Summary
B7-H1 (PD-L1) 및 PD-1의 바인딩은 종양의 microenvironment의 주요 종양 유발 면역 신호를 제공합니다. 표현과 췌장 선암의 B7-H1의 국산화를 특성화 할 수 immunohistochemical 얼룩 기법이 여기에 설명되어 있습니다.
Abstract
B7-H1/PD-L1, 면역 규제 세포 표면 단백질의 B7 가족의 일원은 (PD 프로그래밍 사망-1, 그 수용체와의 상호 작용을 통해 세포 매개 면역 반응의 부정적인 규제에 중요한 역할을 -1) 1,2. 종양 세포의 B7-H1의 Overexpression는 흑색 증, glioblastoma, 그리고 폐, 유방, 대장, 난소 및 신장 세포의 carcinomas을 포함 인간 암의 숫자에 기록되었으며, 항 종양 저해하는 표시되었습니다 T를 세포 면역 3-8.
최근 췌장 선암의 조직에 의해 B7-H1 표현은 잠재적 인 전조 마커 9,10로 확인되었습니다. 또한 췌장암의 마우스 모델에서 B7-H1의 봉쇄는 안티 종양 응답 11 생산 보여왔다. 이러한 데이터는 잠재적 인 치료 목표로 B7-H1의 중요성을 권장합니다. 안티 - B7-H1의 봉쇄 항체 따라서 mul에 대한 임상 실험에서 테스트되고 있습니다흑색 증과 폐, 대장, 신장, 위장, 췌장 (12)의 암을 포함 tiple 인간의 고체 종양.
결국 치료를 타겟으로 B7-H1의 혜택을받을 환자를 식별 할 수 있도록 위해서는 표현과 B7-H1과 B7-H1의 봉쇄 항체 치료에 대한 환자 반응의 국산화 사이의 상관 관계를 조사하는 것이 중요합니다. immunohistochemistry를 통해 인간의 췌장 선암의 조직에서 B7-H1의 표현을 조사하면이 공동 억제 신호 분자가 종양의 microenvironment에 antitumor 면역의 억제에 기여하는 방법에 대한 이해를 제공 할 것입니다. 첸과 동료에 의해 개발 된 안티 - B7-H1 단클론 항체 (클론 5H1)가 인간의 neoplastic 조직 4,8의 여러 유형의 cryosections에서 신뢰할 수있는 염색 결과를 생산하기 위해 표시하지만, 파라핀 - 임베디드 슬라이드에 얼룩되었습니다 것은 때까지 도전이었다 최근 13-18. 우리는 개발자가췌장 선암의 조직의 파라핀 - 임베디드 슬라이드에 대한 사랑의 도피를 떠났을 B7-H1의 착색 프로토콜. 여기에 설명 된 B7-H1의 착색 프로토콜은 약간의 배경 B7-H1의 일관성 막과 세포질 염색을 생산하고 있습니다.
Protocol
B7-H1/PD-L1, 면역 규제 세포 표면 단백질의 B7 가족의 일원은 (PD 프로그래밍 사망-1, 그 수용체와의 상호 작용을 통해 세포 매개 면역 반응의 부정적인 규제에 중요한 역할을 -1) 1,2. 종양 세포의 B7-H1의 Overexpression는 흑색 증, glioblastoma, 그리고 폐, 유방, 대장, 난소 및 신장 세포의 carcinomas을 포함 인간 암의 숫자에 기록되었으며, 항 종양 저해하는 표시되었습니다 T를 세포 면역 3-8.
최근 췌장 선암의 조직에 의해 B7-H1 표현은 잠재적 인 전조 마커 9,10로 확인되었습니다. 또한 췌장암의 마우스 모델에서 B7-H1의 봉쇄는 안티 종양 응답 11 생산 보여왔다. 이러한 데이터는 잠재적 인 치료 목표로 B7-H1의 중요성을 권장합니다. 안티 - B7-H1의 봉쇄 항체 따라서 여러 인간에 대한 임상 실험에서 테스트되고 있습니다흑색 증과 폐, 대장, 신장, 위장, 췌장 (12)의 암 등의 고체 종양.
결국 치료를 타겟으로 B7-H1의 혜택을받을 환자를 식별 할 수 있도록 위해서는 표현과 B7-H1과 B7-H1의 봉쇄 항체 치료에 대한 환자 반응의 국산화 사이의 상관 관계를 조사하는 것이 중요합니다. immunohistochemistry를 통해 인간의 췌장 선암의 조직에서 B7-H1의 표현을 조사하면이 공동 억제 신호 분자가 종양의 microenvironment에 antitumor 면역의 억제에 기여하는 방법에 대한 이해를 제공 할 것입니다. 첸과 동료에 의해 개발 된 안티 - B7-H1 단클론 항체 (클론 5H1)가 인간의 neoplastic 조직 4,8의 여러 유형의 cryosections에서 신뢰할 수있는 염색 결과를 생산하기 위해 표시하지만, 파라핀 - 임베디드 슬라이드에 얼룩되었습니다 것은 때까지 도전이었다 최근 13-18. 우리는 B7-H1 staini을 개발했습니다췌장 선암의 조직의 파라핀 - 임베디드 슬라이드에 대한 것이다 프로토콜. 여기에 설명 된 B7-H1의 착색 프로토콜은 약간의 배경 B7-H1의 일관성 막과 세포질 염색을 생산하고 있습니다.
1. 드 - parafinization
- 구워 20 분에 55 ° C에서 슬라이드.
- 10 분을위한 크실렌의 화학 후드에서 잠그다는 슬라이드.
- 10 분에 대한 새로운 크실렌에 젖어 슬라이드.
- 젖어은 5 분 동안 100 %의 에탄올에 슬라이드.
- 빠져 5 분을위한 신선한 100 % 에탄올에 슬라이드.
- 젖어은 5 분 동안 95 %의 에탄올에 슬라이드.
- 젖어은 5 분 동안 80 % 에탄올에 슬라이드.
- 젖어은 5 분 동안 탈 이온수에 슬라이드.
2. 항원 불러 오기
- 그리고 125 ° C 30 초를위한 트리스 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 버퍼 (산도 9.0)과 압력 밥솥의 열, 90 ° 10 초에 C에 젖어 슬라이드.
- 60 분에 슬라이드가 멋진 보자.
- 5 분에 TBST에 빠져 슬라이드, repe두 번에.
3. 더럽히는 것
- 슬라이드에 조직 주위에 솔루션을 닦아. 소수성 펜으로 조직 주위에 원을 표시합니다.
- 습도 챔버에 슬라이드를 삽입하고 전체 염색 과정에서 슬라이드의 조직의 건조를 방지. 5 분에 퍼 옥시 데이즈 블록에서 슬라이드 및 품다 슬라이드에 소수성 원에서 퍼 옥시 데이즈 블록의 장소 한 방울 (완전히 조직 영역을 커버하기 위해 약 200 μl 이상).
- 5 분에 TBST에서 발생 후, TBST로 슬라이드를 씻어.
- BLOCK ACE 장소 한 방울로 15 분 각 슬라이드 및 배양에 버퍼를 차단.
- 5 분에 TBST에서 발생 후, TBST로 슬라이드를 씻어.
- 15 분 각 슬라이드 및 배양에 아비딘 솔루션의 장소 한 방울.
- 5 분에 TBST에서 발생 후, TBST로 슬라이드를 씻어.
- 15 분 각 슬라이드 및 배양에 비오틴 솔루션의 장소 한 방울.
- SLI를 씻어TBST로 DES, 5 분에 TBST에서 다음 장소.
- 마우스 방지 B7-H1 단클론 항체의 1:1,000 희석 (복제 5H1) 또는 마우스 IgG1과 함께 슬라이드를 배양 4에 200 μl TBST에서 κ isotype 제어 ° C 22 시간 + / 밤새 - 1 시간. TBST의 최종 항체 농도는 2.57 μg / ML입니다.
- 5 분에 TBST에서 발생 후, TBST로 슬라이드를 씻어. 두 번 반복합니다.
- 30 분의 1:500 농도에서 비오틴 복합 쥐 안티 - 마우스 IgG1 항체 보조 (200 μl 2 % 염소 혈청 솔루션)에 슬라이드를 품다.
- 5 분에 TBST에서 발생 후, TBST로 슬라이드를 씻어. 두 번 반복합니다.
- Streptavidin-비오틴 복합체 대신 한 방울은 15 분 각 슬라이드 및 배양에 (사용 전에 적어도 30 분을 준비해야합니다.)
- 5 분에 TBST에서 발생 후, TBST로 슬라이드를 씻어. 두 번 반복합니다.
- 4 분 각 슬라이드 및 배양에 증폭 시약 대신 한 방울 (TBST로 2시 1분을 희석).
- T와 슬라이드를 씻어영국 서머 타임, 5 분에 TBST에서 다음 장소. 두 번 반복합니다.
- 15 분 각 슬라이드 및 배양에 Streptavidin-HRP 대신 한 방울.
- 5 분에 TBST에서 발생 후, TBST로 슬라이드를 씻어. 두 번 반복합니다.
- 각 슬라이드에 하나 3,3-Diaminobenzidine의 드롭 (DAB) 기판과 chromogen을 놓고 2 분의 색상을 개발합니다.
- 즉시 색상 개발 한 후, 1-2 분 동안 ddH 2 O로 슬라이드를 씻으십시오.
- 90 초 동안 hematoxylin 한 방울과 슬라이드를 품다.
- 1-2 분 동안 ddH 2 O로 씻으십시오.
- 1-2 분 동안 비누의 수돗물로 씻으십시오.
- 1-2 분 동안 ddH 2 O로 씻으십시오.
4. 탈수 및 장착
- 3 분에 80 % 에탄올에 슬라이드를 빠져.
- 3 분에 95 %의 에탄올에 슬라이드를 빠져.
- 5 분을위한 100 % 에탄올에 슬라이드를 빠져. 반복합니다.
- 5 분에 크실렌에서 슬라이드를 빠져. 반복합니다.
- 한 방울을 추가슬라이드과 장소 coverslip에 Cytoseal 60.
표 1은 위에서 설명한 절차에 사용되는 시약을 나열합니다.
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Representative Results
B7-H1의 성공적인 immunohistochemical 얼룩은 췌장 선암의 B7-H1 (갈색 신호 DAB 색상 개발)의 이기종 표현을 보여줍니다. 다른 B7-H1 또는 B7-H1 (도 2 및도 3)의 작은 표현 중 하나 주로 세포질 표현을 할 수 있지만 일부 췌장 선암 세포는 B7-H1의 주로 막 표현 (그림 1A)를 갖추고 있습니다. 일반 췌장 덕트 상피는 (그림 4) B7-H1 약간을 표현한다. 마우스 IgG1 κ isotype 제어 항체와 얼룩 대신 반 B7-H1 항체의 것은 약간의 배경 착색 (그림 1B)를 보여줍니다.
1 그림. 반 B7-H1과 A. Immunohistochemical 착색은 클론 항체 5H1 일부 췌장 선암 세포에 막 표현을 보여줍니다. B. Immunohistoc은isotype 제어 IgG1과 hemical 얼룩 같은 췌장 선암 조직에 거의 DAB 색상 개발을 보여줍니다.
췌장 선암 세포의 세포질에 그림 2. B7-H1의 표현.
그림 3. 일부 췌장 선암 세포는 B7-H1을 좀 표현한다.
정상 췌장 ductal 상피의 그림 4. B7-H1의 표현.
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Discussion
cryosections에서 B7-H1의 Immunohistochemical 착색은 암 3,4의 다양한 사전 연구에서보고되었습니다. 그러나, 임상 종양 샘플을 일반적으로 파라핀 - 임베디드 블록의 형태로 사용할 수 있습니다. 5H1 단클론 항체는 최근 성공적으로 신장 세포 암종, 자궁 경부 암, 방광 암, 흑색 증 13-18 등의 파라핀 포함 된 종양 조직의 착색에 적용되었습니다. 파라핀 - 임베디드 9,19 또는 그라 이오 스탯 다른 단클론 항체와 췌장 선암의 조직의 20 섹션에서 B7-H1의 얼룩도보고되었습니다. 여기, 우리는 B7-H1에 5H1 단클론 항체와 파라핀 - 임베디드 췌장 선암의 조직을 성공적으로 착색을 보여 주었다. 췌장 선암의 B7-H1의 표현은 흑색 증 4,21 등 malignancies의 많은 다른 유형의 것과 유사 이기종입니다. B7-H1 AR의 막과 세포질 모두 표현e는 선암 세포 (그림 1과 2)로 관찰했다. B7-H1의 막 표현은 생물학적 기능과 일치합니다. neoplastic 조직에서 B7-H1 세포질의 역할 탐색 할 수 남아 있습니다. 일반 췌장 덕트 상피 또는 acinar 세포는 (그림 4) B7-H1을 표현하지 않습니다.
이 프로토콜의 모든 단계는 4 ° C.에서 하룻밤 배양을 제외하고 실온에서 개최 이 B7-H1의 착색 절차에 사용되는 항원 검색 조건은 앞서 언급 한 출판물 9,19에서보고되지 않았습니다. 증폭 단계는 이러한 연구에 의해 고용되지 않았습니다. 우리는이 프로토콜의 중요한 단계는 항원 검색, 기본 항체와 하룻밤 배양, 증폭 및 DAB 색상 개발을 포함 것으로 나타났습니다. 주요 항체의 희석은 5H1의 각기 다른 배치에 대해 약간 titrated해야 할 수도 있습니다. 증폭은 4 분에 정확히 함께 보관되었습니다희석 증폭 시약. 이 수정 배경을 증가하지 않고 긍정적 인 신호의 충분한 증폭을 제공합니다. 개발 시간은 일반적으로 2 분이지만, 우리는 정기적으로 최소한의 배경과 최적의 착색을 위해 현미경으로 개발을 모니터링 할 수 있습니다. 착색의 각 라운드를 통해, 우리는 이전 일괄 하나의 슬라이드와 긍정적 인 컨트롤로 편도선 조직의 하나의 슬라이드를 포함합니다. 편도선의 B7-H1의 Paracortical 착색는 이전에 4 설명되어 있습니다. 배경은 높은 또는이 컨트롤 슬라이드에 전형적인 신호를 개발하기 위해 이상 5 분 소요하는 경우, 우리는 중요한 단계의 시약을 교체하고 모든 착색 단계를 확인하시기 바랍니다합니다.
이 염색 기법의 사용은 B7-H1의 표현과 neoplastic 췌장 선암 세포에 대한 현지화의 질적 및 반 정량 분석 할 수 있습니다. amplificati의 주요 항체의 희석, 수정, 길이 및 희석으로단계 및 색상 개발의 시간에,이 프로토콜은 다른 조직 유형에 적용 할 수 있습니다. 우리는이 프로토콜을 수정 및 유방 암 육종의 조직을 위해 사용했습니다. B7-H1과 종양의 microenvironment의 주요 종양 유발 면역 신호를 제공하는 PD-1의 구속력이 착색 기술은 종양 개시, 진행 및 안티 종양 면역 반응에서 종양의 microenvironment의 역할에 대한 우리의 이해를 촉진합니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
EB, KMB, 그리고 HX 동일하게 기여하고 있습니다. 이 연구는 위장 암 P50 CA062924, NIH K23 CA148964, Lustgarten 재단, Viragh 재단, ASCO 젊은 연구자 상, NIH 5T32 CA0090701-28 교육 교부금, 솔 골드만 삭스의 췌장암 센터, 국립 췌장 재단에서 NCI의 포자에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CSA System | Dako | K1500 | Includes the following reagents mentioned in the protocol: peroxidase block, streptavidin-biotin complex, amplification reagent, streptavidin-HRP, and DAB substrate and chromogen |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Vector | SP-2001 | |
| Block ACE | Serotec | BUF029 | |
| Biotin anti-mouse IgG1 | BD | 553441 | |
| Mouse IgG1 K Isotype Control | eBioscience | 14-4714-85 | |
| TBS(Tris-buffered saline), 10X | Cellgro | 46-012-CM | 10xTBS contains 80 g/L NaCl and 24.2 g/L Tirs; Diluted to 1X with ddH2O for washes; |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | 1 ml added to 1 L of 1X TBS to make TBST |
| Target Retrieval, 20x | Celerus Wave | 014-3000-000 | Diluted to 1x with ddH2O |
| 190 Proof Ethyl Alcohol | Pharmco-Aaper | 111000190 | |
| 200 Proof Ethyl Alcohol | Pharmo-Aaper | 111000200 | |
| Xylene | VWR | 95057-827 | |
| Hematoxylin | Richard-Allan Scientific | 72804 | |
| Cytoseal 60 | Richard-Allan Scientific | 8310-4 | |
| Coverslips | Corning | 2940-245 | |
| Humidity chamber | Sigma | H6644 | |
| Table 1. Reagents and equipment. | |||
References
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