Summary
功能成像的小鼠棕色脂肪组织（BAT）的方法进行了说明，冷刺激BAT摄取18F-脱氧葡萄糖（FDG）的非侵入性评估与标准化的micro-PET/CT协议。这种方法的鲁棒性和敏感的检测BAT活动在小鼠模型中的差异。
Abstract
其离散的位置，由于丰富的血管和高密度的线粒体和棕红色，褐色脂肪组织（BAT）与白色脂肪组织（WAT）。在新生哺乳动物的能量消耗和非颤抖性产热以及成人1 BAT发挥了重要作用。 BAT-介导的产热是由交感神经系统高度管制的，主要是通过β肾上腺素能受体2，3。最近的研究显示，英美烟草公司活动呈负相关，与成人的身体质量指数（BMI）和其他糖尿病参数4-6。因此，英美烟草公司提出专注于调制的能量平衡6-8 anti-obesity/anti-diabetes治疗的潜在目标。几个冷的挑战正电子发射断层扫描（PET）方法，建立了用于检测人BAT 9-13，基本上是没有什么标准协议的成像的量化ication的小动物模型，如小鼠BAT。在这里，我们描述了一个强大的PET / CT成像方法在小鼠BAT功能评估。简单地说，成年小鼠冷处理在空腹状态下，持续时间4小时之前，他们收到了一剂18 F-脱氧葡萄糖（FDG）。将小鼠保持在寒冷的一个额外小时后FDG注射，然后一个小的动物专用micro-PET/CT系统与扫描。所收购的PET图像共同登记的的CT图像解剖引用，并分析了FDG摄取在肩胛间BAT区提出BAT活动。这种标准化的冷处理和成像协议已经验证通过测试BAT活动，例如，在药物干预的抑制的BAT活化治疗β-受体阻滞剂心得安，14，15，或增强BAT激活β3受体激动剂BRL37344 16。法德cribed在这里可以应用到屏幕的药物/化合物，调节BAT的活动，或确定基因/ BAT各种临床前研究和基础研究的发展和法规中所涉及的途径。
Protocol
1。动物的制备和冷处理
- 找到并检查了4℃冷室中，已被批准用于容纳实验室小鼠。
- 预冷动物的笼子，在寒冷的房间里过夜。网箱组装饲料和床上用品，但没有一瓶水。
- 在的实验一天早上，地方小鼠一个由一个以30分钟的间隔到各预冷的笼子。每个单笼的鼠标应该留在寒冷的房间了近4个小时，然后才运到的成像实验室。确保小鼠禁食，但获得水。
- 后4小时冷处理运输动物在同一时间，每30分钟的成像实验室。这可以通过以下来实现填充一个塑料容器中，用冰和冰内盒的顶部放置一个预冷冻的住房笼。松散地放置在封面上的泡沫塑料盒。
2。设置Micro-PET/CT成像流程
- CT采集 ：对于一个全身CT扫描，设置在500微安的电流，电压在80KV，曝光时间为200毫秒，240步，240°旋转。对于X射线探测器，在“低系统放大倍率为78毫米的轴向成像领域和一张单人床模式选择分辨率。选择“实时重建”使用“通用锥束重建”的方法，使主机PC会谈的专用的实时重建计算机（眼镜蛇）启动任务。
- PET发射采集 ：设置为600秒（10分钟）在“获取时间”选项中的“固定扫描时间”。选择F-18“研究同位素”，并使用350-650千电子伏的能量水平“。
- PET排放直方图 ：将“动态帧”，“黑”过程数据作为一帧的整个持续时间实现静态扫描。选择“3D”作为直方图类型，选择“不分散修正”。
- PET图像重建 ：使用二维有序的子集期望最大化（OSEM2D）的重建算法。
3。注射FDG
- 订购的18 F-FDG（10 mCi）的临床包从当地供应商，它的到来〜30分钟之前预定的第一次注射的成像实验室。按照该机构的安全程序，以接收和调查的程序包，其中包含放射性本草的ls（RAM）。
- 提供的L-块表顶盾，分装FDG，并用无菌生理盐水稀释的保护。 FDG的稀释活度浓度应可在200-300μCi/100UL，每次注射。绘制的葡萄糖溶液1毫升注射器26G 1/2寸毫针，并测量放射性的剂量校准的注射器。
- 注入动物，只是输送FDG溶液与100μl通过腹腔内（IP）的路由从冷室（见步骤1.4）。记录的喷射时间。注射器的再次测量残余物的放射性剂量校准器。
- 将动物的冷笼子内保持着冰保丽龙冷却器。孵育1小时FDG摄取动物在寒冷的（〜4°C）。
- 计算各小鼠注入FDG活性由下式：
注射的活性（微居里）=活动注射器注射前- 注射器注射后活动
4。 Micro-PET/CT成像
- micro-PET/CT成像开始1小时后的葡萄糖注射液或5小时后的冷处理。将动物麻醉诱导室与3％异氟醚氧。
- 麻醉诱导后，动物被移动到一个微型CT粒料（动物床）与它的头靠在一个锥形内面罩，不断提供异氟醚（2％），在2升/分钟的流速。电热垫（BioVet，M2M IMAGING CORP。）下的动物，以帮助维持体温。
- 将动物的MM扫描仪的入口，启动“激光”从工具栏上的图标，并使用触摸板控制来移动床，让胸部的动物是在十字架上的水平和垂直的激光线。在“的激光对齐”窗口中，选择“先扫描类型”CT扫描，和“工作流程中的收购包括PET”的OPTION。
- 打开“童军视图”窗口和取得的球探视图X射线摄片。使用IAW动物床的位置调整，使得它的中心的CT视图字段位于鼠标的中心体（肝脏）。如有必要，重复此步骤。
- 启动在步骤2中建立的“工作流”。当选项出现，选择一个合适的3D PET-CT变换矩阵文件中使用的CT重建，并选择最近创建的文件没有衰减校正的PET重建正常化。 ，IAW将开始CT和PET扫描顺序编程。
- 在整个工作流程完成，这可能需要20-25分钟，简单的质量评价所获得的CT和PET图像与ASIPro微型PET分析软件的虚拟机，安装了IAW。存档的摄像数据的数据存储装置，或通过网络将数据传输到后成像分析工作站（见步骤5），以供进一步分析。
- Relea从成像系统本身的动物，并将其放置到一个干净的壳体保持架，其在室温下的恢复正常的食物和水供应。该系统现在已经准备好为在队列中的下一个动物。请注意照顾和处理后成像的动物应遵守学院的规定“处理实验动物注射RAM”。另外还要注意所使用的针头/注射器，吸水垫，手套，和所有床上用品和排泄物应被视为放射性废物，并根据学院的有关RAM废弃物处理法规进行处理。
5。后成像分析
- 开放Inveon研究工作场所（IRW）软件（西门子）和手动导入CT和PET数据集。合作寄存器的CT和PET图像中的“注册”窗口“分析”功能使用的工具，并在“审阅”窗口中确保一个完美的CT和PET图像在三维空间之间的一致性。
- 从“感兴趣区域（ROI）量化”的窗口，提供的参考共同注册的CT图像，确定在肩胛间区的脖子在成年小鼠中，最主要的冷诱导BAT BAT，绘制感兴趣体积（VOI）的英美烟草公司在PET数据集。 “量化类型”选择“体素灰度”和贝克/毫升的VOI内录得的平均放射性。校准系数转换成计数/秒贝克/毫升先前已建立了一个幽灵与已知的放射性扫描。
- FDG摄取BAT被量化为每克组织百分注射剂量（％ID / g）的衰减校正。的注射剂量是3.5的步骤的结果，然而，转换贝克（Bq）的单元（1微居里= 37,000 Bq）为，我们假设一个1毫升的组织等于1克。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
小鼠BAT micro-PET/CT成像的一个例子示出在图1中。虽然CT成像提供解剖信息，PET成像编码的18 F-FDG摄取的分布和数量在整个身体。这些成像数据可以被分开（图1A和图1B），稠合的（1C），如最大强度投影（MIP，1D）与3D特征或演示。随着三维成像工具，感兴趣的体积（VOI）的帮助下，肩胛间BAT区域（ 图1中箭头所示），在这里上绘制的PET图像和总信号内的VOI％ID可以被转换成/ g时，表示的百分比每克组织的注射剂量（％ID）。在小鼠证明，FDG摄取的BAT为19％ID /克。为了验证这个寒冷的感应和成像协议是敏感，可以探测改变BAT的活动，在这两种情况下，上调或下调，我们使用β肾上腺素能受体拮抗剂普萘洛尔抑制的BAT活化15，和β3激动剂BRL37344 BAT感应16，分别以加强。冷处理过程中应用这些药物干预的，准确的说，在注射FDG前30分钟。 PET / CT成像（ 图2A）和（ 图2B）的分析表明，普萘洛尔治疗的显着降低，而在BAT FDG摄取BRL37344显着升高的吸收，与车辆用控制相比。
图1。5小时冷处理后的小鼠BAT Micro-PET/CT成像。 （A）A冠部CT图像。 （B）A冠部注册的PET图像与CT在“A”。 （C）稠合PET / CT图像导致从重叠的“A”和“B”。 （D）最大强度投影法（MIP）介绍的PET / CT融合图像。黄色箭头：肩胛间的棕色脂肪组织相对应的区域。
图2。Micro-PET/CT示范肾上腺素受体 药物的BAT活性的变化。 （A）18 F-FDG PET / CT成像不同药物治疗的小鼠。一）PBS（对照）。 B）普萘洛尔（β受体拮抗剂，5mg/kg体重，IP）。注意BAT面积显着减少的FDG摄取。 C）BRL37344（β3受体激动剂，5mg/kg体重，IP）。请注意FDG积聚在英美烟草公司的一个显着增加。黄色箭头：肩胛间的棕色脂肪组织相对应的区域。 （B）定量分析的FDG摄取BAT。值的％ID /克（每克组织百分注射剂量）（平均值±SD）。每组10的PBS组，每组5为普萘洛尔和BRL37344组。 *表示p <0.05; **P <0.005，与PBS对照组相比。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
在这项研究中的一个micro-PET/CT-based成像方法已发展为在成年小鼠中检测BAT活动只需要一个冷处理和注射市售18 F-FDG。整个的过程可以在一天内完成后开始，每30分钟，直到所有的动物处理和成像处理和成像顺序。共10只小鼠（或2组，每组5只小鼠），在实验条件下，可以在同一天进行测试，用一个单一的成像系统。如果2个或更多的动物可以在一个特别设计的动物床同时扫描，因为它先前已报道17，不限于这种类型的吞吐量可以解除。为了完成这项研究，我们依靠的组合micro-PET/CT的利用提供详细的解剖信息的CT成像系统的使用。然而，一个独立的微PET也能完成任务时，57 CO传输扫描被添加到之前的工作流程F18排放数据采集。可以使用的57有限公司发送数据进行衰减校正PET图像重建过程中，也可以重建解剖定位。
此协议的一个关键步骤是优化的治疗感冒的持续时间（ 例如在这项研究中，5小时）。一个较短的时间或消除冷暴露可能会产生一个活动的背景和方法可以不受任何下调的BAT（地面效应）。与此相反，细长的暴露于寒冷的环境（如过夜，或24小时），可最大限度地提高了归纳和方法可以掩盖上调BAT（天花板效应）的差异趋于饱和。在本协议中所述的优化条件下，已验证通过普萘洛尔抑制和β3受体激动剂BRL37344刺激测试（ 图2
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
作者要感谢劳拉·迪亚斯，凯文·菲利普斯，薇拉薛，王C.李的宝贵意见和技术支持，在发展这种方法。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro-PET/CT Imaging System | Siemens Medical Solutions USA, Inc. | Inveon Dedicated PET System and Inveon Multimodality CT/SPECT System (docked) | |
| Propranolol | Sigma | P0884 | |
| BRL 37344 | Sigma | B169 | |
| 18F-FDG | Cyclotope Inc. | ||
| C57BL/6J Male Mice | Jackson Laboratory | 000664 | 3-4 months old |
References
- Cypess, A. M., Kahn, C. R. The role and importance of brown adipose tissue in energy homeostasis. Curr. Opin. Pediatr. 22, 478-484 (2010).
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiol. Rev. 84, 277-359 (2004).
- Collins, S., Surwit, R. S. The beta-adrenergic receptors and the control of adipose tissue metabolism and thermogenesis. Recent Prog. Horm. Res. 56, 309-328 (2001).
- Ouellet, V., et al. Outdoor temperature, age, sex, body mass index, and diabetic status determine the prevalence, mass, and glucose-uptake activity of 18F-FDG-detected BAT in humans. J. Clin. Endocrinol. Metab. 96, 1115-1125 (2011).
- Cypess, A. M. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. N. Engl. J. Med. 360, 1509-1517 (2009).
- Fruhbeck, G., Becerril, S., Sainz, N., Garrastachu, P., Garcia-Velloso, M. J. BAT: a new target for human obesity. Trends Pharmacol. Sci. 30, 387-396 (2009).
- Cypess, A. M., Kahn, C. R. Brown fat as a therapy for obesity and diabetes. Curr. Opin. Endocrinol. Diabetes Obes. 17, 143-149 (2010).
- Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. N. Engl. J. Med. 360, 1518-1525 (2009).
- van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. N. Engl. J. Med. 360, 1500-1508 (2009).
- Cohade, C., Mourtzikos, K. A., Wahl, R. L. "USA-Fat": prevalence is related to ambient outdoor temperature-evaluation with 18F-FDG PET/CT. J. Nucl. Med. 44, 1267-1270 (2003).
- Garcia, C. A. Reduction of brown fat 2-deoxy-2-[F-18]fluoro-D-glucose uptake by controlling environmental temperature prior to positron emission tomography scan. Mol. Imaging Biol. 8, 24-29 (2006).
- Saito, M. High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity. Diabetes. 58, 1526-1531 (2009).
- Agrawal, A., Nair, N., Baghel, N. S. A novel approach for reduction of brown fat uptake on FDG PET. Br. J. Radiol. 82, 626-631 (2009).
- Soderlund, V., Larsson, S. A., Jacobsson, H. Reduction of FDG uptake in brown adipose tissue in clinical patients by a single dose of propranolol. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 34, 1018-1022 (2007).
- Zhao, J., Cannon, B., Nedergaard, J. Thermogenesis is beta3- but not beta1-adrenergically mediated in rat brown fat cells, even after cold acclimation. Am. J. Physiol. 275, 2002-2011 (1998).
- Rowland, D. J., Garbow, J. R., Laforest, R., Snyder, A. Z. Registration of [18F]FDG microPET and small-animal MRI. Nucl. Med. Biol. 32, 567-5672 (2005).
