Summary
Un método de obtención de imágenes funcionales de tejido de ratón adiposo marrón (BAT) se describe en frío que estimula la captación de 18F-fluorodeoxiglucosa (FDG) en la MTD es evaluar de forma no invasiva con un protocolo estandarizado micro-PET/CT. Este método es robusto y sensible para detectar diferencias en las actividades de BAT en modelos de ratón.
Abstract
Tejido adiposo marrón (BAT) difiere de tejido adiposo blanco (WAT) por su ubicación discreta y un color marrón-rojo debido a la vascularización rico y de alta densidad de las mitocondrias. BAT juega un papel importante en el gasto energético y no tiritando termogénesis en los mamíferos recién nacidos, así como los adultos 1. BAT-mediada por la termogénesis está altamente regulada por el sistema nervioso simpático, principalmente por medio del receptor adrenérgico β 2, 3. Estudios recientes han demostrado que las actividades de BAT en humanos adultos tienen una correlación negativa con el índice de masa corporal (IMC) y otros parámetros diabéticos 4-6. BAT Así, se ha propuesto como un objetivo potencial para la terapia anti-obesity/anti-diabetes centrándose en la modulación del balance energético de 6-8. Mientras que varios frías a base de desafío-tomografía por emisión de positrones (PET) se establecen los métodos para la detección de BAT humano 9-13, esencialmente no hay protocolo estandarizado para la obtención de imágenes y quantificación de BAT en modelos de animales pequeños tales como ratones. Aquí se describe un robusto PET / CT método de imagen para la evaluación funcional de las MTD en ratones. En pocas palabras, los ratones C57BL/6J adultos estaban fríos tratados bajo condiciones de ayuno con una duración de 4 horas antes de recibir una dosis de 18 F-fluorodesoxiglucosa (FDG). Los ratones se mantuvo en el frío por un puesto adicional de inyección de FDG horas, y luego escaneadas con un sistema micro-PET/CT pequeño animal dedicado. Las imágenes de PET adquiridas fueron co-registradas con las imágenes de TC para las referencias anatómicas y se analizó la captación de FDG en el área interescapular BAT para presentar la actividad de las MTD. Esta estandarizado en frío y tratamiento de protocolo de imágenes ha sido validado a través de actividades de prueba BAT durante las intervenciones farmacológicas, por ejemplo, la activación BAT suprimida por el tratamiento de la β-adrenérgico propranolol 14, 15, o la activación BAT mejorada por β3 agonista BRL37344 16. El método described aquí se puede aplicar para la detección de fármacos / compuestos que modulan la actividad de BAT, o para identificar los genes / vías que están involucrados en el desarrollo y regulación de BAT en diversos estudios preclínicos y de base.
Protocol
1. Animal Preparación y Tratamiento de Frío
- Localizar e inspeccionar un 4 ° C habitación fría que ha sido aprobado para el alojamiento de los ratones de laboratorio.
- Pre-frialdad animales durante la noche en el cuarto frío jaulas. Las jaulas se montan sin alimentación y las camas pero con una botella de agua.
- En la mañana del día experimental, los ratones lugar de uno en uno en cada una de las jaulas de pre-refrigerado a intervalos de 30 min. Cada ratón enjaulado individualmente deben permanecer en la sala fría durante casi 4 horas antes de su transporte al laboratorio de imagen. Asegúrese de que los ratones son el ayuno, pero con acceso al agua.
- A las 4 h después de transporte tratamiento en frío un animal a la vez cada 30 min para el laboratorio de imagen. Esto se puede lograr por llenado de un recipiente de espuma de poliestireno con hielo y la colocación de una jaula de alojamiento previamente enfriado en la parte superior del hielo dentro de la caja. Libremente colocar la tapa de la caja de espuma de poliestireno.
2. Configuración de flujo de trabajo de imágenes Micro-PET/CT
- CT adquisición: Para una tomografía computarizada de cuerpo entero, ajuste de corriente a 500 uA, la tensión en 80kV, tiempo de exposición de 200 ms y 240 pasos de 240 ° de rotación. Para detector de rayos X, seleccione Resolución en el "sistema de baja magnificación" con 78 mm de campo de imagen y el modo axial cama individual. Seleccione "reconstrucción en tiempo real" a través del "Common Cone-Beam Reconstrucción" método para que las conversaciones de PC host conun dedicado equipo de reconstrucción en tiempo real (Cobra) para iniciar la tarea.
- PET Adquisición de emisiones: Set 600 segundos (10 minutos) para el "tiempo de ciclo fijo" en el "adquirir por el tiempo" opción. Seleccione F-18 como "el estudio de isótopos" y utilizar 350-650 keV como "nivel de energía".
- PET Histograma de emisiones: Set "marco dinámico" como "negro" para procesar los datos como un marco para toda la duración de lograr exploración estática. Seleccione "3D" como el tipo de histograma y elija "sin corrección de dispersión".
- PET Reconstrucción: Use 2D Maximización Pedido Expectativa Subset (OSEM2D) como algoritmo de reconstrucción.
3. La inyección de FDG
- Solicite un paquete clínico de 18 F-FDG (10 mCi) de un proveedor regional de su llegada al laboratorio de imagen ~ 30 min antes de la primera inyección programada. Siga los procedimientos del instituto de seguridad para recibir y examinar el paquete que contiene materia radiactivals (RAM).
- Con la protección que ofrece un escudo de mesa L-bloque superior, la alícuota FDG y hacer diluciones con solución salina esterilizada. La concentración de actividad de la FDG diluida debe estar disponible a 200-300 μCi/100 ul para cada inyección. Dibujar la solución FDG en una jeringa de 1 ml con 26G 1/2 pulgada aguja, y medir la radiactividad de la jeringa entera con un calibrador de dosis.
- Inyectar al animal que es transportado desde la sala de frío (véase el Paso 1,4) con 100 l de solución de FDG a través de la vía intraperitoneal (ip). Registre el tiempo de inyección. Medir la radiactividad residuo de la jeringa de nuevo con el calibrador de dosis.
- Ponga el animal a la jaula frío dentro de una hielera de unicel mantenido con hielo. Incubar el animal en frío (~ 4 ° C) durante 1 hora para la captación de FDG.
- Cálculo de la actividad inyectada FDG para cada ratón mediante la siguiente fórmula:
Actividad inyectada (Ci) = actividad en la jeringa antes de la inyección- Actividad en la jeringa después de la inyección
4. Micro-PET/CT imágenes
- Las imágenes micro-PET/CT comienza 1 hora después de la inyección de FDG o 5 horas después del tratamiento en frío. Ponga el animal en una cámara de inducción de la anestesia con isoflurano 3% de oxígeno.
- Una vez que se induce la anestesia, el animal se mueve sobre una pastilla de micro-CT (cama de animales) con su cabeza descansando dentro de una máscara de cara cono que suministra continuamente isoflurano (2%) a un caudal de 2 L / min. Una almohadilla eléctrica de calentamiento (Biovet, m2m Imaging Corp.) se coloca bajo el animal, para ayudar a mantener la temperatura del cuerpo.
- Deslice el animal a la entrada del escáner MM, active el "láser" icono de la barra de herramientas y utilice el control de panel táctil para mover la cama para que el pecho del animal es en la cruz de líneas láser horizontales y verticales. En el "Laser Align" ventana, seleccione "Tipo de primer ciclo", como tomografía computarizada, y "adquisición PET incluido en el flujo de trabajo", como el option.
- Abra la ventana "Ver Scout" ventana y adquirir una visión explorador de rayos X radiografía. Use IAW para ajustar la posición de la cama animal de modo que el centro del campo de vista de CT se encuentra en el centro del cuerpo del ratón (hígado). Repita este paso si es necesario.
- Inicie el "flujo de trabajo" establecido en el Paso 2. Cuando las opciones de pop-up, seleccionar un rango de 3D PET-CT archivo de la matriz de transformación que se utilizarán en la reconstrucción de CT, y elegir un archivo de normalización recientemente creado para la reconstrucción de PET sin corrección de atenuación. El IAW continuación, se iniciará la TC y PET de forma secuencial según se haya programado.
- Después de que el flujo de trabajo conjunto se completa, que puede tomar 20 a 25 min, brevemente evaluar la calidad de la adquirieron imágenes de CT y PET con el VM ASIPro, un software de análisis de micro-PET co-instalado con IAW. Archivo de los datos de imagen en un dispositivo de almacenamiento de datos o transferir los datos a través de la red a una estación de trabajo de análisis de imágenes post (ver paso 5) para su posterior análisis.
- Releasí al animal de los sistemas de imagen y colocarlo a una jaula de alojamiento limpio y con comida normal y suministro de agua para su recuperación a temperatura ambiente. Los sistemas están ahora listos para el animal siguiente en la cola. Tenga en cuenta el cuidado y manejo de animales de imágenes post-deben seguir los reglamentos del Instituto en relación con "el manejo de animales de laboratorio inyectados con RAM". También tenga en cuenta que las agujas / jeringas, las almohadillas absorbentes, guantes y ropa de cama de todo y la materia fecal debe ser considerado como residuo radiactivo, y manejados de acuerdo a los reglamentos pertinentes del instituto RAM eliminación de residuos.
5. Post-Análisis de imágenes
- Open Research Inveon lugar de trabajo (CPIC) software (Siemens) y manualmente importar tanto la TC y PET conjuntos de datos. Co-registro de imágenes de TC y PET en "Registro" de la ventana usando herramientas con el "análisis general" la función, y en la sección "Opinión" ventana asegurarse una perfecta alineación entre la TC y las imágenes de PET en las 3 dimensiones.
- De "zona de interés (ROI) La cuantificación" de la ventana, con las referencias proporcionadas por las imágenes co-registradas CT, identificar BAT en la región interescapular del cuello, la más predominante inducible por frío BAT en ratones adultos, y dibujar volumen de interés (VOI) de BAT sobre el conjunto de datos de PET. Seleccione "Intensidad Voxel" como "Tipo de cuantificación" y registrar la radiactividad en el medio VOI como Bq / ml. Un factor de calibración que convierte cuentas / seg a Bq / ml ha sido previamente establecido mediante el escaneo de un fantasma con radioactividad conocida.
- La captación de FDG en la MTD se cuantifica como porcentaje de dosis inyectada por gramo de tejido (% ID / g) con la corrección de la descomposición. La dosis inyectada es el resultado del paso 3,5, sin embargo, se convirtió al becquerel (Bq) unidad (1 Ci = 37.000 Bq); suponemos que 1 ml de tejido es igual a 1 g.
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Representative Results
Un ejemplo de formación de imágenes micro-PET/CT de BAT ratón se muestra en la figura 1. Si bien la formación de imágenes CT proporciona información anatómica, la formación de imágenes PET codifica la distribución y la cantidad de 18 F-FDG por todo el cuerpo. Estos datos de imágenes se pueden ver por separado (1A y 1B), fusionado (1C), o resultar de una característica de 3D, como la proyección de intensidad máxima (MIP, 1D). Con la ayuda de una herramienta de formación de imágenes 3D, un volumen de interés (VOI), aquí la región BAT interescapular (indicado por flechas en la Figura 1), se dibuja sobre las imágenes de PET y de las señales totales dentro de la VOI puede ser convertido en ID% / g, que representa la dosis inyectada porcentaje (% ID) por gramo de tejido. En el ratón demostrado, la captación de FDG en el BAT es del 19% ID / g. Con el fin de verificar si esta inducción en frío y el protocolo de formación de imágenes es lo suficientemente sensible como para detectar una actividad alterada BAT, en cualquiera de los casos de sobre regulación o baja regulación, se utilizó βantagonista de los receptores adrenérgicos propranolol para suprimir la activación BAT 15, y agonista β3 BRL37344 para mejorar la inducción BAT 16, respectivamente. Estas intervenciones farmacológicas se aplicaron durante el tratamiento en frío y precisamente, en 30 min antes de la inyección de FDG. PET / CT (Figura 2A) y el análisis (Figura 2B) mostró que el tratamiento propranolol redujo significativamente la captación de FDG en la MTD, mientras que BRL37344 marcadamente elevada de la captación, en comparación con el control del vehículo.
Figura 1. Micro-PET/CT imágenes de BAT en un ratón después de 5 horas frío tratos. (A) Una sección coronal de la imagen de CT. (B) Una sección coronal de imagen PET co-registrado en la CT en "A". (C) Un condensado PET / CT imagen resultante de la superposición de "A" y "B". (D) Máxima intensidad projectien (MIP) presentación de las fusionadas de PET / CT imágenes. Las flechas amarillas: el área que corresponde a tejido adiposo marrón interescapular.
Figura 2. Micro-PET/CT demostración de alteración BAT actividad por fármacos adrenérgicos. (A) 18 F-FDG PET / CT de los ratones tratados con diferentes fármacos. a) PBS (control). b) Propranolol (antagonista β, 5mg/kg, ip). Tenga en cuenta una marcada reducción de la captación de FDG en el área de las MTD. c) BRL37344 (agonista β3, 5mg/kg, ip). Tenga en cuenta un aumento significativo en la acumulación de FDG en la MTD. Las flechas amarillas: el área que corresponde a tejido adiposo marrón interescapular. (B) Análisis cuantitativo de la captación de FDG en la MTD. Los valores de% ID / g (el porcentaje de dosis inyectada por gramo de tejido) se presentan (media ± SD). n = 10 para el grupo PBS, n = 5 para los grupos tanto de propranolol y BRL37344. *, P <0,05; **,p <0,005, en comparación con el grupo PBS.
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Discussion
En este estudio un método de imagen micro-PET/CT-based ha sido desarrollado para la detección de actividades de BAT en ratones adultos que simplemente se requiere un tratamiento de frío y una inyección de disponible en el mercado con 18 F-FDG. El procedimiento completo se puede realizar en un día después de un tratamiento y la secuencia de formación de imágenes que se inicia cada minuto 30 hasta que todos los animales son tratados y fotografiado. En las condiciones experimentales descritas, un total de 10 ratones (o 2 grupos de 5 ratones) pueden ser probados en el mismo día con un sistema de imagen única. La limitación a este tipo de transmisión puede ser levantada si 2 o más animales se pueden escanear simultáneamente en una cama de animales diseñados especialmente como ha sido descrito previamente 17. Para completar el estudio se basan en el uso de un sistema de formación de imágenes micro-PET/CT combinado que toma ventaja de la información anatómica detallada proporcionada por la CT. Sin embargo, un independiente micro-PET también es capaz de cumplir la tarea cuando un C 57o transmisión de escaneado se añade al flujo de trabajo antes de la F18 de emisión de adquisición de datos. Los datos de 57 Co de transmisión puede ser utilizado para la corrección de atenuación durante la reconstrucción de imágenes PET y también puede ser reconstruida para la localización anatómica.
Un paso crítico de este protocolo es optimizar la duración del tratamiento de frío (por ejemplo, 5 horas en este estudio). Un tiempo de duración más corta o la eliminación de la exposición al frío puede producir una actividad cerca del fondo y el método puede ser insensible a cualquier regulación a la baja de BAT (el efecto suelo). Por el contrario, una exposición alargada frío (por ejemplo, horas de la noche, o 24) puede maximizar la inducción y el método se puede saturar enmascarar las diferencias en la regulación de BAT (efecto techo). Las condiciones óptimas descritas en este protocolo han sido validados a través de la supresión de propranolol y β3 pruebas agonistas BRL37344 estimulación (Figura 2
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Laura Díaz, Kevin Phillips, Willa A. Hsueh, y el Rey C. Li por su apoyo útiles comentarios y técnico en el desarrollo de este método.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro-PET/CT Imaging System | Siemens Medical Solutions USA, Inc. | Inveon Dedicated PET System and Inveon Multimodality CT/SPECT System (docked) | |
| Propranolol | Sigma | P0884 | |
| BRL 37344 | Sigma | B169 | |
| 18F-FDG | Cyclotope Inc. | ||
| C57BL/6J Male Mice | Jackson Laboratory | 000664 | 3-4 months old |
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