Summary
マウス褐色脂肪組織（BAT）の機能イメージングの方法は、BAT内の18F-フルオロデオキシグルコース（FDG）の冷刺激取り込みが非侵襲的に標準化されたmicro-PET/CTプロトコルと評価されるで説明されています。この方法では、マウスモデルで、BATの活動の違いを検出する堅牢性と小文字が区別されます。
Abstract
褐色脂肪組織（BAT）はその離散場所と豊富な血管新生およびミトコンドリアの高密度化のために赤褐色の色によって白色脂肪組織（WAT）とは異なります。 BATは、エネルギー消費と非ふるえ熱産新生児哺乳類においてだけでなく、大人1において主要な役割を果たす。 BATの媒介熱発生は非常にβアドレナリン受容体2、3を介して主に、交感神経系によって調節されている。最近の研究では、人間の成人におけるBATの活動が否定的にボディ·マス·インデックス（BMI）と他の糖尿病パラメータ4月6日と相関していることが示されている。 BATはこうしてエネルギーバランス6-8の変調に着目しanti-obesity/anti-diabetes療法のための潜在的なターゲットとして提案されている。いくつかの冷たいチャレンジベースの陽電子放射断層撮影（PET）の方法は、人間のBAT 9-13を検出するために確立されている間、イメージングおよびquantifのための標準化されたプロトコルは、基本的にありませんマウスなどの小動物モデルにおけるBATのication。ここでは、マウスでのBATの機能評価のための堅牢なPET / CTイメージング法を説明します。彼らは、18 F-フルオロデオキシグルコース（FDG）のいずれかの用量を受信する前に簡単に説明すると、成人のC57BL/6Jマウスは、4時間の持続時間のために絶食条件下で処理冷たかった。マウスは、さらに1時間のポストFDGの注射のために寒さの中に残っており、その後、小動物専用micro-PET/CTシステムをスキャンした。取得したPET画像は、解剖学的参照用のCT画像と共に登録とBATの活動を提示するために肩甲骨間BAT領域にFDGの取り込みについて分析した。この標準化された冷治療とイメージングプロトコルは14プロプラノロールのβ-アドレナリン受容体拮抗薬の治療によって抑制BATの活性化、15、または強化されたBATの活性化は、β3アゴニストBRL37344 16により、例えば、薬理学的介入の間にテストBATの活動を通じて検証されています。方法デここcribedはBATの活性を調節する薬剤/化合物をスクリーニングするために適用することができ、または様々な前臨床および基礎研究のBAT開発や調節に関与している遺伝子/経路を特定することができます。
Protocol
1。動物の準備とコールドトリートメント
- 実験用マウスを収容するための承認されている4℃の低温室を探して、点検してください。
- 寒い部屋の中で一晩プレチル動物ケージ。ケージは、飼料及び敷料なしであるが、水のボトルと組み立てられる。
- 実験当日の午前中に、場所のマウスの30分間隔で予冷ケージのそれぞれに一つずつ。それはイメージングラボに輸送される前に、各単独ケージマウスは、ほぼ4時間寒い部屋に滞在する必要があります。マウスは断食をしているが、水へのアクセスを確認します。
- イメージングラボ一度に4時間後に低温処理輸送で一匹は30分毎。これは、氷と発泡スチロールの容器に充填し、ボックス内の氷の上に予め冷却住宅ケージを配置することによって実現できます。緩く発泡スチロールの箱にカバーを置きます。
2。セットアップMicro-PET/CTイメージングワークフロー
- CTの取得 ：全身CTスキャンについては、500 UA、80kVの電圧が、200ミリ秒の露光時間、240°の回転のための240のステップで電流を設定します。 X線検出器については、78ミリメートル軸イメージング分野とシングルベッドモードで "低システム倍率"で解像度を選択します。そのため、 "共通のコーンビーム再構成"メソッドを使って "リアルタイム再構築"を選択してホストPCの協議タスクを開始するために、専用のリアルタイム再構成コンピュータ（コブラ）。
- PETのエミッション取得 ： "時間によって獲得する"オプションで"固定スキャン時間"で設定した600秒（10分）。 "研究同位体"としてF-18を選択して、 "エネルギーレベル"として350から650 keVのを使用しています。
- PETの排出ヒストグラム ：静的スキャンを実現するための全体の持続期間のための1フレームのようにデータを処理するために"黒"に設定"ダイナミックフレーム"。ヒストグラムのタイプとして "3D"を選択し、 "いいえ散乱補正"を選択してください。
- PETの再建 ：再構成アルゴリズムとして2D順序サブセット期待値最大化（OSEM2D）を使用します。
3。 FDGの注射
- 〜30分予定され、最初の注射の前にイメージングラボへの到着のための地域のベンダーから、18 F-FDG（10 MCI）の臨床的なパッケージをご注文ください。放射性マテリアを含むパッケージを受信し、調査する研究所の安全手順に従ってくださいLS（RAM）。
- Lブロックテーブルトップシールド、アリコートFDGと滅菌生理食塩水で希釈することによって提供される保護を持つ。 FDGの希釈された放射能濃度は、それぞれの注射用200から300μCi/100ULで利用可能であるべきです。 26G 1/2インチ針で1mlシリンジにFDGのソリューションを描画し、線量校正器と注射器全体の放射能を測定します。
- ちょうど腹腔内（ip）経路を介してのFDG溶液100μlと（ステップ1.4参照）寒い部屋から運ばれている動物を注入します。噴射時間を記録します。ドーズキャリブレータで再び注射器の残留放射能を測定します。
- 氷で維持発泡スチロールのクーラー内部冷たいケージに戻って動物を置く。 FDGの取り込みのために1時間寒い（〜4℃）で動物をインキュベートする。
- 次式により、各マウスのために注入FDGの活動を計算します。
注射前に注射器で注入された活動（μCiの）=活動- 注入後、シリンジ内の活動
4。 Micro-PET/CTイメージング
- micro-PET/CTイメージングはFDGの注射または低温処理後5時間後に1時間を開始します。酸素でイソフルラン3％麻酔導入室に動物を入れてください。
- 一度麻酔が誘発され、動物は2L /分の流量で連続的にイソフルラン提供コーンフェイスマスク（2％）以内で休んで、その頭を持つマイクロCTペレット（動物用ベッド）の上に移動されます。電気加熱パッド（BioVet、M2Mイメージング株式会社）は体温を維持するために動物の下に配置されます。
- MMのスキャナの入り口に動物をスライドさせ、ツールバーから "レーザー"アイコンをアクティブにして、動物の胸が水平と垂直のレーザーラインのクロスになるようにベッドを移動するタッチパッドのコントロールを使用します。 "レーザー整列"ウィンドウでOPTIOとして "PET収集、ワークフローに含まれている" CTスキャンのように "最初のスキャンの種類"を選択し、nである。
- "スカウトビュー"ウィンドウを開き、X線レントゲン写真スカウトビューを取得します。 CTのビューの中心分野はマウス本体（肝臓）の中心部に位置していますように、動物のベッドの位置を調整するIAWを使用しています。必要な場合は、この手順を繰り返します。
- ステップ2で確立された "ワークフロー"を起動します。オプションがポップアップするとき、CT再構成に使用する適切な3D PET-CT変換行列ファイルを選択して、無減衰補正のPET再構成のために最近作成された正規のファイルを選択します。 IAWその後、CTやPETスキャン順次プログラムどおりに開始されます。
- ワークフロー全体が完了した後、20〜25分かかることがあり、簡単にASIPro VM、マイクロPET解析ソフトウェアIAWと共インストールされて取得されたCTとPET画像の品質を評価する。アーカイブデータストレージデバイスにイメージングデータまたはさらに詳細な分析のためのポスト画像解析ワークステーション（ステップ5を参照）に、ネットワークを介してデータを転送します。
- ReleaSEは、イメージングシステムから動物、そして室温で、その回復のための正常な食糧と水の供給とクリーンな住宅ケージに入れてください。システムは現在、キュー内の次の動物のための準備が整いました。 "RAMを注入した実験動物の取り扱い"に関する研究所の規制に従うべきであるイメージング後の動物の管理と取り扱いに注意してください。また、研究所の関連するRAMの廃棄物処理規制に従って針/注射器、吸収性パッド、手袋、およびすべての寝具を使用し、糞便が、放射性廃棄物として考慮されるべきであると扱われることに注意してください。
5。ポストのイメージング解析
- オープンInveonリサーチ職場（IRW）ソフトウェア（シーメンス）、手動でCTとPETの両方のデータセットをインポートします。共同レジスタCTやPET画像 "一般的な分析"機能をツールを使用して "登録"ウィンドウで、 "レビュー"ウィンドウの下にあるすべての3次元的にCTとPETの画像間の確認に最適なアライメントを行う。
- "関心領域（ROI）を定量化"ウィンドウ、共同登録CT画像により提供される参照を持つ、首の肩甲骨間の領域では、BATを識別し、成体マウスの中で最も優勢な低温誘導性BATから、関心のあるボリュームを描く（VOI）PETデータセット上のBATの。 "定量化の種類"として "ボクセル強度"を選択し、ベクレル/ mlとしてVOI内の平均放射能を記録します。ベクレル/ mlまでカウント/秒に変換する校正係数は、以前から知られている放射能を持つファントムをスキャンすることによって確立されています。
- BAT内のFDG集積は、減衰補正を持つグラム組織当たりの割合注入量（％ID / g）として定量化される。注入された用量は、ステップ3.5の結果である、しかし、ベクレル（Bq）のユニット（1μCiの= 37,000ベクレル）に変換し、我々は組織の1ミリリットルが1グラムに等しいと仮定しています。
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Representative Results
マウスBATのmicro-PET/CTイメージングの例を図1に示します。 CT撮影は解剖学的情報を提供していますが、PETイメージングは全身の18 F-FDG集積の分布と量をエンコードします。これらの画像データは、（1Aおよび1B）別に見（1C）の融合した、またはそのような最大値投影（MIP、1D）などの3D機能を使用して実証することができます。ここに3Dイメージングツール、関心体積（VOI）、肩甲骨間BAT領域（ 図1の矢印で示されている）の助けを借りて、PET画像の上に描画され、VOI内の総信号は％IDに変換することができます組織1グラム当たり割合注射量（％ID）を表す/ gであった。実証マウスでは、BAT内のFDG取り込みは19％ID / gである。この冷誘導およびイメージングプロトコルがアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションのどちらの場合であっても、変更されたBATの活性を検出するのに十分な感度であるかどうかを検証するために、我々はβを使用アドレナリン受容体拮抗薬は、それぞれのBAT 16誘導を強化するには、BATの活性化15、およびβ3アゴニストBRL37344を抑制するプロプラノロール。これらの薬理学的介入はFDGの注射30分前に、正確に低温処理中に適用されるとした。 BRL37344が著しくとして溶媒対照と比較して、取り込みを上昇に対し、PET / CTイメージング（ 図2A）、解析（ 図2B）は 、プロプラノロール処置が著しく、BAT内のFDG集積を減少させることを示した。
図1：5時間冷処理した後、マウスでBATのイメージングをMicro-PET/CT。 CT画像の（A）の冠状断面。 （B）は、PET画像の冠状断面 "は"でCTと共同登録されています。 （C）の溶融PET / CTの画像は、 "A"と "B"の重畳に起因する。 （D）の最大強度projecti溶融PET / CT画像のプレゼンテーション（MIP）の上に。黄色の矢印：肩甲骨間褐色脂肪組織に対応する領域。
図2：アドレナリン受容体の薬によってBATの活動の変化のデモをMicro-PET/CT。異なる薬剤を投与したマウスの（）、18 F-FDG PET / CTイメージング。 a）は、PBS（対照）。 b）は（β拮抗薬、5mg/kgを、ip）をプロプラノロール。 BATの領域でFDG集積の著しい減少に注意してください。 c）のBRL37344（β3アゴニスト、5mg/kgを、腹腔内）。 BAT内のFDGの蓄積が有意に増加してください。黄色の矢印：肩甲骨間褐色脂肪組織に対応する領域。 （B）は、BAT内のFDG集積の定量分析。 ％の値のID / gは（組織1g当たり割合注射量）（mean±SD）で提示されます。 nはPBS群= 10;両方プロプラノロール及びBRL37344グループに対してn = 5である。 *はp <0.05、**、P <0.005、PBS群と比較して。
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Discussion
本研究ではmicro-PET/CT-basedイメージング法は、単に風邪治療や市販の18 F-FDGの1注入を必要とする成体マウスにおけるBATの活動を検出するために開発されました。全体の手順は、すべての動物が扱われ、画像化されるまで、30分ごとに開始され、治療と撮像シーケンス後に1日で行うことができます。概説した実験条件下で、10匹のマウス（または5匹の2群）の合計は、単一の撮像システムと同じ日にテストすることができます。それ以前に17が報告されているように、2つ以上の動物が特別に設計された動物のベッドの上で同時にスキャンすることができれば、スループットのこのタイプに制限は解除することができます。我々はCTによって提供される詳細な解剖学的情報を活用して複合micro-PET/CT撮像システムの使用に依存して研究を完了します。ただし、スタンドアロンマイクロPETはまた時57℃タスクを満たすことができるO送信スキャンは前F18排出データ収集にワークフローに追加されます。 57 Coの送信データは、PET画像再構成時に減衰補正のために使用することができ、また、解剖学的局在のために再構成することができる。
このプロトコルの重要なステップは、低温処理（ 例えば 、本研究では5時間）の持続時間を最適化することである。処理時間は短くまたは寒冷暴露の除去が近い背景に活動を生成することがあり、本方法は、BATの任意のダウンレギュレーション（床効果）の影響を受けないようすることができます。対照的に、細長い寒冷暴露（例えば一晩、または24時間など）がBATのアップレギュレーション（天井効果）の違いをマスキング飽和状態になることができると誘導法を最大にすることができる。このプロトコールに記載され最適化された条件は、プロプラノロール抑制およびβ3アゴニストBRL37344刺激テスト（ 図2を介して検証されています
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
著者らは、この手法の開発に有益なコメントや技術的なサポートのためにローラ·ディアス、ケヴィン·フィリップス、ウィラA. Hsueh、王で李に感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro-PET/CT Imaging System | Siemens Medical Solutions USA, Inc. | Inveon Dedicated PET System and Inveon Multimodality CT/SPECT System (docked) | |
| Propranolol | Sigma | P0884 | |
| BRL 37344 | Sigma | B169 | |
| 18F-FDG | Cyclotope Inc. | ||
| C57BL/6J Male Mice | Jackson Laboratory | 000664 | 3-4 months old |
References
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