorfe faste stoffer) i løpet av frysetørking. Den amorfe struktur er gunstig for skjerming og holde cellene separert. Interessant, både disakkarider og polymerer lett vitrify hvis frysetørking er riktig utført. Våre resultater viser at både sukrose og Ficoll baserte formuleringer blir amorfe etter frysetørking, se tabell 1, og støtte celleoverlevelse like godt. Men det er betydelige forskjeller mellom de to saccharides. I motsetning til sukrose, er det Ficoll molekyl, med en molekylvekt på 400 kDa, for stor til å erstatte vannet i interaksjoner med lipidmembraner under frysetørking ^{4, 5.} Videre er som Ficoll molekyler utelukket fra det periplasmiske rom av Gram-negative bakterier, igjen på grunn av sin størrelse ^6, er cellulært opptak av Ficoll usannsynlig. Basert på dette, foreslår vi at den beskyttende effekten provided av sukrose formulering er ikke først og fremst på grunn av cellulært opptak av disakkaridet, viktig for vann å erstatte kapasitet av intracellulære strukturer ^{7, 8.} Snarere har evnen til å støtte Ficoll celleoverlevelse å gjøre med egenskaper som er felles for både den Ficoll og sukrose formulering, f.eks den amorfe struktur.

Med fokus på polymerene, er det tydelig fra figur 1A at evnen til de polymere formuleringer for å støtte celleoverlevelse varierer. Den røntgenanalyse viste at NaCl krystalliserte i løpet av frysetørking og coexisted med den ellers amorfe struktur av HEC og HPMC formuleringer. Ingen krystallinske materiale ble påvist i Ficoll basert formulering. NaCl kan danne komplekser med hydroksyl-gruppene på karbohydrater ^{9, 10.} I Ficoll og HEC-baserte formuleringer NaCl til hydroksyl-gruppen molforholdet var 01:11 og 01:01, respektivt, som forklarer hvorfor ingen krystallisering ble detekterti Ficoll-basert formulering. Den faseseparasjon mellom NaCl og cellulose-polymerer ble også observert i DSC-undersøkelser. En eutektisk smelting ble tatt opp under oppvarming av den frosne HEC og HPMC-formuleringer som indikerer at faseseparasjon finner sted i den frosne tilstand. Morfologien og mikrostrukturen av formuleringen er åpenbart av SEM imaging (figur 2) og corroborates DSC-og røntgen-dataene. Bakterielle celler blir sett som stikker frem mellom arkene deponerte NaCl krystaller tydelig plassert på overflaten av HEC-arkene. Basert på likhetene mellom overlevelsen til bakteriene var formulert i HEC-løsning og Ficoll-løsninger i forhold til HPMC vi konkludere med at tilstanden av saltet, enten det er dispergert som krystaller eller oppløses i polymeren, ikke korrelerer med celleoverlevelse. Istedenfor celleoverlevelse viser et forhold med overflatespenningen av formuleringene, se figur 1B. For lavere overflatespenning, lower overlevelse er registrert for bakterier. Merk imidlertid at den målte overflatespenningen viser samspillet mellom de oppløste stoffer, dvs. sukrose og de ​​polymerer, og løsningsmiddelet molekylet. Fortsatt det gir mulighet for en indirekte spekulasjoner om at overflaten aktivitet av polymerer kan relateres til deres tendens til å interagere også med celleoverflater i en destabiliserende måte. Ettersom konsentrasjonen av de oppløste stoffer øker under frysing, kan de negative effektene potensieres forklarer hvorfor den negative effekten av det overflateaktive polymerer ikke ble sett da bare lagring av bakterier i fullt fuktighetsgivende formuleringer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ficoll PM 400	GE-healthcare	17-0300-10
HEC (Natrosol-M Pharm Grade)	Ashland		Gift from Ashland
HPMC (Methocel F4M)	Dow		Gift from the Department of Pharmacy, Uppsala University
Sucrose	Sigma-Aldrich	S2395
NaCl	Sigma-Aldrich	71376
Tryptic Soy broth	Merck	105459
Tryptic Soy Agar	Merck	105458
Lyostar II	FTS Kinetics	N.A.
Pyris Diamond DSC	Perkin-Elmer	N.A.
Bruker AXS SMART CCD 1k Diffractometer	Bruker	N.A
Dual-beam FEI Strata DB235 FIB/SEM	FEI	N.A
Krüss Educational Tensiometer	Krüss	N.A.