Summary
En fremgangsmåde til funktionel imagografi af mus brunt fedtvæv (BAT) er beskrevet som kold-stimuleret optagelse af 18F-fluordeoxyglucose (FDG) i BAT ikke-invasivt vurderes med en standardiseret micro-PET/CT protokol. Denne fremgangsmåde er robust og følsom til at påvise forskelle i BAT-aktiviteter i musemodeller.
Abstract
Brunt fedtvæv (BAT) er forskellig fra hvidt adipøst væv (WAT) ved sin diskrete placering og en brun-rød farve på grund rige vaskularisering og høj densitet af mitokondrier. BAT spiller en vigtig rolle i energiforbrug og ikke-rystende termogenese i nyfødte pattedyr samt voksne 1. BAT-formidlet termogenese er stærkt reguleret af det sympatiske nervesystem, fortrinsvis via β-adrenerge receptor 2, 3. Nylige undersøgelser har vist, at BAT-aktiviteter i humane voksne er negativt korreleret med body mass index (BMI) og andre diabetiske parametre 4-6. BAT er således blevet foreslået som et potentielt mål for anti-obesity/anti-diabetes terapi fokuserer på modulering af energibalance 6-8. Mens flere kolde udfordring-baserede positronemissionstomografi (PET) metoder er etableret til påvisning af human BAT 9-13, der i det væsentlige ingen standardiseret protokol for billeddannelse og quantification af BAT i små dyremodeller, såsom mus. Her beskriver vi en robust PET / CT-scanning metode til funktionel vurdering af BAT i mus. Kort beskrevet voksne C57BL/6J-mus var koldt behandlet i fastende tilstand for en periode på 4 timer, før de modtog en dosis på 18 F-fluordeoxyglucose (FDG). Musene blev holdt i kulden i yderligere en time efter FDG injektion og derefter scannet med en lille dyr-dedikeret micro-PET/CT system. De tilkøbte PET billederne var co-registreret med CT-billeder for anatomiske referencer og analyseret for FDG optagelse i interscapular BAT-området til at præsentere BAT-aktivitet. Denne standardiserede kulde-behandling og billedbehandling protokol er blevet valideret gennem test BAT aktiviteter i farmakologiske interventioner, f.eks. Den undertrykte BAT aktivering ved behandling af β-adrenoceptorantagonist propranolol 14, 15, eller den forbedrede BAT aktivering af β3 agonist BRL37344 16 Fremgangsmåden destilskrevet her, kan anvendes til screening for lægemidler / forbindelser, der modulerer BAT aktivitet, eller at identificere gener / stier, som er involveret i BAT udvikling og regulering i forskellige prækliniske og basisuddannelse.
Protocol
1. Animal Forberedelse og kuldebehandling
- Find og inspicere et 4 ° C koldt rum, der er blevet godkendt til at rumme laboratoriemus.
- Pre-chill dyrebure natten i det kolde rum. Burene er samlet uden foder og strøelse, men med en flaske vand.
- Om morgenen den eksperimentelle dag. Place mus enkeltvis i hver af de nedkølede bure med 30 minutters intervaller Hver enkeltvis bur mus bør forblive i det kolde rum for næsten 4 timer, før det transporteres til billedbehandling lab. Sørg for musene er fastende, men med adgang til vand.
- Ved 4 timer efter kuldebehandling transport et dyr ad gangen hver 30 min til billeddannelse Lab. Dette kan opnås ved at fylde en Styrofoam beholder med is og anbringe en forud kølet hus bur oven på is inde i boksen. Løst placere dækslet på Styrofoam boks.
2. Opsætning Micro-PET/CT Imaging Workflow
- CT Acquisition: For en hel krop CT-scanning, skal du indstille strøm på 500 uA, spændingen ved 80kV, eksponeringstid på 200 ms, og 240 trin for 240 ° rotation. For X-ray detektor, skal du vælge opløsning ved "lav-system forstørrelse" med 78 mm aksial Billedfeltet og enkeltseng mode. Vælg "real tid rekonstruktion" ved hjælp af "Fælles Cone-Beam Reconstruction"-metoden, således at værts-pc'en samtaler meden dedikeret realtid genopbygning computer (Cobra) at indlede opgaven.
- PET Emission Acquisition: Set 600 sek (10 min) for "fast scan tid" i "erhverve efter tid" valgmulighed. Vælg F-18 som "undersøgelse isotop" og bruge 350-650 keV som "energi-niveau".
- PET Emission Histogram: Sæt "dynamisk ramme" som "sort" at behandle data som en ramme for den samlede varighed for at opnå statisk scanning. Vælg "3D", som histogrammet type og vælg "ingen scatter korrektion".
- PET Genopbygning: Brug 2D Bestilt Subset Expectation Maksimering (OSEM2D) som genopbygning algoritme.
3. Injektion af FDG
- Bestil en klinisk pakke med 18 F-FDG (10 mCi) fra en regional leverandør til sin ankomst til det billeddannende lab ~ 30 min før den planlagte første injektion. Følg instituttets sikkerhedsprocedurer for at modtage og undersøge pakken, der indeholder radioaktive materials (RAM).
- Med den beskyttelse, som en L-blok bordplade skjold, alikvot af FDG og lave fortyndinger med steriliseret saltvand. Den fortyndede aktivitet koncentration af FDG bør være tilgængelige på 200-300 μCi/100 ul til hver injektion. Træk den FDG opløsning i en 1 ml sprøjte med 26G 1/2 inch nål og måle radioaktiviteten af hele sprøjte med en dosiskalibrator.
- Injicere dyr, der netop transporteres fra kølerummet (se trin 1.4) med 100 gl af FDG opløsning via den intraperitoneale (ip) vej. Optag indsprøjtning tid. Måle remanensen radioaktivitet af sprøjten igen med dosiskalibrator.
- Aflive dyret tilbage til den kolde buret inde i en Styrofoam cooler opretholdt med is. Inkubér dyret i koldt (~ 4 ° C) i 1 time til FDG-optagelse.
- Beregn den injicerede FDG aktivitet for hver mus ved den følgende formel:
Injiceret aktivitet (uCi) = aktivitet i sprøjten før injektion- Aktivitet i sprøjten efter injektion
4. Micro-PET/CT Imaging
- The micro-PET/CT billedet begynder 1 time efter at FDG injektion eller 5 h efter kuldebehandling. Aflive dyret i et narkosemiddel kammer med 3% Isofluran i oxygen.
- Når anæstesi fremkaldes, bliver dyret bevæges på en mikro-CT pellet (animalsk seng) med hovedet hvilende i en konus maske, der kontinuerligt leverer Isofluran (2%) ved en strømningshastighed på 2 l / min. En elektrisk varmepude (BioVet, M2M Imaging Corp) er placeret under dyret til hjælpe med at opretholde kroppens temperatur.
- Skub dyret til indgangen af MM scanner, skal du aktivere "laser"-ikonet fra værktøjslinjen og bruge touchpad kontrol for at flytte sengen, så brystet af dyret er på korset af vandrette og lodrette laserlinjer. I "Laser Ret" vinduet vælge "første scanning type" som CT-scanning, og "PET erhvervelse inkluderet i workflow" som Option.
- Åbn "Scout View" vinduet og får en scout view x-ray røntgenbillede. Brug IAW at justere positionen af dyrets leje, så centrum synsfelt CT er placeret i centrum af muse organ (lever). Gentag dette trin, hvis det er nødvendigt.
- Start "workflow" etableret i Trin 2. Når muligheder dukker op, skal du vælge en passende 3D PET-CT transformationsmatrix fil, der skal bruges i CT rekonstruktion, og vælg et nyligt oprettede normalisering fil til PET rekonstruktion uden dæmpning korrektion. Det IAW vil derefter begynde CT-og PET-scanninger sekventielt som programmeret.
- Efter at hele arbejdsprocessen er fuldført, kan der tager 20-25 min, kort evaluere kvaliteten af den erhvervede CT-og PET-billeder med ASIPro VM, en mikro-PET analyse software co-installeret med IAW. Arkiv de billeddannende data til en datalagringsindretning eller overfører data via netværk til en post imaging analyse arbejdsstation (se trin 5) for yderligere analyse.
- RELEAse dyret fra de billeddannende systemer og læg det til en ren bolig bur med normal mad og vandforsyning for dets nyttiggørelse ved stuetemperatur. Systemerne er nu klar til den næste dyr i køen. Bemærk pleje og behandling af post-imaging dyr bør følge instituttets regler om "håndtering af forsøgsdyr injiceret med RAM". Bemærk også, at brugte nåle / sprøjter, de absorberende puder, handsker, og alle sengetøj og fecal sagen bør betragtes som radioaktivt affald, og håndteres i henhold til instituttets relevante RAM affaldsregler.
5. Post-imaging Analyse
- Open Inveon Research Arbejdsplads (IRW) software (Siemens) og manuelt importere både CT-og PET-datasæt. Co-register CT og PET-billeder i "Registrering" vinduet ved hjælp af værktøjer med "Generel analyse"-funktionen, og under "Review" vindue sørg en perfekt tilpasning mellem CT-og PET-billeder i alle 3 dimensioner.
- Fra "Region of Interest (ROI) Kvantificering" vinduet, med referencer, som de co-registrerede CT-billeder, identificere BAT ved interscapular region af halsen, den mest fremherskende kulde-inducerbar BAT i voksne mus, og trække mængden af interesse (VOI) af BAT over PET datasæt. Vælg "voxel Intensity" som "Quantification Type" og optage den gennemsnitlige radioaktivitet i VOI som Bq / ml. En kalibreringsfaktor, som konverterer tællinger / sek til Bq / ml er tidligere blevet fastslået ved at scanne en fantom med kendt radioaktivitet.
- FDG optagelse i BAT er kvantificeret som procent injiceret dosis pr gram væv (% ID / g) med forfald korrektion. Den injicerede dosis er resultatet af trin 3.5, imidlertid omdannes til becquerel (Bq) enhed (1 uCi = 37.000 Bq), antager vi, at 1 ml af væv svarer til 1 g.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et eksempel på micro-PET/CT billeddannelse af muse BAT er vist i figur 1.. Medens CT scanning giver anatomiske oplysninger, PET imaging koder fordelingen og mængden af 18F-FDG optagelse i hele kroppen. Disse billeddiagnostiske data kan ses separat (1A og 1B), fusioneret (1C), eller demonstreret med et 3D-funktionen, såsom maksimal intensitet projektion (MIP, 1D). Ved hjælp af en 3D imaging værktøj, et volumen af interesse (VOI), den interscapular BAT region (angivet med pile i figur 1), her trækkes over for PET-billeder og de samlede signaler i VOI kan omdannes til% id / g, svarende til den procentdel injiceret dosis (% ID) per gram væv. Hos mus viste, FDG optagelse i BAT er 19% ID / g. For at kontrollere, om denne kolde-induktion og billedbehandling protokollen er følsom nok til at påvise en ændret BAT-aktivitet, i begge tilfælde på op-eller nedregulering, vi brugte β-adrenoceptor-antagonist propranolol at undertrykke BAT aktivering 15 og β3-agonist BRL37344 at øge BAT induktion 16, henholdsvis. Disse farmakologiske midler blev anvendt ved kuldebehandling og præcist, efter 30 min før injektionen af FDG. PET / CT-scanning (figur 2A) og analysen (figur 2B) viste, at propranolol reducerede signifikant FDG optaget i BAT, mens BRL37344 markant forhøjet optagelse, sammenlignet med vehikelkontrol.
Figur 1. Micro-PET/CT billeddannelse af BAT i en mus efter 5 timer kulde-behandling. (A) en koronal del af CT billede. (B) en koronal del af PET-billede co-registreret hos CT i "A". (C) Et kondenseret PET / CT billede et resultat af overlejring af "A" og "B". (D) Maksimal intensitet projectipå (MIP) præsentation af de fusionerede PET / CT-billeder. Gule pile: område, der svarer til interscapular brunt fedtvæv.
Figur 2. Micro-PET/CT demonstration af BAT-aktivitet ændring af adrenoceptor lægemidler. (A) 18 F-FDG PET / CT-scanning af mus behandlet med forskellige lægemidler. a) PBS (kontrol). b) Propranolol (β antagonist, 5mg/kg, ip). Bemærk en markant reduktion af FDG optagelse i BAT-området. c) BRL37344 (β3 agonist, 5mg/kg, ip). Bemærke en betydelig stigning i FDG-akkumulering i BAT. Gule pile: område, der svarer til interscapular brunt fedtvæv. (B) Kvantitativ analyse af FDG-optagelse i BAT. Værdier for% ID / g (i procent injiceret dosis pr gram væv) er vist (middelværdi ± SD). n = 10 for den PBS-gruppen, n = 5 for både propranolol og BRL37344 grupper. *, P <0,05; **p <0,005, i sammenligning med PBS-gruppen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne undersøgelse en micro-PET/CT-based afbildningsmetode er udviklet til påvisning af BAT-aktiviteter i voksne mus, som blot kræver en kuldebehandling og én injektion af kommercielt tilgængelig 18F-FDG. Hele proceduren kan udføres på én dag efter behandling og billeddannelse sekvens, der begynder hver 30 minutter, indtil alle dyrene behandles og afbildes. Under de eksperimentelle beskrevne betingelser, kan i alt 10 mus (eller 2 grupper på 5 mus) afprøves på samme dag med et enkelt afbildningssystem. Begrænsningen til denne type gennemløb kan ophæves hvis 2 eller flere dyr kan scannes samtidigt på en specielt konstrueret dyr sengen som det tidligere er blevet rapporteret 17. For at fuldende undersøgelsen vi afhængige af anvendelsen af et kombineret micro-PET/CT billeddannelsessystem, som drager fordel af den detaljerede anatomiske oplysninger fra CT. Men en standalone mikro-PET er også i stand til at opfylde opgaven, når en 57 Co transmission scanning sættes til arbejdsprocessen forud for F18 emission datafangst. De 57 Co transmissionsdata kan bruges til dæmpning korrektion under PET billede genopbygning og kan også rekonstrueres for anatomisk lokalisering.
Et kritisk trin af denne protokol er at optimere varigheden af kuldebehandling (fx 5 timer i dette forsøg). En kortere tid eller eliminering af kulde kan frembringe en aktivitet tæt på baggrunden og fremgangsmåden kan være ufølsom over for nogen nedregulering af BAT (ordet virkning). I modsætning hertil kan en langstrakt kulde (såsom natten, eller 24 timer) maksimere induktion og metoden kan blive mættet maskering eventuelle forskelle i op-regulering af BAT (loftet effekt). De optimerede betingelser, der beskrives i denne protokol er blevet valideret gennem den propranolol undertrykkelse og β3 agonist BRL37344 stimulation test (figur 2
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Laura Diaz, Kevin Phillips, Willa A. Hsueh, og kong C. Li for deres nyttige kommentarer og teknisk støtte til at udvikle denne metode.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro-PET/CT Imaging System | Siemens Medical Solutions USA, Inc. | Inveon Dedicated PET System and Inveon Multimodality CT/SPECT System (docked) | |
| Propranolol | Sigma | P0884 | |
| BRL 37344 | Sigma | B169 | |
| 18F-FDG | Cyclotope Inc. | ||
| C57BL/6J Male Mice | Jackson Laboratory | 000664 | 3-4 months old |
References
- Cypess, A. M., Kahn, C. R. The role and importance of brown adipose tissue in energy homeostasis. Curr. Opin. Pediatr. 22, 478-484 (2010).
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiol. Rev. 84, 277-359 (2004).
- Collins, S., Surwit, R. S. The beta-adrenergic receptors and the control of adipose tissue metabolism and thermogenesis. Recent Prog. Horm. Res. 56, 309-328 (2001).
- Ouellet, V., et al. Outdoor temperature, age, sex, body mass index, and diabetic status determine the prevalence, mass, and glucose-uptake activity of 18F-FDG-detected BAT in humans. J. Clin. Endocrinol. Metab. 96, 1115-1125 (2011).
- Cypess, A. M. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. N. Engl. J. Med. 360, 1509-1517 (2009).
- Fruhbeck, G., Becerril, S., Sainz, N., Garrastachu, P., Garcia-Velloso, M. J. BAT: a new target for human obesity. Trends Pharmacol. Sci. 30, 387-396 (2009).
- Cypess, A. M., Kahn, C. R. Brown fat as a therapy for obesity and diabetes. Curr. Opin. Endocrinol. Diabetes Obes. 17, 143-149 (2010).
- Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. N. Engl. J. Med. 360, 1518-1525 (2009).
- van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. N. Engl. J. Med. 360, 1500-1508 (2009).
- Cohade, C., Mourtzikos, K. A., Wahl, R. L. "USA-Fat": prevalence is related to ambient outdoor temperature-evaluation with 18F-FDG PET/CT. J. Nucl. Med. 44, 1267-1270 (2003).
- Garcia, C. A. Reduction of brown fat 2-deoxy-2-[F-18]fluoro-D-glucose uptake by controlling environmental temperature prior to positron emission tomography scan. Mol. Imaging Biol. 8, 24-29 (2006).
- Saito, M. High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity. Diabetes. 58, 1526-1531 (2009).
- Agrawal, A., Nair, N., Baghel, N. S. A novel approach for reduction of brown fat uptake on FDG PET. Br. J. Radiol. 82, 626-631 (2009).
- Soderlund, V., Larsson, S. A., Jacobsson, H. Reduction of FDG uptake in brown adipose tissue in clinical patients by a single dose of propranolol. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 34, 1018-1022 (2007).
- Zhao, J., Cannon, B., Nedergaard, J. Thermogenesis is beta3- but not beta1-adrenergically mediated in rat brown fat cells, even after cold acclimation. Am. J. Physiol. 275, 2002-2011 (1998).
- Rowland, D. J., Garbow, J. R., Laforest, R., Snyder, A. Z. Registration of [18F]FDG microPET and small-animal MRI. Nucl. Med. Biol. 32, 567-5672 (2005).
