Summary
Ett förfarande för funktionell avbildning av mus brun fettvävnad (BAT) beskrivs där kall-stimulerad upptagning av 18F-fluordeoxiglukos (FDG) i BAT är icke-invasivt bedömas med ett standardiserat protokoll micro-PET/CT. Denna metod är robust och känsligt för att upptäcka skillnader i BAT aktiviteter i musmodeller.
Abstract
Brun fettvävnad (BAT) skiljer sig från vit fettvävnad (WAT) genom sin diskret läge och en brun-röd färg på grund rika vaskularisering och hög densitet av mitokondrier. BAT spelar en viktig roll i energiförbrukning och icke-frossa thermogenesis hos nyfödda däggdjur samt vuxna 1. BAT-medierad termogenes är hårt reglerad av det sympatiska nervsystemet, huvudsakligen via β adrenergisk receptor 2, 3. Nyligen genomförda studier har visat att BAT verksamhet i vuxna människor negativt korrelerade med body mass index (BMI) och andra parametrar diabetes 4-6. BAT har därför föreslagits som ett potentiellt mål för anti-obesity/anti-diabetes terapi med fokus på modulering av energibalansen 6-8. Medan flera kalla utmaning-baserade positronemissionstomografi (PET) metoder fastställs för att detektera mänsklig BAT 9-13, egentligen inte finns någon standardiserat protokoll för avbildning och quantifblue av BAT i små djurmodeller såsom möss. Här beskriver vi en robust PET / CT metod för funktionell bedömning av BAT i möss. Kortfattat var vuxna C57BL/6J-möss kall behandlas under fastande betingelser under en varaktighet av 4 timmar innan de fick en dos av 18 F-fluordeoxiglukos (FDG). Mössen förblev i kyla under ytterligare en timme efter FDG injektion och sedan skannas med en liten djur-dedikerad micro-PET/CT systemet. De förvärvade PET-bilderna var tillsammans registrerad hos CT-bilder för anatomiska referenser och analyseras för FDG upptag i interskapulära BAT området för att presentera BAT aktivitet. Denna standardiserade kalla behandling och bildbehandling protokoll har validerats genom testning BAT aktiviteter under farmakologiska interventioner, till exempel undertryckta BAT aktivering genom behandling av β-adrenoceptorantagonist propranolol 14, 15, eller den förbättrade BAT aktivering av β3 agonist BRL37344 16. Metoden described här kan tillämpas för att screena för läkemedel / föreningar som modulerar BAT aktivitet eller för att identifiera gener / vägar som är involverade i BAT utveckling och reglering i olika prekliniska och grundläggande studier.
Protocol
1. Djurens Förberedelser och kylbehandling
- Leta upp och inspektera en 4 ° C kallt rum som har godkänts för att ta emot laboratoriemöss.
- Pre-chill djurburar natten i det kalla rummet. Burarna är monterade utan foder och strö men med en flaska vatten.
- På morgonen den experimentella dagen, placera möss en efter en i var och en av de i förväg kylda burar vid 30 minuters intervall. Varje enskilt bur mus bör stanna i kylrummet för nästan 4 timmar innan det transporteras till bildbehandling labb. Se till att mössen fastar men med tillgång till vatten.
- Vid 4 timmar efter kylbehandling transporter ett djur vid en tidpunkt varje 30 min till den bildgivande Lab. Detta kan åstadkommas genom att fylla en Styrofoam behållare med is och placera en i förväg kyld bostäder bur ovanpå isen inuti lådan. Löst placera locket på frigolitlåda.
2. Inställning Micro-PET/CT Imaging Workflow
- CT Förvärv: För en hela kroppen datortomografi, som ström vid 500 uA, spänning vid 80kV, exponeringstid vid 200 ms, och 240 steg för 240 ° rotation. För röntgen detektor, välj upplösning vid "låg-system förstoring" med 78 mm axiell bildfältet och en enkelsäng läge. Välj "realtid rekonstruktion" med "Common Cone-Beam återuppbyggnad" metod så att värddatorn samtal meden särskild realtid rekonstruktion dator (Cobra) för att initiera uppgiften.
- PET Emission Förvärv: Ställ 600 sek (10 min) för "fast scan tid" i "förvärva med tiden" alternativet. Välj F-18 som "studera isotop" och använd 350-650 keV som "energinivå".
- PET Emission Histogram: Ställ in "dynamisk ram" som "svart" att behandla uppgifter som en ram för hela för att uppnå statisk skanning. Välj "3D" som histogram typ och välj "ingen scatter korrigering".
- PET återuppbyggnad: Använd 2D Beställd Maximering Delmängd Förväntan (OSEM2D) som återuppbyggnaden algoritmen.
3. Injektion av FDG
- Beställ en klinisk paket med 18 F-FDG (10 mCi) från en regional leverantör för sin ankomst till bildbehandling labb ~ 30 minuter före planerad första injektionen. Följ institutets säkerhetsrutiner för att ta emot och undersöka paketet innehåller radioaktiva materials (RAM).
- Med det skydd som ett L-block bordsskiva sköld, alikvot av FDG och göra spädningar med steriliserad saltlösning. Den utspädda aktivitetskoncentration av FDG bör finnas på 200-300 μCi/100 UL för varje injektion. Dra FDG lösningen i en 1 ml spruta med 26G 1/2 tum nål, och mäta radioaktiviteten i hela sprutan med en dos kalibrator.
- Injicera djur som bara transporteras från kylrummet (se steg 1,4) med 100 pl av FDG lösning via den intraperitoneala (ip) vägen. Anteckna insprutningstiden. Mät resten radioaktiviteten av sprutan igen med doskalibrator.
- Sätt djuret tillbaka till den kalla buren i en frigolit svalare underhålls med is. Inkubera djuret i kallt (~ 4 ° C) under 1 timme för FDG upptag.
- Beräkna den injicerade FDG aktiviteten för varje mus med följande formel:
Injicerad aktivitet (Ci) = aktivitet i sprutan före injektion- Verksamhet spruta efter injektion
4. Micro-PET/CT Imaging
- Den micro-PET/CT avbildning startar 1 timme efter FDG injektion eller 5 timmar efter kylbehandling. Sätt djuret i en anestesi induktion kammare med 3% isofluran i syre.
- När anestesi induceras, djuret förflyttas till en mikro-CT pelleten (djur säng) med sitt huvud vilande i en kon ansiktsmask som kontinuerligt levererar Isofluran (2%) vid en flödeshastighet av 2 l / min. En elektrisk värmedyna (Biovet, M2M IMAGING CORP) placeras under djuret för att upprätthålla kroppstemperaturen.
- Skjut djuret till ingången av MM skannern, aktivera "laser"-ikonen i verktygsfältet och använder styrplattan för att flytta sängen så att bröstet av djuret är vid korset av horisontella och vertikala laserlinjer. I "Laser Rikta" fönstret väljer "första skanningstyp" som datortomografi och "PET förvärv ingår i arbetsflödet" som Option..
- Öppna "Scout Visa" fönstret och få en scout view röntgen röntgenbild. Använd IAW att justera läget för djuret bädden så att centrum synfält av CT ligger i centrum av musens kropp (lever). Upprepa detta steg om det behövs.
- Starta "arbetsflödet" fastställs i steg 2. När alternativen dyker upp, välj en lämplig 3D PET-CT omformningsmatris fil som ska användas i CT rekonstruktion och välj ett nyligen skapat normalisering fil för PET rekonstruktion utan dämpning korrigering. Den IAW startar då CT och PET sekventiellt som programmerats.
- Efter hela arbetsflödet är klar, vilket kan ta 20-25 minuter, kort utvärdera kvaliteten på de förvärvade CT och PET-bilderna med ASIPro VM, en mikro-PET analys programvara tillsammans installeras med IAW. Arkivera bilddata till en datalagringsenhet eller överföra data via nätverket till en post bildanalys arbetsstation (se steg 5) för vidare analys.
- Release djuret från bildsystemen och placera det på en ren bostad bur med vanlig mat och vatten för sin återhämtning vid rumstemperatur. Systemen är nu redo för nästa djur i kön. Notera vård och hantering av post-imaging djur bör följa institutets föreskrifter om "hantering av försöksdjur injicerade med RAM". Observera också att använda nålar / sprutor, de absorberande dynor, handskar, och alla sängkläder och avföring bör betraktas som radioaktivt avfall, och hanteras enligt institutets relevanta RAM avfallshantering föreskrifter.
5. Post-bildanalys
- Öppna Inveon Research Workplace (IRW) mjukvara (Siemens) och manuellt importera både CT och PET datamängder. Co-registret CT och PET-bilderna i "Registrering" fönster med verktyg med "General analys"-funktion, och under "Review" fönstret se en perfekt anpassning mellan CT och PET bilder i alla 3 dimensioner.
- Från "intressant område (ROI) Kvantifiering" fönster med referenser som de sam-registrerade CT-bilder, identifiera bästa tillgängliga teknik vid interskapulära regionen av halsen, den mest dominerande kalla inducerbar BAT i vuxna möss, och dra volymen av intresse (VOI) av BAT över PET datamängden. Välj "Voxel Intensitet" som "Kvantifiering typ" och registrera den genomsnittliga radioaktiviteten i VOI som Bq / ml. En kalibreringsfaktor som omvandlar pulser / sek till Bq / ml har tidigare fastställts genom att skanna en fantom med känd radioaktivitet.
- FDG upptag i BAT kvantifieras som procent injicerad dos per gram vävnad (% ID / g) med förfall korrigering. Den injicerade dosen är resultatet av steg 3,5, dock omvandlas till becquerel (Bq) enhet (1 pCi = 37.000 Bq), vi antar att 1 ml vävnad är lika med 1 g..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett exempel på micro-PET/CT avbildning av mus BAT visas i figur 1. Medan CT ger anatomisk information, kodar PET avbildning distribution och mängden 18 F-FDG upptag genom hela kroppen. Dessa bilddata kan ses separat (1A och 1B), smält (1C), eller med en 3D-funktionen som maximal intensitet projektion (MIP, 1D). Med hjälp av ett 3D-röntgen verktyg, en volym av intresse (VOI), här interskapulära BAT regionen (indikeras med pilar i figur 1), dras över PET-bilderna och de totala signaler inom VOI kan omvandlas till%-ID / g representerar procentandelen injicerad dos (% ID) per gram vävnad. I musen visade, är FDG upptag i BAT 19% ID / g.. För att kontrollera om denna kalla-induktion och bildbehandling protokoll är tillräckligt känslig för att upptäcka en förändrad BAT aktivitet, i båda fallen med uppreglering eller nedreglering använde vi βadrenoceptorantagonist som propranolol att undertrycka BAT aktivering 15, och β3-agonist BRL37344 att öka BAT induktion 16, respektive. Dessa farmakologiska interventioner har tillämpats under den kalla behandlingen och exakt, vid 30 min före injektionen av FDG. PET / CT (Figur 2A) och analysen (figur 2B) visade att propranolol behandlingen signifikant minskade FDG-upptaget i BAT, medan BRL37344 markant förhöjda upptag, jämfört med vehikelkontroll.
Figur 1. Micro-PET/CT avbildning av BAT i en mus efter 5 timmar kall-behandling. (A) En koronal sektion av CT-bilden. (B) En koronalt avsnitt av PET-bilden samtidigt registreras hos CT i "A". (C) Ett kondenserat PET / CT-bilden resulterade från den överlagring av "A" och "B". (D) Maximal intensitet projectipå (MIP) presentation av de kondenserade PET / CT-bilder. Gula pilar: det område som motsvarar interscapular brun fettvävnad.
Figur 2. Micro-PET/CT demonstration av BAT aktivitet förändring av adrenoceptor läkemedel. (A) 18 F-FDG PET / CT-avbildning av möss behandlade med olika läkemedel. a) PBS (kontroll). b) Propranolol (β-antagonist, 5mg/kg, ip). Notera en markant minskning av FDG-upptaget i BAT område. c) BRL37344 (β3 agonist, 5mg/kg, ip). Notera en signifikant ökning i FDG ackumulering i BAT. Gula pilar: det område som motsvarar interscapular brun fettvävnad. (B) Kvantitativ analys av FDG upptag i BAT. Värden på% ID / g (andelen injicerad dos per gram vävnad) presenteras (medelvärde ± SD). n = 10 för PBS-gruppen, n = 5 för både propranolol och BRL37344 grupper. *, P <0,05; **,p <0,005, jämfört med PBS-gruppen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna studie en micro-PET/CT-based avbildningsmetod har utvecklats för att upptäcka BAT verksamhet i vuxna möss som helt enkelt kräver en kylbehandling och en injektion av kommersiellt tillgänglig 18 F-FDG. Hela proceduren kan göras på en dag efter en behandling och bildbehandling sekvens som startar varje 30 minuter tills alla djuren behandlas och avbildas. Under de beskrivna försöksbetingelserna, kan totalt 10 möss (eller 2 grupper av 5 möss) testas på samma dag med ett enda bildsystem. Begränsningen till denna typ av kapacitet kan lyftas om 2 eller flera djur kan skannas samtidigt på en speciellt utformad djur sängen som det tidigare har rapporterats 17. Att slutföra studien vi förlita sig på användningen av ett kombinerat micro-PET/CT avbildningssystem som tar fördel av den detaljerade anatomisk information från CT. Emellertid är en fristående mikro-PET också kunna uppfylla uppgiften när 57 CO växellåda Scan läggs till arbetsflödet före F18 utsläpp datainsamling. De 57 Co överföring data kan användas för dämpning korrigering under PET bildrekonstruktion och kan även rekonstrueras för anatomisk lokalisering.
Ett kritiskt steg i detta protokoll är att optimera längd kylbehandling (t.ex. 5 timmar i denna studie). En kortare varaktighet eller eliminering av kalla exponering kan ge en aktivitet nära bakgrunden och metoden kan vara okänslig för alla nedreglering av BAT (golv effekten). Däremot kan en långsträckt kall exponering (t.ex. över natten, eller 24 timmar) maximera induktion och metoden kan bli mättad maskering eventuella skillnader i uppreglering av BAT (taket effekt). De optimerade som beskrivs i detta protokoll har validerats genom propranolol förtryck och β3 agonist BRL37344 tester stimulering (Figur 2
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Laura Diaz, Kevin Phillips, Willa A. Hsueh, och kung C. Li för deras hjälp synpunkter och teknisk support för att utveckla denna metod.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro-PET/CT Imaging System | Siemens Medical Solutions USA, Inc. | Inveon Dedicated PET System and Inveon Multimodality CT/SPECT System (docked) | |
| Propranolol | Sigma | P0884 | |
| BRL 37344 | Sigma | B169 | |
| 18F-FDG | Cyclotope Inc. | ||
| C57BL/6J Male Mice | Jackson Laboratory | 000664 | 3-4 months old |
References
- Cypess, A. M., Kahn, C. R. The role and importance of brown adipose tissue in energy homeostasis. Curr. Opin. Pediatr. 22, 478-484 (2010).
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiol. Rev. 84, 277-359 (2004).
- Collins, S., Surwit, R. S. The beta-adrenergic receptors and the control of adipose tissue metabolism and thermogenesis. Recent Prog. Horm. Res. 56, 309-328 (2001).
- Ouellet, V., et al. Outdoor temperature, age, sex, body mass index, and diabetic status determine the prevalence, mass, and glucose-uptake activity of 18F-FDG-detected BAT in humans. J. Clin. Endocrinol. Metab. 96, 1115-1125 (2011).
- Cypess, A. M. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. N. Engl. J. Med. 360, 1509-1517 (2009).
- Fruhbeck, G., Becerril, S., Sainz, N., Garrastachu, P., Garcia-Velloso, M. J. BAT: a new target for human obesity. Trends Pharmacol. Sci. 30, 387-396 (2009).
- Cypess, A. M., Kahn, C. R. Brown fat as a therapy for obesity and diabetes. Curr. Opin. Endocrinol. Diabetes Obes. 17, 143-149 (2010).
- Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. N. Engl. J. Med. 360, 1518-1525 (2009).
- van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. N. Engl. J. Med. 360, 1500-1508 (2009).
- Cohade, C., Mourtzikos, K. A., Wahl, R. L. "USA-Fat": prevalence is related to ambient outdoor temperature-evaluation with 18F-FDG PET/CT. J. Nucl. Med. 44, 1267-1270 (2003).
- Garcia, C. A. Reduction of brown fat 2-deoxy-2-[F-18]fluoro-D-glucose uptake by controlling environmental temperature prior to positron emission tomography scan. Mol. Imaging Biol. 8, 24-29 (2006).
- Saito, M. High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity. Diabetes. 58, 1526-1531 (2009).
- Agrawal, A., Nair, N., Baghel, N. S. A novel approach for reduction of brown fat uptake on FDG PET. Br. J. Radiol. 82, 626-631 (2009).
- Soderlund, V., Larsson, S. A., Jacobsson, H. Reduction of FDG uptake in brown adipose tissue in clinical patients by a single dose of propranolol. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 34, 1018-1022 (2007).
- Zhao, J., Cannon, B., Nedergaard, J. Thermogenesis is beta3- but not beta1-adrenergically mediated in rat brown fat cells, even after cold acclimation. Am. J. Physiol. 275, 2002-2011 (1998).
- Rowland, D. J., Garbow, J. R., Laforest, R., Snyder, A. Z. Registration of [18F]FDG microPET and small-animal MRI. Nucl. Med. Biol. 32, 567-5672 (2005).
