Summary
Werkwijze van functionele beeldvorming van muis bruin vetweefsel (BAT) beschreven waarin koud-gestimuleerde opname van 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG) in BAT niet-invasief gemeten met een gestandaardiseerd protocol micro-PET/CT. Deze methode is robuust en gevoelig zijn voor verschillen in BAT activiteiten in muismodellen detecteren.
Abstract
Bruin vetweefsel (BAT) verschilt van wit vetweefsel (WAT) door zijn discrete locatie en een bruin-rode kleur te wijten aan een rijke vascularisatie en hoge dichtheid van mitochondriën. BAT speelt een belangrijke rol in energieverbruik en non-rillen thermogenese in pasgeboren zoogdieren en volwassenen 1. BAT-gemedieerde thermogenese is sterk gereguleerd door het sympathische zenuwstelsel, voornamelijk door middel van β-adrenerge receptor 2, 3. Recente studies hebben aangetoond dat de BBT-activiteiten bij volwassen mensen negatief gecorreleerd zijn met een body mass index (BMI) en andere diabetische parameters 4-6. BAT is dus voorgesteld als een potentieel doelwit voor therapie gericht op anti-obesity/anti-diabetes modulatie van de energiebalans 6-8. Hoewel verscheidene kou challenge-based positron emissie tomografie (PET) werkwijzen worden vastgesteld voor het detecteren van menselijke BAT 9-13, nagenoeg geen gestandaardiseerd protocol voor beeldvorming en quantificatie van BBT in kleine diermodellen zoals muizen. Hier beschrijven we een robuuste PET / CT beeldvorming werkwijze voor functionele beoordeling van BAT in muizen. In het kort, volwassen C57BL/6J-muizen waren koud behandeld in nuchtere toestand voor een periode van 4 uur voordat ze kregen een dosis van 18 F-Fluorodeoxyglucose (FDG). De muizen werden bleven in de kou voor een extra uur na FDG injectie, en vervolgens gescand met een klein dier-dedicated micro-PET/CT systeem. De verworven PET-beelden waren samen ingeschreven bij de CT-beelden voor anatomische referenties en geanalyseerd op FDG-opname in de interscapular BAT gebied BAT activiteit te presenteren. Deze gestandaardiseerde koude-behandeling en beeldvorming protocol werd gevalideerd door het testen BAT activiteiten in farmacologische interventies, bijvoorbeeld de activatie onderdrukt BAT door de behandeling van β-adrenerge antagonist propranolol 14, 15, of de verbeterde BAT activering door β3 agonist BRL37344 16. Werkwijze described hier kan worden toegepast voor het screenen op geneesmiddelen / verbindingen die BAT moduleren, of genen / routes die betrokken zijn bij ontwikkeling en regulering BAT in verschillende preklinische en basisonderzoek identificeren.
Protocol
1. Animal Voorbereiding en Cold Treatment
- Zoek en inspecteren van een 4 ° C koud kamer die is goedgekeurd voor het onderbrengen van laboratorium muizen.
- Pre-chill dierenkooien nacht in de koude kamer. De kooien worden geassembleerd zonder voeder en strooisel, maar met een fles water.
- In de ochtend van de experimentele dag plaats muizen een voor een in elk van de voorgekoeld kooien op 30 min intervallen. Elk afzonderlijk gekooide muis moet blijven in de koude kamer voor bijna 4 uur voordat het wordt getransporteerd naar de beeldvorming lab. Zorg ervoor dat de muizen aan het vasten bent, maar met toegang tot water.
- Op 4 uur na koudebehandeling vervoer een dier op een moment om de 30 minuten naar de beeldvorming Lab. Dit kan worden bereikt door het vullen van een container met ijs Styrofoam en door een voorgekoelde behuizing kooi boven het ijs in de kast. Losjes plaats het deksel op de piepschuim doos.
2. Setup Micro-PET/CT Imaging Workflow
- CT Acquisitie: Voor een hele lichaam CT-scan, zet stroom op 500 uA, spanning op 80kV, belichtingstijd op 200 msec en 240 stappen voor 240 ° rotatie. Voor X-ray detector, selecteer resolutie op "lage-systeem vergroting" met 78 mm axiale beeldveld en een eenpersoonsbed mode. Selecteer "real-time reconstructie" met behulp van de "Gemeenschappelijke Cone-Beam Wederopbouw" methode, zodat de host-pc gesprekken meteen speciale real time reconstructie computer (Cobra) de taak te starten.
- PET Emissie Acquisitie: Set 600 sec (10 min) voor "vaste scantijd" in het "verwerven door de tijd" optie. Selecteer F-18 als "studie isotopen" en gebruik 350 tot 650 keV als "energie-niveau".
- PET Emissie Histogram: Stel "dynamisch frame" als "zwart" om gegevens te verwerken als een frame voor de gehele duur van statische scan te bereiken. Selecteer "3D" als het histogram type en kies "geen correctie van scatter".
- PET Reconstructie: Gebruik 2D Geordende subset Verwachting Maximization (OSEM2D) als het reconstructie-algoritme.
3. Injectie van FDG
- Bestel een klinische pakket van 18 F-FDG (10 mCi) van een regionale leverancier voor zijn komst naar de beeldvorming lab ~ 30 minuten voor de geplande eerste injectie. Volg het instituut veiligheidsprocedures te ontvangen en te onderzoeken het pakket met radioactieve materials (RAM).
- Met de bescherming die door een L-blok tafelblad schild, aliquot de FDG en maak verdunningen met gesteriliseerd zoutoplossing. De verdunde activiteitsconcentratie van FDG moet beschikbaar zijn op 200-300 μCi/100 ul voor elke injectie. Teken de FDG oplossing in een 1 ml spuit met 26G 1/2 inch naald, en meet de radioactiviteit van de hele spuit met een dosis kalibrator.
- Injecteer het dier dat slechts wordt uit de koelcel (zie Stap 1.4) met 100 ul van FDG oplossing via de intraperitoneale (ip) route. Noteer de injectie tijd. Opnieuw meten het residu radioactiviteit van de spuit met de dosiskalibrator.
- Plaats het dier op de koude kooi in een koeler Styrofoam onderhouden met ijs. Incubeer het dier in koude (~ 4 ° C) gedurende 1 uur voor FDG opname.
- Bereken de geïnjecteerde activiteit FDG voor elke muis door de volgende formule:
Geïnjecteerde activiteit (pCi) = activiteit in spuit vóór injectie- Activiteit in spuit na injectie
4. Micro-PET/CT Imaging
- De micro-PET/CT beeldvorming begint 1 uur na de FDG injectie of 5 uur na de koude behandeling. Zet het dier in een anesthesie inductiekamer met 3% isofluraan in zuurstof.
- Zodra anesthesie wordt geïnduceerd, wordt het dier verplaatst naar een micro-CT pellet (dier bed) rust met zijn kop in een kegel gezichtsmasker dat continu levert isofluraan (2%) met een debiet van 2 l / min. Een elektrische verwarming pad (Biovet, M2M Imaging Corp) is geplaatst onder het dier te helpen het lichaam te handhaven.
- Schuif het dier naar de ingang van de MM scanner, activeert u de "laser"-pictogram op de werkbalk en gebruik de touchpad controle aan het bed te verplaatsen, zodat de borst van het dier bij het kruis van horizontale en verticale laserlijnen. In de "Laser uitlijnen" venster kiest u "eerste scan type" als CT-scan, en "PET overname opgenomen in de workflow" als de option.
- Open de "Scout View"-venster en het verwerven van een scout uitzicht x-ray radiografie. Gebruik IAW om de positie van het dier bed passen zodat het centrum gezichtsveld van CT is gelegen in het centrum van muis lichaam (lever). Herhaal deze stap indien nodig.
- Start de "workflow" vastgesteld in stap 2. Als er opties pop-up, selecteer dan een geschikte 3D PET-CT transformatiematrix bestand dat moet worden gebruikt in de CT-reconstructie, en kies een recent opgerichte normalisatie-bestand voor PET reconstructie zonder attenuatie correctie. De IAW zal dan beginnen CT-en PET-scans sequentieel zoals geprogrammeerd.
- Na het hele workflow is voltooid, die 20-25 min duren kort evalueren van de kwaliteit van de verkregen CT en PET beelden met de ASIPro VM, een micro-PET analyse software samen geïnstalleerd IAW. Archief van de beeldgegevens op een data-opslagapparaat of de overdracht van de gegevens via het netwerk naar een post beeldvorming analyse werkstation (zie stap 5) voor verdere analyse.
- Release het dier uit de beeldvormende systemen en plaats deze op een schone behuizing kooi met normaal voedsel-en watervoorziening voor de invordering daarvan bij kamertemperatuur. De systemen zijn nu gereed voor het volgende dier in de wachtrij. Let op de zorg en de behandeling van post-beeldvorming moeten de dieren van het instituut voorschriften die ten aanzien van "omgang met proefdieren ingespoten met RAM". Merk ook op dat de gebruikte naalden / spuiten, de absorberende pads, handschoenen, en alle beddengoed en fecale materie moet worden beschouwd als radioactief afval, en behandeld op basis van relevante RAM afval van het instituut ter beschikking regelgeving.
5. Post-imaging Analysis
- Open Inveon Onderzoek Werkplek (IRW) software (Siemens) en handmatig te importeren zowel CT-en PET-data sets. Co-register CT en PET-beelden in "Registratie" venster met behulp van tools met de "Algemene analyse" functie, en onder de "Review"-venster er zeker van een perfecte afstemming tussen CT en PET-beelden in de 3 dimensies.
- Van "Region of Interest (ROI) Kwantificering" venster, met de verwijzingen die door de co-geregistreerde CT-beelden, te identificeren BBT aan de interscapular regio van de nek, de meest overheersende koude-induceerbare BAT bij volwassen muizen, en teken het volume van belang (VOI) van BAT over de PET dataset. Selecteer "Voxel Intensity" als de "Kwantificering Type" en noteer de gemiddelde radioactiviteit binnen de VOI als Bq / ml. Een kalibratie factor die telt / sec wordt omgezet in Bq / ml is vastgesteld dat vooraf bij het scannen van een fantoom met bekende radioactiviteit.
- FDG opname in BAT wordt gekwantificeerd als percentage geïnjecteerde dosis per gram weefsel (% ID / g) met verval gecorrigeerd. De toegediende dosis is het resultaat van stap 3.5, echter omgezet in becquerel (Bq) unit (1 uCi = 37.000 Bq) nemen we aan dat 1 ml weefsel gelijk aan 1 g.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een voorbeeld van micro-PET/CT beeldvorming van muis BAT wordt getoond in Figuur 1. Terwijl de CT-beeldvorming biedt anatomische informatie, de PET-beeldvorming codeert de verdeling en de hoeveelheid van 18 F-FDG-opname door het hele lichaam. Deze beeldgegevens kunnen afzonderlijk worden bekeken (1A en 1B), gefuseerd (1C), of gedemonstreerd met een 3D-functie, zoals maximale intensiteit projectie (MIP, 1D). Met behulp van een 3D modaliteit een volume van belang (VOI), hier de interscapular BAT gebied (aangegeven door pijlen in figuur 1) wordt getrokken over de PET beelden en de totale signalen binnen het VOI worden omgezet in% ID / g, die het percentage geïnjecteerde dosis (% ID) per gram weefsel. In de muis aangetoond FDG opname in de BAT 19% ID / g. Om na te gaan of deze koude-inductie en imaging protocol is gevoelig genoeg om een veranderde BAT te detecteren, in beide gevallen van up-regulering of down-regulering gebruikten we βadrenoceptorantagonist propranolol aan de BBT activering 15 en β3 agonist BRL37344 aan BBT inductie 16, respectievelijk te verbeteren onderdrukken. Deze farmacologische interventies werden toegepast tijdens de koudebehandeling en nauwkeurig 30 min vóór de injectie van FDG. PET / CT beeldvorming (Figuur 2A) en de analyse (figuur 2B) was de propranolol behandeling aanzienlijk FDG opname in BAT af, terwijl BRL37344 opvallend groot de opname, in vergelijking met de dragercontrole.
Figuur 1. Micro-PET/CT beeldvorming van BBT in een muis na 5 uur koud-behandeling. (A) Een coronale deel van CT-beeld. (B) Een coronale deel van PET-beeld samen ingeschreven bij de CT in "A". (C) A gesmolten PET / CT beeld resultaat van de superpositie van "A" en "B". (D) Maximale intensiteit projectiop (MIP) presentatie van de gefuseerde PET / CT-beelden. Gele pijlen: het gebied dat overeenkomt met interscapular bruin vetweefsel.
Figuur 2. Micro-PET/CT demonstratie van BAT activiteit wijziging door adrenoceptor drugs. (A) 18 F-FDG PET / CT beeldvorming van muizen behandeld met verschillende geneesmiddelen. a) PBS (controle). b) Propranolol (β-antagonist, 5mg/kg, ip). Opmerking een duidelijke vermindering van de FDG-opname in de BBT gebied. c) BRL37344 (β3 agonist, 5mg/kg, ip). Opmerking een significante toename in FDG accumulatie in BBT. Gele pijlen: het gebied dat overeenkomt met interscapular bruin vetweefsel. (B) Kwantitatieve analyse van de FDG opname in de BBT. Waarden van% ID / g (het percentage geïnjecteerde dosis per gram weefsel) zijn weergegeven (gemiddelde ± SD). n = 10 voor de PBS-groep, n = 5 voor zowel propranolol BRL37344 groepen. *, P <0,05; **p <0,005, in vergelijking met de PBS groep.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze studie micro-PET/CT-based imaging methode ontwikkeld voor het detecteren BAT activiteiten in volwassen muizen slechts sprake is van een koudebehandeling en een injectie in de handel verkrijgbare F-18 FDG. De gehele procedure kan op een dag na een behandeling en imaging sequentie die elke 30 minuten begint tot alle dieren behandeld en afgebeeld. Onder de beschreven experimentele condities, kunnen in totaal 10 muizen (of 2 groepen van 5 muizen) worden getest op dezelfde dag met een beeldvormingssysteem. De beperking van dit type doorvoer kan worden opgeheven als 2 of meer dieren gelijktijdig worden gescand op een speciaal dier bed zoals het eerder beschreven 17. De studie afhankelijk van het gebruik van een gecombineerd micro-PET/CT imaging systeem dat gebruik maakt van de gedetailleerde anatomische informatie van de CT voltooien. Echter een standalone micro-PET kan ook de taak vervullen bij een 57 Co transmissie scan wordt toegevoegd aan de workflow vóór de emissie F18 data acquisitie. De 57 Co zenddata kunnen worden gebruikt voor attenuatiecorrectie in PET beeldreconstructie en kan ook worden gereconstrueerd anatomische lokalisatie.
Een kritische stap van dit protocol is het optimaliseren van de duur van de koudebehandeling (bijv. 5 uur in deze studie). Een kortere duur of de eliminatie van koude blootstelling kan een activiteit dichtbij de achtergrond en de methode ongevoelig te down-regulatie van BAT (de vloer effect). Daarentegen kan een langwerpige blootstelling aan kou (zoals 's nachts of 24 uur) te maximaliseren vorming en werkwijze verzadigd raken maskeren verschillen in de up-regulatie van BAT (het maximum effect). De geoptimaliseerde voorwaarden beschreven in dit protocol zijn gevalideerd door de propranolol onderdrukking en β3 agonist BRL37344 stimulatie test (figuur 2
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs willen graag Laura Diaz, Kevin Phillips, Willa A. Hsueh, en King C. Li bedanken voor hun nuttige opmerkingen en technische ondersteuning bij de ontwikkeling van deze methode.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro-PET/CT Imaging System | Siemens Medical Solutions USA, Inc. | Inveon Dedicated PET System and Inveon Multimodality CT/SPECT System (docked) | |
| Propranolol | Sigma | P0884 | |
| BRL 37344 | Sigma | B169 | |
| 18F-FDG | Cyclotope Inc. | ||
| C57BL/6J Male Mice | Jackson Laboratory | 000664 | 3-4 months old |
References
- Cypess, A. M., Kahn, C. R. The role and importance of brown adipose tissue in energy homeostasis. Curr. Opin. Pediatr. 22, 478-484 (2010).
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiol. Rev. 84, 277-359 (2004).
- Collins, S., Surwit, R. S. The beta-adrenergic receptors and the control of adipose tissue metabolism and thermogenesis. Recent Prog. Horm. Res. 56, 309-328 (2001).
- Ouellet, V., et al. Outdoor temperature, age, sex, body mass index, and diabetic status determine the prevalence, mass, and glucose-uptake activity of 18F-FDG-detected BAT in humans. J. Clin. Endocrinol. Metab. 96, 1115-1125 (2011).
- Cypess, A. M. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. N. Engl. J. Med. 360, 1509-1517 (2009).
- Fruhbeck, G., Becerril, S., Sainz, N., Garrastachu, P., Garcia-Velloso, M. J. BAT: a new target for human obesity. Trends Pharmacol. Sci. 30, 387-396 (2009).
- Cypess, A. M., Kahn, C. R. Brown fat as a therapy for obesity and diabetes. Curr. Opin. Endocrinol. Diabetes Obes. 17, 143-149 (2010).
- Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. N. Engl. J. Med. 360, 1518-1525 (2009).
- van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. N. Engl. J. Med. 360, 1500-1508 (2009).
- Cohade, C., Mourtzikos, K. A., Wahl, R. L. "USA-Fat": prevalence is related to ambient outdoor temperature-evaluation with 18F-FDG PET/CT. J. Nucl. Med. 44, 1267-1270 (2003).
- Garcia, C. A. Reduction of brown fat 2-deoxy-2-[F-18]fluoro-D-glucose uptake by controlling environmental temperature prior to positron emission tomography scan. Mol. Imaging Biol. 8, 24-29 (2006).
- Saito, M. High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity. Diabetes. 58, 1526-1531 (2009).
- Agrawal, A., Nair, N., Baghel, N. S. A novel approach for reduction of brown fat uptake on FDG PET. Br. J. Radiol. 82, 626-631 (2009).
- Soderlund, V., Larsson, S. A., Jacobsson, H. Reduction of FDG uptake in brown adipose tissue in clinical patients by a single dose of propranolol. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 34, 1018-1022 (2007).
- Zhao, J., Cannon, B., Nedergaard, J. Thermogenesis is beta3- but not beta1-adrenergically mediated in rat brown fat cells, even after cold acclimation. Am. J. Physiol. 275, 2002-2011 (1998).
- Rowland, D. J., Garbow, J. R., Laforest, R., Snyder, A. Z. Registration of [18F]FDG microPET and small-animal MRI. Nucl. Med. Biol. 32, 567-5672 (2005).
