Summary
Un metodo di imaging funzionale di tessuto adiposo bruno topo (BAT) è descritto in cui freddo stimolato l'assorbimento di 18F-fluorodesossiglucosio (FDG) in BAT è non invasivo valutata con un protocollo standardizzato micro-PET/CT. Questo metodo è robusto e sensibile per rilevare le differenze nelle attività BAT in modelli murini.
Abstract
Tessuto adiposo bruno (BAT) si differenzia dal tessuto adiposo bianco (WAT) per la sua posizione discreta e un colore marrone-rosso a causa della vascolarizzazione ricca e alta densità di mitocondri. BAT svolge un ruolo importante nel dispendio energetico e non brividi termogenesi nei mammiferi neonati e gli adulti 1. BAT-mediata termogenesi è altamente regolata dal sistema nervoso simpatico, prevalentemente attraverso i recettori adrenergici β 2, 3. Recenti studi hanno dimostrato che le attività BAT negli adulti umani sono negativamente correlati con l'indice di massa corporea (BMI) e altri parametri diabetici 4-6. BAT è stato quindi proposto come un potenziale bersaglio per la terapia anti-obesity/anti-diabetes focalizzazione sulla modulazione di bilancio energetico 6-8. Mentre diverse freddi sfida basati tomografia a emissione di positroni (PET) sono stabiliti metodi per rilevare BAT 9-13 umana, non vi è essenzialmente alcun protocollo standard per l'imaging e quantificazione delle BAT in modelli animali di piccole dimensioni come i topi. Qui descriviamo un robusto PET / CT metodo di imaging per la valutazione funzionale della BAT nei topi. In breve, i topi adulti C57BL/6J sono stati trattati a freddo in condizioni di digiuno per una durata di 4 ore prima di aver ricevuto una dose di 18 F-Fluorodeoxyglucose (FDG). I topi sono stati rimasta al freddo per una ulteriore ora dopo l'iniezione FDG, e poi scansionato con un piccolo animale sistema dedicato micro-PET/CT. Le immagini PET acquisite erano co-registrate con le immagini TC per i riferimenti anatomici e analizzati per la captazione di FDG nella zona BAT interscapolare per presentare l'attività BAT. Questo trattamento standardizzato freddo e protocollo di imaging è stato convalidato attraverso attività BAT test durante interventi farmacologici, per esempio, l'attivazione BAT soppressa dal trattamento di β-adrenergico antagonista propranololo 14, 15, o l'attivazione BAT potenziata β3 agonisti BRL37344 16. Il metodo described qui può essere applicato per lo screening per i farmaci / composti che modulano l'attività BAT, o per identificare i geni / pathways che sono coinvolti nello sviluppo BAT e regolazione in vari studi preclinici e di base.
Protocol
1. Animal Preparazione e trattamento a freddo
- Individuare e ispezionare una stanza fredda 4 ° C, che è stato approvato per l'alloggiamento di topi di laboratorio.
- Pre-chill gabbie per gli animali durante la notte in cella. Le gabbie sono assemblate senza mangime e le lettiere, ma con una bottiglia d'acqua.
- Al mattino del giorno sperimentale, topi posto uno per uno in ciascuna delle pre-raffreddate gabbie a intervalli di 30 min. Ogni topo singolarmente in gabbia dovrebbe stare in cella per circa 4 ore prima di essere trasportato al laboratorio di imaging. Assicurarsi che i topi sono il digiuno, ma con accesso all'acqua.
- Alle 4 di trasporto dopo il trattamento a freddo ora un animale alla volta ogni 30 minuti al laboratorio di imaging. Questo può essere ottenuto mediante riempimento di un contenitore di polistirolo con ghiaccio e mettendo un pre-raffreddata gabbia di alloggiamento sopra il ghiaccio all'interno della scatola. Liberamente posizionare il coperchio della scatola di polistirolo.
2. Setup Micro-PET/CT Imaging Workflow
- Acquisizione CT: per un intero corpo TC, impostare la corrente a 500 uA, tensione a 80kV, tempo di esposizione a 200 msec, e 240 passaggi per 240 ° di rotazione. Per il rivelatore di raggi X, selezionare la risoluzione a "ingrandimento di basso" con il 78 mm assiale campo dell'imaging e la modalità di un letto singolo. Selezionare "ricostruzione in tempo reale" con il "Common Cone-Beam ricostruzione" metodo in modo che i PC colloqui di accoglienza conun apposito reale ricostruzione al computer tempo (Cobra) per avviare l'attività.
- Acquisizione PET Emissione: Situato a 600 sec (10 min) per "tempo di ciclo fisso" in opzione "acquisto dal tempo". Selezionare F-18 come "isotopo studio" e l'uso 350-650 keV come "livello di energia".
- PET Istogramma Emissione: Set "telaio dinamico" come "nero" per i dati di processo come una cornice per tutta la durata per ottenere la scansione statica. Selezionare "3D" come tipo di istogramma e scegliere "nessuna correzione dispersione".
- PET Ricostruzione: Usa 2D Ordered Subset Expectation Maximization (OSEM2D) come algoritmo di ricostruzione.
3. L'iniezione di FDG
- Ordinare un pacchetto clinico di 18 F-FDG (10 mCi) da un venditore regionale per il suo arrivo al laboratorio di imaging ~ 30 minuti prima dell'iniezione programmato prima. Seguire le procedure di sicurezza dell'istituto per ricevere ed esaminare il pacchetto contenente materia radioattivals (RAM).
- Con la protezione fornita da un L-block scudo tavolo, l'aliquota FDG e fare diluizioni con soluzione salina sterile. La concentrazione di attività diluita di FDG dovrebbe essere disponibile a 200-300 μCi/100 ul per ogni iniezione. Aspirare la soluzione FDG in una siringa da 1 ml con 26G 1/2 pollici aghi, e misurare la radioattività della siringa intera con un calibratore di dose.
- Iniettare l'animale che è appena trasportato dalla camera fredda (vedi punto 1.4) con 100 ml di soluzione FDG via intraperitoneale (ip) route. Registrare il tempo di iniezione. Misurare la radioattività residuo della siringa di nuovo con il calibratore dose.
- Mettere l'animale torna alla gabbia fredda all'interno di un dispositivo di raffreddamento polistirolo mantenuto con ghiaccio. Incubare l'animale in freddo (~ 4 ° C) per 1 ora per la captazione di FDG.
- Calcolare la dose iniettata FDG per ciascun topo con la seguente formula:
Iniettata attività (uCi) = attività in siringa prima dell'iniezione- Attività in siringa dopo l'iniezione
4. Micro-PET/CT Imaging
- L'imaging micro-PET/CT inizia 1 ora dopo l'iniezione di FDG o 5 ore dopo il trattamento a freddo. Mettere l'animale in una camera di induzione dell'anestesia con il 3% isoflurano in ossigeno.
- Una volta che l'anestesia è indotta, l'animale viene spostato su un micro-CT pellet (letto animale) con la testa appoggiata in una maschera cono che eroga in continuo isoflurano (2%) ad una portata di 2 L / min. Un pad riscaldamento elettrico (BIOVET, m2m Imaging Corp.) è posta sotto l'animale per aiutare a mantenere la temperatura corporea.
- Far scorrere l'animale verso l'ingresso dello scanner MM, attivare l'icona "laser" dalla barra degli strumenti, e utilizzare il controllo touchpad per spostare il letto in modo che il petto dell'animale è alla croce di linee laser orizzontali e verticali. Nella "Laser Allinea" finestra selezionare "primo tipo di scansione" come TAC, e "Acquisizione PET incluso nel flusso di lavoro" come option.
- Aprire il "View Scout" finestra e acquisire una visione esploratore radiografia radiografia. Utilizzare IAW per regolare la posizione del letto animale in modo che il centro del campo di vista di CT si trova nel centro del corpo del mouse (fegato). Ripetere l'operazione se necessario.
- Avviare il "flusso di lavoro" stabilito al punto 2. Quando le opzioni pop-up, selezionare un appropriato 3D PET-CT trasformazione di file di matrice da utilizzare in CT ricostruzione, e scegliere un file di normalizzazione di recente creato per la ricostruzione PET senza la correzione dell'attenuazione. La IAW inizierà CT e PET in sequenza come programmato.
- Dopo l'intero flusso di lavoro è completato, che può prendere 20-25 min, brevemente valutare la qualità delle immagini acquisite CT e PET con la VM ASIPro, un micro-PET software di analisi co-installato con IAW. Archiviare i dati di imaging di un dispositivo di memorizzazione dati o trasferire i dati attraverso la rete a una workstation analisi post di imaging (vedere il punto 5) per ulteriori analisi.
- Release l'animale dai sistemi di imaging e posizionarlo a una gabbia di alloggiamento pulito con cibo normale e acqua per il suo recupero a temperatura ambiente. I sistemi sono ora pronti per l'animale successivo nella coda. Nota: la cura e la gestione del post-immagini animali dovrebbe seguire dell'istituto norme in materia di "gestione degli animali da laboratorio iniettati con RAM". Si noti inoltre che gli aghi usati / siringhe, i pad assorbenti, guanti, biancheria da letto e tutto e la materia fecale devono essere considerati come rifiuti radioattivi, e trattati secondo le norme dell'istituto pertinenti RAM di smaltimento di rifiuti.
5. Post-analisi di imaging
- Apri ricerca Inveon Workplace (IRW) software (Siemens) e importare manualmente sia TC e dati PET set. Co-registrazione TC e immagini PET nella finestra "Registrazione" utilizzando gli strumenti con il "generale analisi" la funzione, e sotto la finestra "Review" assicurarsi un perfetto allineamento tra TC e immagini PET in tutte le 3 dimensioni.
- Da "regione di interesse (ROI) Quantificazione" finestra, con i riferimenti forniti dal co-registrate le immagini TAC, identificare BAT alla regione interscapolare del collo, il più predominante freddo inducibile BAT in topi adulti, e disegnare il volume di interesse (VOI) di BAT sul set di dati PET. Selezionare "Intensità Voxel" come "Tipo Quantificazione" e registrare la radioattività media all'interno del VOI come Bq / ml. Un fattore di calibrazione che converte i conteggi / sec di Bq / ml è stato precedentemente stabilito mediante la scansione di un fantasma con radioattività nota.
- Captazione di FDG nel BAT è quantificato come dose percentuale iniettata per grammo di tessuto (% ID / g) con correzione decadimento. La dose iniettata è il risultato del Passaggio 3,5, tuttavia, convertito becquerel (Bq) Unità (1 uCi = 37.000 Bq); assumiamo che 1 ml di tessuto pari a 1 g.
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Representative Results
Un esempio di imaging micro-PET/CT di BAT mouse viene mostrato in Figura 1. Mentre l'imaging CT fornisce informazioni anatomiche, il PET codifica la distribuzione e la quantità di 18 F-FDG tutto il corpo. Questi dati di imaging possono essere visualizzati separatamente (1A e 1B), fusa (1C), o risultare in una funzione 3D come proiezione massima intensità (MIP, 1D). Con l'aiuto di uno strumento di imaging 3D, un volume di interesse (VOI), qui la regione interscapolare BAT (indicato dalle frecce in figura 1), viene disegnata sopra le immagini PET ei segnali totale all'interno del VOI può essere convertito in ID% / g, che rappresenta la percentuale della dose iniettata (% ID) per grammo di tessuto. Nel topo dimostrato, captazione di FDG nel BAT è il 19% ID / g. Al fine di verificare se questo freddo induzione e protocollo di imaging è abbastanza sensibile per rilevare un attività alterata BAT, in entrambi i casi di up-regulation o down-regulation, abbiamo usato βadrenorecettore antagonista propranololo per sopprimere l'attivazione BAT 15, e β3 agonisti BRL37344 per migliorare induzione BAT 16, rispettivamente. Questi interventi farmacologici sono stati applicati durante il trattamento a freddo e precisamente, a 30 minuti prima della iniezione di FDG. PET / TC (Figura 2A) e l'analisi (Figura 2B) ha mostrato che il trattamento propranololo ridotto significativamente l'FDG in BAT, mentre BRL37344 particolarmente elevato l'assorbimento, in confronto con il controllo del veicolo.
Figura 1. Immagini Micro-PET/CT di BAT in un topo, dopo 5 ore di trattamento a freddo. (A) una sezione coronale di immagini CT. (B) Una sezione coronale di immagine PET co-registrato con il CT in "A". (C) un anello fuso PET / CT immagine risultante dalla sovrapposizione di "A" e "B". (D) Intensità massima projectia (MIP) presentazione dei fusi PET / CT immagini. Le frecce gialle: la superficie corrispondente a interscapolare tessuto adiposo bruno.
Figura 2. Micro-PET/CT dimostrazione di alterazione BAT attività da farmaci adrenergici. (A) 18 F-FDG PET / TC di topi trattati con diversi farmaci. a) PBS (controllo). b) Propranolol (β antagonista, 5mg/kg, ip). Nota una marcata riduzione della captazione di FDG nella zona BAT. c) BRL37344 (β3 agonista, 5mg/kg, ip). Notare un aumento significativo accumulo di FDG in BAT. Le frecce gialle: la superficie corrispondente a interscapolare tessuto adiposo bruno. (B) L'analisi quantitativa della captazione di FDG nella BAT. I valori di% ID / g (la percentuale della dose iniettata per grammo di tessuto) sono presentati (media ± DS). n = 10 per il gruppo PBS; n = 5 per gruppi sia propranololo e BRL37344. *, P <0.05; **,p <0,005, rispetto al gruppo PBS.
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Discussion
In questo studio un metodo di imaging micro-PET/CT-based è stato sviluppato per rilevare attività BAT in topi adulti che richiede soltanto un trattamento a freddo e una iniezione di commercialmente disponibile 18 F-FDG. L'intera procedura può essere fatto in un giorno dopo un trattamento e sequenza di immagini che parte ogni 30 minuti fino a quando tutti gli animali vengono trattati e ripreso. Nelle condizioni sperimentali descritte, un totale di 10 topi (o due gruppi di 5 topi) possono essere testati nello stesso giorno con un sistema di imaging. La limitazione di questo tipo di flusso può essere sollevato se due o più animali possono essere scanditi simultaneamente su un letto animale appositamente progettati come è stato precedentemente riportato 17. Per completare lo studio si basano sull'uso di un sistema combinato di imaging micro-PET/CT che sfrutta le informazioni fornite dal anatomica CT. Tuttavia, un autonomo micro-PET è in grado di svolgere il compito, quando un 57 Co trasmissione scansione viene aggiunto al flusso di lavoro precedente l'acquisizione dei dati di emissione F18. I dati di trasmissione 57 CO può essere utilizzato per la correzione dell'attenuazione durante la ricostruzione dell'immagine PET e può anche essere ricostruita per la localizzazione anatomica.
Un punto critico di questo protocollo è quello di ottimizzare la durata del trattamento a freddo (ad esempio, 5 ore in questo studio). Un tempo di durata minore o l'eliminazione di esposizione al freddo può produrre un'attività vicino al fondo e il metodo può essere insensibile a qualsiasi down-regulation delle BAT (l'effetto pavimento). In contrasto, l'esposizione allungata freddo (come ore notturne, o 24) può massimizzare l'induzione e il metodo sono saturate mascherare eventuali differenze nella up-regolazione del BAT (l'effetto soffitto). Le condizioni ottimali descritte in questo protocollo sono stati convalidati con la soppressione propranololo e β3 test di stimolazione agonisti BRL37344 (Figura 2
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Laura Diaz, Kevin Phillips, Willa A. Hsueh, e il re C. Li per il loro sostegno utili osservazioni e tecnico per lo sviluppo di questo metodo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro-PET/CT Imaging System | Siemens Medical Solutions USA, Inc. | Inveon Dedicated PET System and Inveon Multimodality CT/SPECT System (docked) | |
| Propranolol | Sigma | P0884 | |
| BRL 37344 | Sigma | B169 | |
| 18F-FDG | Cyclotope Inc. | ||
| C57BL/6J Male Mice | Jackson Laboratory | 000664 | 3-4 months old |
References
- Cypess, A. M., Kahn, C. R. The role and importance of brown adipose tissue in energy homeostasis. Curr. Opin. Pediatr. 22, 478-484 (2010).
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiol. Rev. 84, 277-359 (2004).
- Collins, S., Surwit, R. S. The beta-adrenergic receptors and the control of adipose tissue metabolism and thermogenesis. Recent Prog. Horm. Res. 56, 309-328 (2001).
- Ouellet, V., et al. Outdoor temperature, age, sex, body mass index, and diabetic status determine the prevalence, mass, and glucose-uptake activity of 18F-FDG-detected BAT in humans. J. Clin. Endocrinol. Metab. 96, 1115-1125 (2011).
- Cypess, A. M. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. N. Engl. J. Med. 360, 1509-1517 (2009).
- Fruhbeck, G., Becerril, S., Sainz, N., Garrastachu, P., Garcia-Velloso, M. J. BAT: a new target for human obesity. Trends Pharmacol. Sci. 30, 387-396 (2009).
- Cypess, A. M., Kahn, C. R. Brown fat as a therapy for obesity and diabetes. Curr. Opin. Endocrinol. Diabetes Obes. 17, 143-149 (2010).
- Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. N. Engl. J. Med. 360, 1518-1525 (2009).
- van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. N. Engl. J. Med. 360, 1500-1508 (2009).
- Cohade, C., Mourtzikos, K. A., Wahl, R. L. "USA-Fat": prevalence is related to ambient outdoor temperature-evaluation with 18F-FDG PET/CT. J. Nucl. Med. 44, 1267-1270 (2003).
- Garcia, C. A. Reduction of brown fat 2-deoxy-2-[F-18]fluoro-D-glucose uptake by controlling environmental temperature prior to positron emission tomography scan. Mol. Imaging Biol. 8, 24-29 (2006).
- Saito, M. High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity. Diabetes. 58, 1526-1531 (2009).
- Agrawal, A., Nair, N., Baghel, N. S. A novel approach for reduction of brown fat uptake on FDG PET. Br. J. Radiol. 82, 626-631 (2009).
- Soderlund, V., Larsson, S. A., Jacobsson, H. Reduction of FDG uptake in brown adipose tissue in clinical patients by a single dose of propranolol. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 34, 1018-1022 (2007).
- Zhao, J., Cannon, B., Nedergaard, J. Thermogenesis is beta3- but not beta1-adrenergically mediated in rat brown fat cells, even after cold acclimation. Am. J. Physiol. 275, 2002-2011 (1998).
- Rowland, D. J., Garbow, J. R., Laforest, R., Snyder, A. Z. Registration of [18F]FDG microPET and small-animal MRI. Nucl. Med. Biol. 32, 567-5672 (2005).
