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Biology

FDG micro-PET/CT साथ चूहे में ब्राउन फैट की कार्यात्मक इमेजिंग

doi: 10.3791/4060 Published: November 23, 2012

Summary

माउस ब्राउन वसा ऊतकों (बैट) कार्यात्मक इमेजिंग की एक विधि का वर्णन है जिसमें 18F-fluorodeoxyglucose की ठंड उत्तेजित में बैट (FDG) तेज साथ मूल्यांकन एक मानकीकृत micro-PET/CT प्रोटोकॉल गैर invasively. इस विधि मजबूत और संवेदनशील माउस मॉडल में बैट गतिविधियों में अंतर का पता लगाने है.

Abstract

ब्राउन वसा ऊतकों (बैट) अपने असतत स्थान और एक भूरे लाल अमीर vascularization और mitochondria की उच्च घनत्व के कारण रंग सफेद वसा ऊतकों (WAT) से अलग है. बैट ऊर्जा खर्च और गैर - कांप thermogenesis नवजात स्तनधारियों में के रूप में के रूप में अच्छी तरह से वयस्कों 1 में एक प्रमुख भूमिका निभाता है. बैट की मध्यस्थता thermogenesis अत्यधिक सहानुभूति तंत्रिका तंत्र द्वारा नियंत्रित किया जाता है, मुख्य रूप से β एड्रीनर्जिक रिसेप्टर 2, 3 के माध्यम से. हाल के अध्ययनों से पता चला है कि मानव वयस्कों में बैट गतिविधियों नकारात्मक शरीर मास इंडेक्स (बीएमआई) और अन्य मधुमेह 4-6 मापदंडों के साथ सहसंबद्ध होते हैं. बैट इस प्रकार anti-obesity/anti-diabetes उपचार ऊर्जा संतुलन 6-8 की मॉडुलन पर ध्यान केंद्रित करने के लिए एक संभावित लक्ष्य के रूप में प्रस्तावित किया गया है. जबकि कई ठंड चुनौती आधारित पोजीट्रान उत्सर्जन टोमोग्राफी तरीकों (पीईटी) मानव 9-13 बैट का पता लगाने के लिए स्थापित कर रहे हैं, वहाँ अनिवार्य रूप से इमेजिंग और quantif के लिए कोई मानकीकृत प्रोटोकॉल हैचूहों के रूप में छोटे पशु मॉडल में बैट के ication. यहाँ हम एक मजबूत पीईटी / सीटी चूहों में बैट के कार्यात्मक मूल्यांकन के लिए इमेजिंग विधि का वर्णन है. संक्षेप में, वयस्क C57BL/6J चूहों 4 घंटे की अवधि के लिए उपवास की शर्तों के तहत इलाज से पहले वे 18 एफ fluorodeoxyglucose (FDG) के एक खुराक प्राप्त ठंड थे. चूहों ठंड में एक अतिरिक्त घंटे के बाद FDG इंजेक्शन के लिए रह रहे थे, और फिर एक छोटे micro-PET/CT पशु समर्पित प्रणाली के साथ स्कैन. हासिल कर ली पीईटी छवियों संरचनात्मक संदर्भ के लिए सीटी छवियों के साथ सह से पंजीकृत है और interscapular बैट क्षेत्र में FDG तेज बैट गतिविधि को पेश करने के लिए विश्लेषण थे. यह ठंड उपचार मानकीकृत और इमेजिंग प्रोटोकॉल औषधीय हस्तक्षेप के दौरान परीक्षण बैट गतिविधियों के माध्यम से मान्य किया गया है, उदाहरण के लिए, β adrenoceptor 15 14, प्रोप्रानोलोल प्रतिपक्षी, या β3 agonist 16 BRL37344 द्वारा बढ़ाया बैट सक्रियण के उपचार से दबा दिया बैट सक्रियण. विधि desयहाँ cribed दवाओं / यौगिकों है कि बैट गतिविधि मिलाना, या जीन / रास्ते कि बैट और विभिन्न preclinical और बुनियादी पढ़ाई में विकास और विनियमन में शामिल कर रहे हैं की पहचान करने के लिए स्क्रीन के लिए लागू किया जा सकता है.

Protocol

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1. पशु तैयारी और शीत उपचार

  1. पता लगाएँ और एक 4 डिग्री सेल्सियस ठंडे कमरे कि प्रयोगशाला चूहों को समायोजित करने के लिए अनुमोदित किया गया है का निरीक्षण किया.
  2. पूर्व सर्द पशु पिंजरों ठंडे कमरे में रात भर. पिंजरों फ़ीड और बिस्तर के बिना, लेकिन पानी की एक बोतल के साथ इकट्ठा कर रहे हैं.
  3. प्रयोगात्मक दिन की सुबह में, जगह चूहों एक 30 मिनट के अंतराल में पूर्व ठंडा पिंजरों में से प्रत्येक में एक एक करके. प्रत्येक अकेले बंदी माउस लगभग 4 घंटे के लिए ठंडे कमरे में रहने से पहले यह इमेजिंग प्रयोगशाला में ले जाया जाता है. सुनिश्चित करें चूहों, लेकिन पानी के लिए उपयोग के साथ उपवास कर रहे हैं.
  4. 4 घंटे बाद ठंडे उपचार परिवहन पर एक समय में एक जानवर हर इमेजिंग लैब के लिए 30 मिनट. यह बर्फ के साथ एक स्टायरोफोम कंटेनर भरने और बॉक्स के अंदर बर्फ के शीर्ष पर एक पूर्व ठंडा आवास पिंजरे रखने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. शिथिल स्टायरोफोम बॉक्स पर कवर जगह.

2. सेटअप Micro-PET/CT इमेजिंग कार्यप्रवाह

  1. सीटी अधिग्रहण: एक पूरे शरीर सीटी स्कैन के लिए, 500 पर वर्तमान UA, 80kV, 200 मिसे जोखिम समय और 240 रोटेशन ° के लिए 240 पदों पर वोल्टेज सेट. एक्स - रे डिटेक्टर के लिए "कम प्रणाली बढ़ाई" में 78 मिमी axial इमेजिंग क्षेत्र और एकल बिस्तर मोड के साथ संकल्प का चयन करें. "वास्तविक समय पुनर्निर्माण" "आम शंकु बीम पुनर्निर्माण" इतना है कि विधि का उपयोग करें मेजबान के साथ पीसी वार्ताएक समर्पित वास्तविक समय पुनर्निर्माण कंप्यूटर (कोबरा) के लिए कार्य आरंभ करने के लिए.
  2. पीईटी उत्सर्जन अधिग्रहण: सेट "समय के द्वारा प्राप्त" विकल्प "तय समय स्कैन" के लिए 600 सेकंड (10 मिनट). "अध्ययन आइसोटोप" के रूप में F-18 का चयन करें और "ऊर्जा स्तर" के रूप में 350-650 कीव.
  3. पीईटी उत्सर्जन हिस्टोग्राम: सेट पूरे स्थिर स्कैन को प्राप्त करने की अवधि के लिए एक फ्रेम के रूप में डेटा की प्रक्रिया के लिए "ब्लैक" के रूप में "गतिशील फ्रेम". हिस्टोग्राम प्रकार के रूप में "3 डी" का चयन करें और "कोई तितर बितर सुधार" चुनें.
  4. पीईटी पुनर्निर्माण: पुनर्निर्माण एल्गोरिथ्म के रूप में 2 डी हिसाब से सबसेट उम्मीद मैक्ज़िमाइज़ेशन (OSEM2D) का प्रयोग करें.

3. FDG इंजेक्शन

  1. इमेजिंग प्रयोगशाला में ~ 30 मिनट अनुसूचित पहला इंजेक्शन से पहले आने के लिए एक क्षेत्रीय विक्रेता से आदेश 18 एफ FDG (10 एमसीआई) के एक नैदानिक ​​पैकेज. संस्थान की सुरक्षा प्राप्त करने के लिए और रेडियोधर्मी मटेरिया युक्त पैकेज सर्वेक्षण प्रक्रियाओं का पालन करेंरास (रैम).
  2. साथ एक एल ब्लॉक तालिका शीर्ष ढाल, अशेष भाजक FDG और निष्फल खारा साथ dilutions बनाने के द्वारा सुरक्षा प्रदान की. FDG पतला गतिविधि एकाग्रता 200-300 प्रत्येक इंजेक्शन के लिए μCi/100 उल पर उपलब्ध होना चाहिए. 26G 1/2 इंच सुई के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज में FDG समाधान, ड्रा और एक खुराक अंशशोधक साथ पूरे सिरिंज की रेडियोधर्मिता उपाय.
  3. इंजेक्षन जानवर है कि सिर्फ intraperitoneal मार्ग (आईपी) के माध्यम से 100 FDG समाधान के μl (1.4 चरण देखें) के साथ ठंडे कमरे से ले जाया जाता है. इंजेक्शन समय रिकार्ड. खुराक अंशशोधक साथ सिरिंज के अवशेषों रेडियोधर्मिता फिर उपाय.
  4. पशु को एक स्टायरोफोम बर्फ के साथ बनाए रखा कूलर के अंदर ठंड पिंजरे में वापस रख. FDG तेज के लिए 1 घंटे के लिए ठंड (~ 4 डिग्री सेल्सियस) में पशु सेते हैं.
  5. निम्न सूत्र द्वारा प्रत्येक माउस के लिए इंजेक्शन FDG गतिविधि की गणना:
    इंजेक्शन गतिविधि (μCi) सिरिंज में इंजेक्शन से पहले = गतिविधिइंजेक्शन के बाद सिरिंज में गतिविधि

4. Micro-PET/CT इमेजिंग

  1. micro-PET/CT इमेजिंग FDG या ठंडे उपचार के बाद 5 घंटा इंजेक्शन के बाद 1 घंटा शुरू होता है. एक संज्ञाहरण प्रेरण कक्ष में ऑक्सीजन में 3 isoflurane% के साथ पशु रखो.
  2. एक बार संज्ञाहरण प्रेरित है, पशु सूक्ष्म सीटी गोली (पशु बिस्तर) पर उसके सिर के साथ एक शंकु चेहरा मुखौटा है कि लगातार isoflurane 2 एल / मिनट की एक प्रवाह दर पर (2%) उद्धार के भीतर आराम कर ले जाया जाता है. शरीर के तापमान को बनाए रखने में मदद करने के लिए एक बिजली का हीटिंग पैड पशु (BIOVET, m2m इमेजिंग कार्पोरेशन) के तहत रखा गया है.
  3. एम.एम. स्कैनर के प्रवेश द्वार के लिए पशु स्लाइड, उपकरण पट्टी से "लेजर" आइकन को सक्रिय करने, और touchpad नियंत्रण का उपयोग करने के लिए बिस्तर कदम इतना है कि जानवर के सीने में क्षैतिज और ऊर्ध्वाधर लेजर लाइनों के पार है. "लेजर संरेखित करें" विंडो में सीटी स्कैन के रूप में प्रथम स्कैन के प्रकार का चयन करें, और OPTIO रूप में "पीईटी अधिग्रहण वर्कफ़्लो में शामिल"n.
  4. "स्काउट देखें" खिड़की खोलें और एक स्काउट रेडियोग्राफ़ एक्स - रे के दृश्य प्राप्त. IAW प्रयोग पशु बिस्तर की स्थिति को समायोजित करने के लिए इतना है कि सीटी के देखने के केंद्र क्षेत्र माउस शरीर (यकृत) के केंद्र में स्थित है. यदि आवश्यक हो तो इस चरण को दोहराएँ.
  5. "कार्यप्रवाह" चरण 2 में स्थापित शुरू करो. जब विकल्प पॉप अप, एक उपयुक्त 3 डी पीईटी सीटी परिवर्तन मैट्रिक्स सीटी पुनर्निर्माण में इस्तेमाल किया जा करने के लिए एक फ़ाइल का चयन करें, और कोई क्षीणन सुधार के साथ पीईटी पुनर्निर्माण के लिए एक हाल ही में बनाई गई सामान्यीकरण फ़ाइल का चयन करें. IAW तो सीटी और पीईटी स्कैन sequentially रूप में क्रमादेशित शुरू कर देंगे.
  6. पूरे कार्यप्रवाह के बाद पूरा हो गया है, जो 20-25 मिनट लग सकता है, संक्षेप में हासिल कर ली सीटी और ASIPro वीएम, सूक्ष्म विश्लेषण IAW सह के साथ स्थापित सॉफ्टवेयर पीईटी के साथ पीईटी छवियों की गुणवत्ता का मूल्यांकन. पुरालेख एक डाटा भंडारण युक्ति इमेजिंग डेटा या डेटा नेटवर्क के माध्यम से आगे के विश्लेषण के लिए एक के बाद इमेजिंग विश्लेषण कार्य केंद्र (चरण 5 देखें) करने के लिए स्थानांतरण.
  7. Releaसे इमेजिंग सिस्टम से पशु और एक स्वच्छ आवास पिंजरे यह सामान्य भोजन और कमरे के तापमान पर इसकी वसूली के लिए पानी की आपूर्ति के साथ जगह. सिस्टम अब कतार में अगले जानवर के लिए तैयार कर रहे हैं. ध्यान दें और बाद इमेजिंग जानवरों की देखभाल से निपटने संस्थान "प्रयोगशाला राम के साथ इंजेक्शन पशुओं की हैंडलिंग के बारे में नियमों का पालन करना चाहिए. यह भी ध्यान रखें कि सुई / सीरिंज, शोषक पैड, दस्ताने, और सभी बिस्तर का इस्तेमाल किया और fecal मामला रेडियोधर्मी कचरे के रूप में माना जाना चाहिए, और संस्थान प्रासंगिक रैम अपशिष्ट निपटान के नियमों के अनुसार संभाला.

5. पोस्ट - इमेजिंग विश्लेषण

  1. ओपन Inveon अनुसंधान दफ्तर (IRW) (Siemens) सॉफ्टवेयर और मैन्युअल दोनों सीटी और पीईटी डेटा सेट आयात करते हैं. सह रजिस्टर और सीटी "पंजीकरण" "सामान्य विश्लेषण" समारोह के साथ उपकरण का उपयोग कर खिड़की, "समीक्षा" खिड़की के तहत सभी 3 आयामों में सीटी और पीईटी छवियों के बीच एक सही संरेखण में पीईटी छवियों सुनिश्चित कर लें.
  2. ब्याज की "क्षेत्र (आरओआई) सह पंजीकृत सीटी छवियों द्वारा प्रदान संदर्भ के साथ, मात्रा" खिड़की से, गर्दन, वयस्क चूहों में सबसे प्रमुख बैट ठंड inducible interscapular क्षेत्र में बैट की पहचान है, और ब्याज की मात्रा आकर्षित (Voi) पीईटी डेटा सेट पर बैट. "मात्रा प्रकार" के रूप में "Voxel तीव्रता" का चयन करें और Bq / मिलीलीटर रूप Voi के भीतर मतलब रेडियोधर्मिता रिकॉर्ड. एक अंशांकन कारक है जो Bq / मिलीलीटर के लिए मायने रखता है / सेक धर्मान्तरित पहले ज्ञात रेडियोधर्मिता के साथ एक प्रेत स्कैनिंग द्वारा स्थापित किया गया है.
  3. बैट में FDG तेज प्रतिशत ग्राम ऊतक प्रति इंजेक्शन क्षय के सुधार के साथ (आईडी / छ%) खुराक के रूप में मात्रा निर्धारित है. इंजेक्शन खुराक 3.5 चरण के परिणाम है, तथापि, Becquerel (Bq) इकाई (1 μCi = 37,000 Bq) बदला है, हम मानते हैं कि ऊतक के 1 मिलीलीटर 1 ग्राम के बराबर होती है.

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Representative Results

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माउस बैट के micro-PET/CT इमेजिंग का एक उदाहरण चित्रा 1 में दिखाया गया है. जबकि सीटी इमेजिंग संरचनात्मक जानकारी प्रदान करता है, पीईटी इमेजिंग वितरण और पूरे शरीर में मात्रा 18 एफ FDG तेज encodes. ये इमेजिंग डेटा को अलग से देखा जा सकता है (1 ए और 1 बी), (1C) जुड़े, या अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण (एमआईपी, 1D) के रूप में एक 3 डी फीचर के साथ प्रदर्शन. एक 3 डी इमेजिंग उपकरण, ब्याज की एक मात्रा (Voi) की मदद के साथ, यहाँ interscapular बैट (1 चित्रा में तीर द्वारा इंगित) क्षेत्र, पीईटी छवियों और Voi भीतर कुल संकेतों से अधिक% आईडी तैयार की है में परिवर्तित किया जा सकता है / छ, ऊतक के प्रति ग्राम प्रतिशत इंजेक्शन खुराक (% आईडी) का प्रतिनिधित्व. माउस का प्रदर्शन किया, बैट में FDG तेज 19% आईडी / छ है. आदेश में अगर इस प्रेरण ठंड और इमेजिंग प्रोटोकॉल विनियमन या नीचे विनियमन के किसी भी मामले में एक बदल बैट गतिविधि, पता लगाने के लिए पर्याप्त संवेदनशील है सत्यापित करने के लिए, हम β का इस्तेमाल कियाadrenoceptor प्रतिपक्षी बैट 15 सक्रियण, और β3 agonist बैट 16 प्रेरण, क्रमशः बढ़ा BRL37344 को दबाने प्रोप्रानोलोल. इन औषधीय हस्तक्षेप ठंडे उपचार के दौरान लागू किया गया और ठीक FDG के इंजेक्शन से पहले 30 मिनट में. पीईटी / सीटी (2A चित्रा) इमेजिंग और विश्लेषण (चित्रा 2B) से पता चला है कि प्रोप्रानोलोल उपचार काफी FDG तेज बल्लेबाजी में कम है, जबकि तेज BRL37344 स्पष्ट रूप से ऊपर उठाया के रूप में वाहन पर नियंत्रण के साथ तुलना.

चित्रा 1
चित्रा 1. एक माउस में बैट के 5 घंटा ठंड उपचार के बाद Micro-PET/CT इमेजिंग. (ए) सीटी छवि के राज्याभिषेक अनुभाग. (बी) पीईटी छवि के राज्याभिषेक अनुभाग में "ए" सीटी के साथ दर्ज की गई. (सी) एक इनकार छवि पीईटी / सीटी "ए" और "बी" superimposing से हुई. (डी) अधिकतम तीव्रता projectiइनकार पीईटी / सीटी छवियों (एमआईपी) की प्रस्तुति पर. भूरे वसा ऊतकों को interscapular इसी क्षेत्र पीले तीर:.

चित्रा 2
चित्रा 2. Adrenoceptor दवाओं द्वारा बैट गतिविधि परिवर्तन के प्रदर्शन Micro-PET/CT. (ए) 18 F-FDG विभिन्न दवाओं के साथ इलाज चूहों की इमेजिंग पीईटी / सीटी. एक) पीबीएस (नियंत्रण). ख) प्रोप्रानोलोल (β प्रतिपक्षी, आईपी 5mg/kg,). FDG तेज बैट क्षेत्र में एक उल्लेखनीय कमी नोट. ग) BRL37344 (β3 agonist, 5mg/kg आईपी). बैट में एक FDG संचय में उल्लेखनीय वृद्धि नोट. भूरे वसा ऊतकों को interscapular इसी क्षेत्र पीले तीर:. (बी) के मात्रात्मक विश्लेषण बैट में FDG तेज. % मान आईडी / छ (प्रतिशत ऊतक के ग्राम प्रति खुराक इंजेक्शन) (मतलब ± एसडी) प्रस्तुत कर रहे हैं. n = PBS समूह के लिए 10; n = दोनों प्रोप्रानोलोल और BRL37344 समूहों के लिए 5. * <0.05 पी; **पी 0.005 <, पीबीएस समूह के साथ तुलना में.

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Discussion

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इस अध्ययन में एक micro-PET/CT-based इमेजिंग विधि वयस्क चूहों में बैट गतिविधियों जो सिर्फ एक ठंडे उपचार की आवश्यकता है और एक के इंजेक्शन वाणिज्यिक 18 F-FDG का पता लगाने के लिए विकसित किया गया है. पूरी प्रक्रिया एक इलाज और इमेजिंग अनुक्रम है जो हर 30 मिनट पर शुरू होता है जब तक सभी जानवरों का इलाज कर रहे हैं और imaged के बाद एक दिन में किया जा सकता है. प्रयोगात्मक उल्लिखित शर्तों के तहत, 10 चूहों (या 5 चूहों के दो समूहों) के एक कुल एक ही इमेजिंग प्रणाली के साथ एक ही दिन पर परीक्षण किया जा सकता है. अगर 2 या अधिक पशुओं के एक विशेष रूप से डिजाइन पशु बिस्तर पर एक साथ स्कैन कर सकते हैं, के रूप में यह पहले किया गया है 17 की सूचना दी throughput के इस प्रकार के लिए सीमा को उठाया जा सकता है. अध्ययन हम एक संयुक्त micro-PET/CT इमेजिंग प्रणाली है जो विस्तृत संरचनात्मक सीटी द्वारा उपलब्ध कराई गई जानकारी का लाभ लेता है के उपयोग पर निर्भर पूरा करने के लिए. हालांकि, एक स्वसंपूर्ण सूक्ष्म पीईटी भी कार्य को पूरा करने के लिए जब एक 57 सी में सक्षमओ संचरण स्कैन F18 उत्सर्जन डेटा अधिग्रहण करने से पहले वर्कफ़्लो के लिए जोड़ा गया है. पीईटी छवि पुनर्निर्माण के दौरान 57 सह संचरण डेटा क्षीणन सुधार के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और भी संरचनात्मक स्थानीयकरण के लिए खंगाला जा सकता है.

इस प्रोटोकॉल के ठंडे उपचार (उदाहरण के लिए, इस अध्ययन में 5 घंटे) की अवधि का अनुकूलन के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है. एक छोटी अवधि के समय या ठंड के जोखिम के उन्मूलन पृष्ठभूमि करने के लिए करीब एक गतिविधि का उत्पादन कर सकते हैं और विधि किसी भी बैट के नीचे विनियमन (मंजिल प्रभाव) के लिए असंवेदनशील हो सकता है. इसके विपरीत, एक लम्बी ठंड जोखिम (जैसे रातोंरात, या 24 घंटे) प्रेरण और विधि संतृप्त हो सकता बैट के ऊपर विनियमन (छत प्रभाव) में कोई मतभेद masking को अधिकतम करने के लिए हो सकता है. अनुकूलित इस प्रोटोकॉल में वर्णित शर्तों प्रोप्रानोलोल दमन और β3 agonist BRL37344 उत्तेजना परीक्षण (2 चित्रा के माध्यम से मान्य किया गया है

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

लेखकों के लिए इस विधि को विकसित करने में उनकी टिप्पणी मददगार है और तकनीकी सहायता के लिए लौरा Diaz, केविन फिलिप्स, Willa ए Hsueh, और राजा सी. ली धन्यवाद देना चाहूंगा.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Micro-PET/CT Imaging System Siemens Medical Solutions USA, Inc. Inveon Dedicated PET System and Inveon Multimodality CT/SPECT System (docked)
Propranolol Sigma P0884
BRL 37344 Sigma B169
18F-FDG Cyclotope Inc.
C57BL/6J Male Mice Jackson Laboratory 000664 3-4 months old

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References

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FDG micro-PET/CT साथ चूहे में ब्राउन फैट की कार्यात्मक इमेजिंग
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Cite this Article

Wang, X., Minze, L. J., Shi, Z. Z. Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT. J. Vis. Exp. (69), e4060, doi:10.3791/4060 (2012).More

Wang, X., Minze, L. J., Shi, Z. Z. Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT. J. Vis. Exp. (69), e4060, doi:10.3791/4060 (2012).

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