Summary
Fare kahverengi adipoz doku (BAT) işlevsel görüntüleme için bir yöntem olup BAT 18F-Florodeoksiglukoz soğuk-uyarılmış alımı (FDG) invaziv olmayan standart bir protokol micro-PET/CT ile değerlendirilmiştir olduğu tarif edilmektedir. Bu yöntem, fare modellerinde BAT faaliyetlerinde farklılıkları tespit etmek için sağlam ve hassastır.
Abstract
Kahverengi yağ dokusu (BAT) ayrık konumu ve zengin vaskülarizasyon ve mitokondri yüksek yoğunluk nedeniyle kahverengi-kırmızı renkli beyaz yağ dokusu (WAT) farklıdır. BAT enerji tüketimi ve non-titreme termojenezdeki yeni doğmuş, memelilerde hem de yetişkin 1 önemli bir rol oynar. BAT-aracılı thermogenesis yüksek β adrenerjik reseptör 2, 3 ile ağırlıklı olarak, sempatik sinir sistemi tarafından düzenlenir. Son çalışmalar yetişkin insan BAT faaliyetlerini olumsuz vücut kitle indeksi (VKİ) ve diğer diyabetik parametreleri 4-6 ile ilişkili olduğunu göstermiştir. BAT böylelikle anti-obesity/anti-diabetes terapisi enerji dengesi 6-8 modülasyonu odaklanarak için potansiyel bir hedef olarak öne sürülmüştür. Birkaç soğuk sorgulama tabanlı pozitron emisyon tomografisi (PET) yöntemleri insan BAT 9-13 algılamak için kurulmuş olsa da, görüntüleme ve quantif için standardize protokol aslında yokturfare gibi küçük hayvan modellerinde BAT ication. Burada farelerde BAT fonksiyonel değerlendirmesi için sağlam bir PET / BT görüntüleme yöntemi açıklanmaktadır. Kısaca, yetişkin C57BL/6J fareler, 18 F-Florodeoksiglukoz (FDG) bir doz almış önce 4 saat süreyle açlık koşullarında tedavi soğuk vardı. Fareler bir ilave saat sonrası FDG enjeksiyon için soğuk olarak kalmış ve daha sonra küçük bir hayvan adanmış micro-PET/CT sistemi ile tarandı. Kazanılmış PET görüntülerinde anatomik başvuruları için BT görüntüleri ile birlikte tescil ve BAT faaliyet sunmak interskapular BAT alanda FDG tutulumu için analiz edildi. Bu soğuk muamele standardize ve görüntüleme protokol farmakolojik faaliyetler sırasında test BAT ile onaylanmıştır, örneğin, β-adrenoseptör 14, 15 propranolol antagonist, agonist ya da β3 BRL37344 16 tarafından geliştirilmiş BAT aktivasyon işlemi ile bastırılmış BAT aktivasyonu. Yöntem desburada açıklanan şekilde değiştirin BAT aktivitesini düzenleyen, ya da gen / çeşitli klinik öncesi ve temel araştırmalar BAT geliştirilmesi ve düzenlenmesi dahil olan yollar belirlemek için ilaç / bileşiklerin taranması için kullanılabilir.
Protocol
1. Hayvan Hazırlama ve Soğuk Tedavi
- Laboratuvar fareleri accomodating için onaylanmıştır 4 ° C soğuk oda bulun ve inceleyin.
- Soğuk oda gecede Pre-chill hayvan kafesleri. Kafesler yem ve yatak olmadan ama bir şişe su ile monte edilir.
- Deney gününün sabahında, yer fareler 30 dakika aralıklarla önceden soğutulmuş kafesleri her birine göre bir. Bu görüntüleme laboratuara taşınan önce her tek tek kafesli fare yaklaşık 4 saat boyunca soğuk bir odada kalmalı. Fareler ama su erişimi olan oruç olun.
- Görüntüleme Lab için bir defada 4 saat sonrası soğuk tedavi taşımacılık az bir hayvanın her 30 dk. Bu, buz ile plastik bir kap doldurma ve kutu içine buz üzerine bir ön-soğutulmuş bir konut kafes yerleştirilmesi ile elde edilebilir. Gevşekçe strafor kutusunda kapağı yerleştirin.
2. Kur Micro-PET/CT Görüntüleme Akışı
- CT Toplama: tüm vücut BT tarama için 500 cari uA, 80kV, 200 msn de pozlama süresi ve 240 ° dönüş için 240 adımları gerilim ayarlanır. X-ray dedektörü için, 78 mm aksiyel görüntüleme alanı ve tek kişilik yatak modu ile "düşük sistem büyütme" çözünürlük seçin. Böylece "Ortak Cone-Beam İmar" yöntemi ile "gerçek zamanlı rekonstrüksiyon" seçeneğini ile ana bilgisayar görüşmelergörevi başlatmak için özel bir gerçek zamanlı rekonstrüksiyon bilgisayar (Kobra).
- PET Emisyon Toplama: "zaman kazanmak" seçeneğinde "sabit tarama zamanı" için Set 600 saniye (10 dakika). "Çalışma izotop" F-18 seçin ve "enerji seviyesi" olarak 350-650 keV kullanın.
- PET Emisyon Histogram: statik tarama elde etmek için, sürenin tamamı için bir çerçeve olarak işlem verileri için "siyah" olarak ayarla "dinamik çerçeve". Histogram türü olarak "3D" seçin ve "hayır dağılım düzeltme" seçin.
- PET İmar: rekonstrüksiyon algoritması olarak 2D Z'ye Altküme Beklenti Maksimizasyonu (OSEM2D) kullanın.
3. FDG enjeksiyonu
- Görüntüleme laboratuara onun varış ~ 30 dk zamanlanmış ilk enjeksiyon öncesi için bölgesel bir satıcıdan 18F-FDG (10 mCi) bir klinik paket sipariş. Radyoaktif malzemeler içeren paketi almak ve incelemektir enstitünün güvenlik prosedürleri takipls (RAM).
- L-blok masa üstü kalkan kısım FDG ve steril serum fizyolojik ile dilüsyon yapmak tarafından sağlanan koruma ile. FDG nispi aktivite konsantrasyonu her bir enjeksiyon için 200-300 μCi/100 ul de mevcut olmalıdır. 26G 1/2 inç iğne ile bir 1 ml şırınga içine FDG çözelti çekmek ve bir doz kalibratör ile bütün şırınga radyoaktivitesi ölçülür.
- Sadece intraperitoneal (ip) yoldan FDG çözeltisinden 100 ul soğuk oda (Adım 1.4 'e bakınız) taşınır hayvan enjekte. Enjeksiyon zamanı kaydedin. Dozunu kalibratör ile tekrar şırınga kalıntı radyoaktivite ölçülür.
- Buz ile tutulan bir köpük soğutucu içinde soğuk kafesine geri hayvan koyun. FDG alımı için, 1 saat boyunca soğuk (~ 4 ° C) içinde hayvan inkübe edin.
- Aşağıdaki formül ile her bir fare için enjeksiyon FDG etkinlik hesaplanır:
Enjeksiyondan önce enjektör içerisinde Injected aktivite (μCi) = aktivitesi- Enjeksiyondan sonra şırınga faaliyet
4. Micro-PET/CT Görüntüleme
- Micro-PET/CT görüntüleme soğuk tedaviden sonra FDG enjeksiyon ya da 5 saat sonra 1 saat başlar. Oksijen İzofluran% 3 ile anestezi indüksiyon odasına hayvan koyun.
- Bir kez anestezi meydana gelir, hayvanın kafa sürekli olarak 2 L / dak 'lık bir akış hızında (% 2) Isoflurane sağlayan bir koni yüz maskesi içinde oturtulmuş bir mikro-pelet CT (hayvan yatağı) üzerine hareket eder. Bir elektrikli ısıtma yastığı (BioVet, m2m Imaging Corp) vücut ısısını korumaya yardımcı olmak için hayvanın altına yerleştirilir.
- MM tarayıcının giriş hayvan kaydırın, araç çubuğundan "lazer" simgesini etkinleştirmek ve hayvanın göğüs yatay ve dikey lazer çizgileri arasında çapraz üstünde olacak şekilde yatakta hareket ettirmek için dokunmatik kontrolü kullanın. "Lazer hizalama" penceresinde Optio olarak "PET edinimi iş akışı dahil" CT tarama gibi "ilk tarama tipi" seçin ven.
- "Scout Görünüm" penceresini açın ve x-ray grafisi bir izci görünüm kazanır. CT bakış merkez alan fare gövde (karaciğer) merkezinde yer alır, böylece hayvan yatağın pozisyonunu ayarlamak için IAW kullanın. Bu adımı gerekirse tekrarlayın.
- Adım 2 yılında kurulan "iş akışı" başlayın. Seçenekleri açılır, CT yeniden kullanılmak üzere uygun bir 3D PET-BT dönüşüm matrisi dosyayı seçin ve zayflama düzeltme ile PET rekonstrüksiyon için yeni oluşturulmuş normalleşme dosyası seçin. IAW sonra BT ve PET taramaları sıralı olarak programlanmıştır başlayacaktır.
- Tüm iş akışı tamamlandıktan sonra, hangi 20-25 dakika sürebilir, kısaca edinilen CT ve ASIPro VM, bir mikro-PET analiz yazılımı IAW ile birlikte yüklü PET görüntülerinin kalitesini değerlendirmek. Arşiv görüntüleme bir veri depolama aygıtına veri veya daha fazla analiz için bir post görüntü analiz istasyonu (Adım 5) ağ üzerinden veri aktarımı.
- Release görüntüleme sistemlerinden hayvan ve oda sıcaklığında kurtarma için normal gıda ve su ile temiz bir konut kafesine yerleştirin. Sistemleri artık kuyruğunda sonraki hayvan için hazırız. Sonrası görüntüleme hayvanların bakımı ve kullanımı "RAM ile enjekte laboratuar hayvanlarının kullanımı" ile ilgili enstitünün düzenlemelere uymak gerekir unutmayın. Ayrıca enstitünün ilgili RAM atık bertaraf yönetmeliklerine göre iğne / şırınga, emici pedler, eldiven, ve tüm yatak kullanılan ve dışkı, radyoaktif atık olarak kabul edilmeli ve ele unutmayın.
5. Post-görüntüleme Analizi
- El Açık Inveon Araştırma İşyeri (IRW) yazılım (Siemens) ve BT ve PET veri setleri hem içe. "Kayıt" "Genel analizi" fonksiyonu ile araçlarını kullanarak pencere ve "Yorum" penceresi altında Co-kayıt BT ve PET görüntüleri BT ve tüm 3 boyutlu PET görüntüleri arasında mükemmel bir uyum emin olun.
- Co-kayıtlı BT görüntüleri tarafından sağlanan referansları ile "Region of Interest (ROI) Niceleme" penceresinde, Nereden, boyun, erişkin farelerde en baskın soğuk indüklenebilir BAT interskapular bölgede BAT belirlemek ve ilgi hacmi çekmek (VOI) PET veri seti üzerinde BAT. "Niceleme Türü" olarak "Voksel Yoğunluğu" seçin ve Bq / ml olarak VOI içinde ortalama radyoaktivite kaydedin. Bq / ml sayım / sn dönüştüren bir kalibrasyon faktörü önceden bilinen radyoaktivite ile bir hayalet tarama tarafından kurulmuştur.
- BAT FDG tutulumu çürüme düzeltme gram doku başına yüzde enjekte doz (% ID / g) olarak ölçülür. Enjekte edilen doz Adım 3.5 sonucu olan, ancak, becquerel (Bq) bloğu (1 μCi = 37,000 Bq) dönüştürülür, bu doku, 1 ml 1 g eşit olduğunu varsaymaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fare BAT micro-PET/CT görüntüleme bir örneği Şekil 1'de gösterilmiştir. BT görüntüleme anatomik bilgi sağlar iken, PET görüntüleme bütün vücutta 18F-FDG tutulumunun dağılımı ve miktarı kodlar. Bu görüntüleme verileri (1C) erimiş, ya da maksimal intensite projeksiyon (MIP, 1D) gibi bir 3D özelliği ile gösterdi (1A ve 1B) ayrı ayrı izlenebilir. 3 boyutlu bir görüntüleme aracı, ilgilenilen bir hacim (VOI) yardımı ile, burada interskapular BAT bölgesi (Şekil 1 'de oklarla gösterilmektedir), PET görüntüleri ve VOI içinde toplam sinyaller üzerinden çekilmektedir% kimlik dönüştürülebilir gram doku başına enjekte edilen dozun yüzdesi (% ID) temsil / g. Fare göstermiştir olarak, BAT FDG tutulumu% 19 ID / g. Bu soğuk indüksiyon ve görüntüleme protokolü up-regülasyonu veya aşağı-düzenlemenin her iki durumda da, değişmiş bir BAT aktiviteyi tespit etmek için yeterince duyarlı olup olmadığını doğrulamak için, biz β kullanılanadrenoseptör antagonisti sırasıyla BAT indüksiyonu 16, geliştirmek için BRL37344 BAT aktivasyon 15 ve β3 agonist bastırmak için propranolol. Bu farmakolojik müdahaleler FDG enjeksiyonu öncesi 30 dk, hassas soğuk tedavisi sırasında uygulanan ve yapılmıştır. BRL37344 belirgin bir şekilde kayması, taşıtın kontrol ile karşılaştırıldığında yükseltilmiş kavrama oysa PET / BT görüntüleme (Şekil 2A) ve analizi (Şekil 2B), propranolol tedavisinde önemli BAT FDG alımı azalttığını göstermiştir.
Şekil 1. 5 saat soğuk tedavi sonrasında bir fare BAT Micro-PET/CT görüntüleme. CT görüntüsünün (A) A koronal kesit. (B) PET bir koronal kesit "A" CT ile birlikte kayıtlı. (C) A erimiş PET / CT görüntü "A" ve "B" bindirme kaynaklanmıştır. (D) Maksimal yoğunluğu projectisigortalı PET / BT görüntüleri (MIP) sunumu. Sarı oklar: interskapular kahverengi adipoz doku karşılık gelen alanın.
Şekil 2. Adrenoseptör ilaçların BAT aktivite alterasyon gösteri Micro-PET/CT. Farklı ilaçlar ile tedavi edilen farelerde (A) 18F-FDG PET / BT görüntüleme. a) PBS (kontrol). b) (β antagonisti, 5mg/kg, ip) Propranolol. BAT alan FDG alımı belirgin bir azalma not edin. c) BRL37344 (β3 agonist, 5mg/kg, ip). BAT FDG birikimi önemli bir artış dikkat edin. Sarı oklar: interskapular kahverengi adipoz doku karşılık gelen alanın. BAT FDG tutulumu (B) Kantitatif analiz. % Değerleri ID / g (yüzde gram doku başına doz enjekte) (ortalama ± SD) sunulmuştur. n, PBS grubunda = 10, n ve her ikisi de Propranolol BRL37344 gruplar için 5 =. *, P <0.05; **p <0,005 olduğu gibi PBS grubuna kıyasla.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada, bir micro-PET/CT-based görüntüleme yöntemi sadece bir soğuk işleme ve 18 F-FDG ticari olarak mevcut bir enjeksiyon gerektirir yetişkin farelerde BAT aktiviteleri tespit etmek için geliştirilmiştir. Tüm prosedürü bir tedavi ve bütün hayvanların tedavi ve görüntülü kadar her 30 dakikada başlar görüntüleme sırasını izleyerek bir gün içinde yapılabilir. Anlatılan deney koşulları altında, 10 fareler (5 fare ya da 2 grup) toplam tek bir görüntüleme sistemi ile aynı günde test edilebilir. Daha önce 17 rapor edildiği gibi 2 veya daha fazla hayvan özel tasarlanmış bir hayvan yatakta aynı anda taranabilir halinde üretilen bu tür sınırlaması kaldırılabilir. Biz CT tarafından verilen detaylı anatomik bilgi yararlanır kombine micro-PET/CT görüntüleme sisteminin kullanımına dayalı çalışma tamamlamak için. Ancak, tek başına bir mikro-PET ayrıca zaman 57 C görevi yerine getirmek için yapabiliyoro iletim taraması önce F18 emisyon veri toplama için akışı eklenir. 57 Co iletim veri PET görüntü rekonstrüksiyon sırasında atenüasyon düzeltmesi için kullanılabilir ve aynı zamanda anatomik lokalizasyon için yeniden inşa edilebilir.
Bu protokolün bir kritik adım soğuk tedavi (örn., bu çalışmada 5 saat) süresini optimize etmektir. Daha kısa süreli zaman veya soğuğa maruz kalma ortadan kaldırılması yakın plan bir etkinlik üretebilir ve yöntemi BAT herhangi bir down-regülasyonu (zemin etkisi) duyarsız olabilir. Buna karşılık, ince uzun bir soğuğa maruz kalma (örneğin gece veya 24 saat olarak) BAT up-regülasyonu (tavan etkisi) herhangi bir farklılık maskeleme doymuş olabilir indüksiyon ve yöntemi maksimize edebilir. Bu protokolü açıklanan Optimize koşulları propranolol bastırma ve β3 agonist BRL37344 stimülasyon testleri (Şekil 2 ile valide edilmiştir
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Yazarlar bu yöntem geliştirme konusundaki yorumlar yararlı ve teknik destek için Laura Diaz, Kevin Phillips, Willa A. Hsueh ve Kral C. Li teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro-PET/CT Imaging System | Siemens Medical Solutions USA, Inc. | Inveon Dedicated PET System and Inveon Multimodality CT/SPECT System (docked) | |
| Propranolol | Sigma | P0884 | |
| BRL 37344 | Sigma | B169 | |
| 18F-FDG | Cyclotope Inc. | ||
| C57BL/6J Male Mice | Jackson Laboratory | 000664 | 3-4 months old |
References
- Cypess, A. M., Kahn, C. R. The role and importance of brown adipose tissue in energy homeostasis. Curr. Opin. Pediatr. 22, 478-484 (2010).
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiol. Rev. 84, 277-359 (2004).
- Collins, S., Surwit, R. S. The beta-adrenergic receptors and the control of adipose tissue metabolism and thermogenesis. Recent Prog. Horm. Res. 56, 309-328 (2001).
- Ouellet, V., et al. Outdoor temperature, age, sex, body mass index, and diabetic status determine the prevalence, mass, and glucose-uptake activity of 18F-FDG-detected BAT in humans. J. Clin. Endocrinol. Metab. 96, 1115-1125 (2011).
- Cypess, A. M. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. N. Engl. J. Med. 360, 1509-1517 (2009).
- Fruhbeck, G., Becerril, S., Sainz, N., Garrastachu, P., Garcia-Velloso, M. J. BAT: a new target for human obesity. Trends Pharmacol. Sci. 30, 387-396 (2009).
- Cypess, A. M., Kahn, C. R. Brown fat as a therapy for obesity and diabetes. Curr. Opin. Endocrinol. Diabetes Obes. 17, 143-149 (2010).
- Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. N. Engl. J. Med. 360, 1518-1525 (2009).
- van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. N. Engl. J. Med. 360, 1500-1508 (2009).
- Cohade, C., Mourtzikos, K. A., Wahl, R. L. "USA-Fat": prevalence is related to ambient outdoor temperature-evaluation with 18F-FDG PET/CT. J. Nucl. Med. 44, 1267-1270 (2003).
- Garcia, C. A. Reduction of brown fat 2-deoxy-2-[F-18]fluoro-D-glucose uptake by controlling environmental temperature prior to positron emission tomography scan. Mol. Imaging Biol. 8, 24-29 (2006).
- Saito, M. High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity. Diabetes. 58, 1526-1531 (2009).
- Agrawal, A., Nair, N., Baghel, N. S. A novel approach for reduction of brown fat uptake on FDG PET. Br. J. Radiol. 82, 626-631 (2009).
- Soderlund, V., Larsson, S. A., Jacobsson, H. Reduction of FDG uptake in brown adipose tissue in clinical patients by a single dose of propranolol. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 34, 1018-1022 (2007).
- Zhao, J., Cannon, B., Nedergaard, J. Thermogenesis is beta3- but not beta1-adrenergically mediated in rat brown fat cells, even after cold acclimation. Am. J. Physiol. 275, 2002-2011 (1998).
- Rowland, D. J., Garbow, J. R., Laforest, R., Snyder, A. Z. Registration of [18F]FDG microPET and small-animal MRI. Nucl. Med. Biol. 32, 567-5672 (2005).
