Summary
وصفنا بروتوكول للفي الوقت الحقيقي videoimaging للهجرة الخلايا العصبية في الدماغ الأمامي الماوس. وسجلت هجرة الخلايا العصبية السلائف فيروسي أو المطعمة التي تحمل علامات في حي شرائح واسعة باستخدام الحاد مجال التصوير الفلورسنت مع فاصل زمني سريع نسبيا اقتناء لدراسة المراحل المختلفة للهجرة الخلايا، بما في ذلك فترات من مراحل ثابتة والهجرة وسرعة الهجرة.
Abstract
هناك مجموعة كبيرة من الأدلة تشير إلى أن يتم إنشاء جوهري الخلايا العصبية وظيفية جديدة من حمام سباحة داخلي المنشأ من الخلايا الجذعية العصبية في المناطق المحظورة من الدماغ الثدييات الكبار. neuroblasts حديثي الولادة من منطقة subventricular (SVZ) تهاجر على طول مجرى منقاري المهاجرة (RMS) إلى وجهتها النهائية في البصلة الشمية (OB) 1. في RMS، neuroblasts ترحيل عرضية في سلاسل مغمد من خلال عمليات نجمي 2،3 باستخدام الأوعية الدموية كوسيلة لدعم الهيكلية ومصدر من العوامل الجزيئية اللازمة للهجرة 4،5. في OB، neuroblasts فصل من سلاسل وترحيل شعاعيا في طبقات مختلفة بصلي حيث تفرق في interneurons والاندماج في الشبكة القائمة 1 و 6.
في هذا المخطوط وصفنا إجراءات الهجرة خلية الرصد في شرائح حاد في الدماغ القوارض. استخدام شرائح الحادة يسمح للassessmالأنف والحنجرة الهجرة خلية في المكروية التي تشبه ارتباطا وثيقا في ظروف المجراة في مناطق الدماغ التي يصعب الوصول إليها لفي الجسم الحي التصوير. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه يتجنب حالة زراعة طويلة كما في حالة الثقافات عضوي النمط والخلية التي قد تغير في نهاية المطاف خصائص هجرة الخلايا. يمكن السلائف الخلايا العصبية الحادة في شرائح تصور باستخدام البصريات DIC أو البروتينات الفلورية. وضع العلامات الفيروسية السلائف الخلايا العصبية في SVZ، تطعيم neuroblasts من الفئران مراسل في SVZ من البرية من نوع الفئران، والفئران المعدلة وراثيا باستخدام البروتين التي تعبر عن الفلورية في neuroblasts كلها أساليب مناسبة لتصور neuroblasts وبعد هجرتهم. الأسلوب في وقت لاحق، ومع ذلك، لا يسمح لتعقبها الخلايا الفردية لفترات طويلة من الوقت بسبب كثافة عالية من الخلايا المسمى. استخدمنا اسعة المجال المجهر تستقيم الفلورسنت مجهزة الكاميرا CCD لتحقيق فاصل زمني سريع نسبيا اقتناء (واحد IMAجنرال الكتريك كل ثانية 15 أو 30) لتحديد موثوق ثابتة ومراحل المهاجرة. A تحديد دقيق للمدة الأطوار الثابتة والمهاجرة أمر حاسم لا لبس فيه لتفسير النتائج. ونحن أيضا تنفيذ عدة عمليات الاستحواذ خطوة Z-لرصد neuroblasts الهجرة في 3D. وقد استخدم على نطاق واسع مجال التصوير الفلورسنت لتصور الهجرة العصبية 7-10. هنا، نحن تصف بروتوكول مفصلة لوصفها neuroblasts، وأداء الفيديو في الوقت الحقيقي التصوير الهجرة أرومة عصبية حادة في شرائح من الدماغ الأمامي الماوس الكبار، وتحليل الهجرة الخلية. في حين أن البروتوكول وصف مثالا للهجرة neuroblasts في RMS الكبار، فإنه يمكن أيضا أن تستخدم لمتابعة الهجرة خلية في المخ بعد الولادة الجنينية والمبكر.
Protocol
1. وضع العلامات العصبية السلائف
يمكن Neuroblasts يمكن تصور استخدام الفئران المعدلة وراثيا التي تعبر عن البروتينات الفلورية انتقائي في neuroblasts (أي DCX-GFP، Gad67-GFP)، عن طريق حقن جزيئات فيروسية stereotaxically ترميز البروتينات الفلورية في SVZ أو RMS، أو عن طريق التطعيم السلائف الخلايا العصبية من الفئران مراسل (أي ، DCX-GFP، Gad67-GFP) في SVZ من البرية من نوع الفئران. وصفنا لإجراء عمليات ترقيع ووضع العلامات الفيروسية السلائف الخلايا العصبية.
تفكك neuroblasts من SVZ من الفئران مراسل
- ويلزم الحلول التالية لتفارق أرومة عصبية.
40X الحل
10 مل القلم / Strept (10000 ش الأسهم القلم / مل / Strept 1000 ميكروغرام / مل)
10 مل الجلوكوز (أسهم 200 ملغ / مل)
20 البيروفات الصوديوم مل (أسهم 100 مم)
ove_content "> 10 مل H 2 Oالتحضير 1 مليلتر مأخوذة
الحل تشريح (100 مل)
HBSS 1X - 97،4 مل
HEPES (1 M) - 0.1 مل
40X حل - 2.5 مل
الدناز الحل (20K وحدة / مل)
DNaseI، typeIV من البنكرياس البقري
150،000 وحدة في 7.5 مل حل O 2 H
تصفية 0،22 ميكرون
التحضير 1 مليلتر مأخوذة
التربسين-DNaseI الحل (10 مل)
HBSS - 8.6 مل
DNaseI (20K وحدة / مل) - 0.15 مل
التربسين EDTA-(0.5٪) - 1 مل
40X حل - 0.25 مل
سحن الحل (50 مل)
ntent "> المتوسطة Neurobasal - 47.5 ملBSA (300 ملغ / مل) - 332،5 ميكرولتر
40X حل - 1.25 مل
DNaseI (20K وحدة / مل) - 0،66 مل
- تخدير الماوس اثنين إلى ثلاثة أشهر الكبار من العمر تعبر عن بروتين فلوري في neuroblasts مع حقنة داخل الصفاق من 100 ميكرولتر من الكيتامين / زيلازين (10 ملغ / 1 ملغ لكل 10 غرام من وزن الجسم)، ثم قطع رأس. نستخدم GAD67-GFP الفئران 11. باستخدام مشرط، شريحة الدماغ coronally على مستوى البطين الجانبي، وتشريح خارج SVZ في وسط الجليد تشريح الباردة. وضع SVZ في أنبوب microcentrifuge مع 500 ميكرولتر من التربسين الدناز الحل، والحفاظ على الجليد لمدة 20 دقيقة.
- نقل SVZ في أنبوب مخروطي 15 مل تحتوي على 5 مل من قبل تحسنت (37 ° C) التربسين الدناز حل واحتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 لمدة 30 دقيقة.
- نقل محتويات في أنبوب 50 مل المخروطية التي تحتوي على 15 مل من يسحقالحل uration وأجهزة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 1 دقيقة. نضح طاف، إضافة 10 مل من محلول سحن، ونقل الخلايا إلى أنبوب جديد 15 مل المخروطية، وأجهزة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 1 دقيقة.
- النار وبولندا ماصة باستور للحد من حجم ومعطف مع تلميح المتوسطة سحن. الطرد المركزي التالي إزالة أكبر قدر من طاف وقت ممكن، وإضافة 2 مل من محلول سحن جديدة لأنبوب مخروطي الشكل. يسحن الخلايا في حل سحن (حوالي 50 مرة صعودا ونزولا مع ماصة باستور). تأخذ النصف العلوي من طاف، والذي يحتوي على خلايا فصلها بشكل جيد، وتحويلها في أنبوب 15 مل المخروطية جديدة تحتوي على 10 مل من محلول سحن.
- النار ماصة باستور البولندية لزيادة خفض حجم الإكراميات. إضافة 1 مل من آخر حل سحن إلى أنبوب يحتوي على الخلايا المتبقية undissociated، مواصلة سحن (حوالي 10 مرات صعودا وهبوطا)، ونقل محتويات بأكمله إلى 15 مل أنبوب containin المخروطيةز فصل الخلايا من قبل. أجهزة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 7 دقائق. تجاهل طاف، اعادة تعليق الخلايا مكعبات في 50 مل من المتوسط neurobasal، تحميل إلى غرفة الفرز والعد الخلايا.
الكسب غير المشروع وصفت الرقم المطلوب من الخلايا في SVZ باستخدام الإجراء أدناه.
التجسيمي حقن الفيروس والتطعيم من الخلايا فصل
- تعقيم جميع الأدوات باستخدام معقم حبة قبل البدء في الجراحة.
- لحقن التجسيمي، استخدم micropipettes الزجاج مع نصائح رقيقة جدا (1-2 ميكرون) للحد من تلف في الدماغ. لجعل ماصة، وسحب كوب الشعرية مع مجتذب ماصة. الردم ماصة مع زيت البارافين حتى الشبع نصف، وأدخل الغواص من حاقن نانولتر (أدوات دقيقة العالمي) في نهاية غير المعالجة من ماصة.
- باستخدام وحدة تحكم حاقن نانولتر، فرض أسفل النفط مع المكبس حتى DRO الصغيرةف من زيت البارافين يقذف من طرف رقيقة. تخفيض ماصة في وعاء معقم مع 0،5-1 ميكرولتر من محلول يحتوي على جسيمات فيروسية إما (1x10 1x10 6 8 TU / مل) أو الخلايا SVZ فصلها. استخدم الدالة سحب من حاقن نانولتر لملء ماصة مع الحل المنشود. تأكد من عدم وجود فقاعات هواء داخل ماصة.
- تخدير اثنين إلى C57BL الكبار ثلاثة أشهر من العمر / 6 مع الماوس حقنة داخل الصفاق من الكيتامين / زيلازين. استخدام الحلاقة الكهربائية لحلاقة الموقع الجراحية على الرأس. تنظيف بشكل جيد مع الشاش المبللة لإزالة أي الشعر ملتصقة.
- ضع الماوس على إطار التجسيمي وإصلاح الرأس. غسل موضع الحقن خالية من الشعر بالصابون المطهر (Hibitane) ثم مع الكحول 70٪ (الشاش أو رذاذ). تطهير الموقع مع Proviodine (الشاش أو رذاذ) وتغطية الحيوان مع حقل الجراحية.
- إجراء شق صغير في الجلد تعقيمها من الفأرة، ونشر بعناية الجلد لفضحالجمجمة الأساسية. يجف سطح الجمجمة. استخدام bregma وخط الوسط كما إحداثيات صفر لتعيين anterio الخلفي (AP) وميديو الجانبية-(ML) إحداثيات التجسيمي، على التوالي.
- حفر ثقب صغير في الجمجمة فوق كل نصف الكرة عند الإحداثيات المناسبة. تجنب إتلاف أنسجة المخ الأساسية. حفر بعناية حتى يتم اختراق عظم فقط. تنظيف الحفرة وتعيين إحداثيات صفر لإحداثيات (DV) بطني ظهراني التجسيمي على سطح الدماغ. نستخدم بعد تنسيق (مم) لحقن في SVZ أو RMS من البالغين (22-24 ز) C57BL / الفئران 6: لSVZ: AP 0.70، 1.20 و ML DV 1.90، لRMS: AP 2.55، 0.82 ML وDV 3.15.
- إدراج ببطء غيض micropipette الزجاج في الدماغ باستخدام إحداثيات المناسبة DV كمرشدين، وحقن ببطء كمية صغيرة (ونحن حقن 100-500 NL في 5 NL / ثانية) من التعليق الخلية (فصلها عن SVZ من الفئران مراسل) أو محلول يحتوي على جسيمات فيروسية. نستخدم عادةlentiviral أو فيروسات جزيئات 1x10 1x10 6 8 TU / مل.
- سحب ببطء micropipette الزجاج وخياطة الجلد فوق الجمجمة، ووضع الماوس على وسادة التدفئة لسرعة الانتعاش. عندما يستيقظ الماوس بعد الجراحة، وهو مسكن إدارة (ketaprofen 10 مغ / كغ، SC، 1 حقن في اليوم خلال 3 أيام بعد العملية).
2. إعداد شرائح الحاد
- يطلب من الحلول التالية لتحضير شرائح الحادة: أ) الاصطناعي السائل الدماغي الشوكي (ACSF) السكروز على أساس حل، يشار إليها فيما بعد حل عدة قطاعات، حيث يتم استبدال كلوريد الصوديوم بواسطة السكروز استثارة الخلايا العصبية لتخفيف زادت خلال شريحة الإجراء الإعداد، وب) تحتوي على كلوريد الصوديوم تحسنت ACSF، إلى 32 درجة مئوية في حمام مائي فيه ونقل شرائح وحافظت حتى التصوير.
- الحلول يحتوي على ما يلي (مم): حل القطع: 210،3 السكروز، 3 KCI، 1.3 MgCI 2 x6H 2 O، 2 البي 2 2 O 26 NaHCO 3، 1،25 ناه 2 PO 4 و 20 الجلوكوز؛ ACSF: 125 كلوريد الصوديوم، 3 KCI، 1.3 MgCI 2 x6H 2 O، 2 البي 2 x2H 2 O، 26 NaHCO 3، 1،25 ناه 2 PO 4، 20 الجلوكوز. الحفاظ على درجة الحموضة في حلول من 7،3-7،4، والأوكسجين بشكل مستمر من قبل محتدما لهم 95٪ O 2/5٪ CO 2.
- تخدير الماوس مع الإدارة داخل الصفاق من الكيتامين / زيلازين. إعداد الجليد الباردة حل القطع مع ظهور هلام مثل استخدام النتروجين السائل. يروي الماوس intracardiacaly مع هذا الحل باستخدام حقنة 20-سم مكعب.
- يجب أن يتم تنفيذ هذا الإجراء بسرعة، عادة 1-2 دقيقة لمدة 20 مل من محلول. إذا كانت الأوعية الدموية تحتاج إلى أن يكون المسمى، بدلا من perfusing مع الحل القطع، وضخ 200 ميكرولتر من transcardiacally دكستران تكساس الأحمر (10 ملغ / مل) إلى البطين الأيسر من القلب والانتظار 2-3 دقائق قبل قطع رأس الماوس.
- قطع رأس م[أوس]، وتزج بسرعة الرأس في الجليد الباردة حل القطع. استخدم المقص لإزالة فروة الرأس، وقطع الجمجمة الخلفي من المحور الأمامي إلى طول الخيط منتصف sagital من المخيخ إلى OB. إزالة بلطف باستخدام ملقط اللوحات الجمجمة.
- استئصال جزء من الدماغ الذيلية باستخدام مشرط. قطع الدماغ على طول الشق intrahemispheric، وجعل اثنين تخفيضات السهمي من جانب معظم الأطراف كل نصف الكرة (الشكل 1A). إزالة بلطف الدماغ باستخدام ملعقة، ووضعه في حل الجليد القطع الباردة.
- وضع نصفي الكرة الأرضية بشكل منفصل على كتلة أجار 4٪ مع الجانب الظهري لمس أجار، والغراء كتلة مع نصفي الكرة الأرضية إلى منصة لvibratome. الغراء وقطع أفقيا الجانب من نصف الكرة إلى منصة، وحفظ الجانب الإنسي مواجهة (1B الشكل). وضع منصة في قاعة للvibratome وملء مع قطع الحل. الحفاظ على حل المؤكسج في جميع أنحاء سليم بإعداد محتدما مع O٪ 95 2/5٪ CO 2.
- إعداد 250 ميكرون سميكة أقسام باستخدام vibratome. نستخدم HM 650 V ميكرومولار vibratome (الحرارية العلمية) وقطع شرائح على تردد 100 هرتز وسرعة من 1 ملم / ثانية. وينبغي استخدام سرعة القطع المنخفضة والعالية التردد الاهتزاز للحصول على شفرة أقسام ذات جودة عالية. حالما يتم الافراج عن شريحة من النصل، وإزالة بلطف من حل عدة قطاعات ووضعه في غرفة مليئة الحضانة ACSF الاوكسيجين الحفاظ على 32 درجة مئوية في حمام مائي (الشكل 1C).
يجب أن يتم تنفيذ هذا الإجراء في أسرع وقت ممكن لضمان أفضل نوعية شرائح.
3. الوقت الفاصل بين التصوير للهجرة أرومة عصبية
يجب أن يتم تنفيذ التصوير من neuroblasts المهاجرة خلال 6-8 ساعة من إعداد شرائح وأيام 3-10 بعد وضع العلامات neuroblasts. لتجنب التغييرات في المعلمات الهجرةبسبب الحقن التي قد تحفز التجسيمي تلف في الدماغ الدبقية وتفعيل استخدام الزجاج microelectrodes رقيقة ذات الرؤوس (1-2 ميكرون) للحد من تلف في الدماغ، وتنفيذ أعمال التصوير في المناطق البعيدة من موقع الحقن (أي في صورة التالية RMS الحقن في SVZ أو في RMS من البصلة الشمية بعد الحقن في RMS). على الرغم من إمكانية إجراء التصوير تصل إلى 21 يوما بعد حقن جزيئات lentiviral في SVZ، نوصي أقصر فترة ما بعد الحقن (3-10 يوما) لأنه يتيح تصور وتتبع أكثر من الخلايا في مجال الرؤية.
استخدمنا اسعة المجال الفلورسنت المجهر BX61WI آلية (أوليمبوس) مجهزة الكاميرا CCD (CoolSnapHQ2، Photometrics) والغمر بالماء 40X موضوعية مع فتحة 0،8 العددية (أوليمبوس). تتمثل الأهداف مع ارتفاع NA توفير صور أفضل قرار. ومتحمس neuroblasts المسمى (المطعمة إما من مراسل الماوس المانحة أو المسمى فيروسي)مع امدا DG-4 مجهزة مصباح الزينون 175 W (سوتر الآلات) ل30-100 ميللي ثانية في اكتساب Z. يمكن أن تكون متعددة الطول الموجي التصوير يقوم أيضا باستخدام مجموعات التصفية المناسب (صفاء) لتتبع هجرة الخلايا العصبية على طول العناصر الخلوية الأخرى من RMS، مثل الخلايا النجمية fluorescently المسمى أو الأوعية الدموية. وتسيطر المجهر، وكاميرا CCD و4-DG بواسطة برنامج MetaMorph (جهاز الجزيئية) التي سمحت ليتم تعيين معلمات مختلفة من برنامج اكتساب الوقت الفاصل بين (انظر أدناه). تم نقل شرائح إلى سلسلة PH1 20 غرفة هادئة جدا التصوير (هارفارد جهاز) مبنية على المجهر. تم توصيل الدائرة إلى نظام التدفئة التلقائي (TC-344B، جهاز هارفارد) وكان perfused باستمرار مع ACSF الاوكسيجين (1D الشكل). والحفاظ على درجة الحرارة في مقصورة في 31-33 درجة مئوية، ومعدل التدفق من ACSF كان 1-2 مل لكل دقيقة.
- بعناية وضع شريحة في غرفة التصوير من المجهر. إلىتجنب الانجراف من خلال شريحة التصوير، وتثبيت ذلك عن طريق وضع شبكة من النايلون بعناية (وارنر الصكوك) على أعلى من شريحة. عيون هو 0،12 مم نطاق وفتحات 0،3 حتي 1،13 ملم. وضع شبكة بحيث لا تعيق مجال التصوير (1D الشكل). استخدام الهدف 10X لإيجاد مجال الاهتمام، والمشاركة بعد ذلك الهدف 40X وضبط التركيز.
- تأكد من أن يتم perfused باستمرار مع شريحة ACSF وأنه لا يوجد حل كافية بين الهدف وشريحة و. تغييرات في معدل نضح ACSF، نضح غير النظامية، أو تغيرات درجة الحرارة يسبب الانجراف جذرية وتغييرات في المستوى البؤري أثناء التصوير.
- تعيين المعلمات اكتساب الوقت الفاصل بين (أي مدة الإثارة، وعدد من الطائرات Z، المسافة بين كل Z-القسم، الفاصل الزمني، ومدة التسجيل) باستخدام برنامج MetaMorph التي تسيطر على النظام اقتناء وبدء الوقت يسقط الاستحواذ. دايتم حفظ تلقائيا من قبل تا MetaMorph باعتبارها ملفات TIFF مع كل ملف المقابلة لنقطة واحدة من الوقت الفيديو في الوقت الفاصل بين المكتسبة.
- أداء التصوير لساعة على الأقل 1-2 وتأخذ في الاعتبار مراحل الهجرة التي تقطعها مرحلتين ثابتة. لا يمكن أن يؤديها في التصوير لمدة تصل إلى 4 ساعات (ونحن لم يؤدوا دورات التصوير استمرت أكثر من 4 ساعات) بدون أي تعديلات في خصائص الهجرة من neuroblasts. لا تفعل الخلايا صورة على سطح شريحة. ونحن عادة صورة على عمق من 20 إلى 100 ميكرون. نوصي باستخدام فترات قصيرة اكتساب (15 - 30 ثانية) لتحديد بداية وموثوق نهاية ثابتة ومراحل الهجرة.
- لتقييم مشاركة من العوامل الجزيئية المحددة في الهجرة من السلائف الخلايا العصبية، ويمكن أن تكون بديلا ACSF طبيعية مع ACSF تحتوي على أي وكيل المطلوب الدوائية (أي منبهات مختلفة، الخصوم، حاصرات، عوامل النمو، وما إلى ذلك). أداء التصوير على الأقل1 ساعة في حالة التحكم و من ثم ل1 ساعة في وجود وكيل الدوائية.
4. تحليل الهجرة أرومة عصبية
نستخدم Imaris البرمجيات (Bitplane) لتحليل البيانات. وهذا يسمح لنا لتتبع تلقائيا الوليد الهجرة الخلية في 3D. حزمة Imaris 7.0F1 يتضمن MeasurementsPro، تتبع Imaris، ImarisColoc، ImarisXT، الراسم الشعيرة، وحدات InPress.
- لفتح الفيلم في Imaris، تحميل الصور المكتسب (ملفات TIFF) ببساطة عن طريق سحب وإسقاط صورة نقطة أول مرة من شريط الفيديو على أيقونة البرنامج.
- حالما يتم تحميل الفيلم، وضبط السطوع والتباين للإشارة في عرض نافذة التعديل، وتعيين معلمات من الفيديو المكتسب (حجم فوكسل والفاصل الزمني) في خصائص الصورة وتعيين مسافة واحدة مرة نقاط يندوز (الشكل 4A) . بعد تحديد حجم فوكسل، فمن الممكن أن نرى الإطار في 3D، فضلا عن الوقت وحجمالفيديو.
- لتعقب الخلايا تلقائيا المسجلة، وخلق بقعة لكل خلية في الميدان في إطار فق عن طريق اختيار وظيفة البقع. اتبع الخطوات، وتعيين المعلمات على أساس الكائنات المصورة (الشكل 4B). إحدى المعلمات هو قطر للخلية التي يمكن قياسها في إطار شريحة.
- تفقد الثقة في الكائنات المكتشفة مع مرور الوقت. إذا لم يتم ترحيل كافة الخلايا الكشف عن تلقائيا، قم بتغيير عتبة الكشف (الشكل 4B)، وتأكد من أنه تم تحديد كافة الخلايا مع بقع في جميع نقاط الوقت.
- خلال التتبع التلقائي، إذا كائنين من النقاط المجاورة الوقت لديك أي تداخل بين حدودها / الحواف، سيتم إجراء اتصال المسار لكل التداخل. المسافة القصوى والحد الأقصى لحجم الفجوة (الشكل 4C) بين مركزين تمثل نقاط زمنية المجاورة نفس المسار يجب أن تكون محددة بحيث يمكن للبرنامج توصيل بوين الوقتTS. يتم تحديد المسافة القصوى التي كتبها المسافة بين الكائن نفسه في وقت لاحق نقاط.
- مرة واحدة مصنوعة المسارات، فمن الممكن لتصفية المسارات وإزالة المسارات غير ذي صلة عن طريق حذف ببساطة (الشكل 4C). يمكن تصحيح المسارات من خلال ربط وفصل مسارات مختلفة ونقاط زمنية مختلفة من نفس المسار (4C الشكل).
- مرة واحدة تم إجراء التصحيحات جميع، وإلقاء نظرة النهائي في المسارات وتصدير البيانات (الخلية التشرد في نقطة زمنية، طول المسار، طول تشرد، ومدة الأغنية الخ) في ملف إكسل (الشكل 4D).
5. ممثل النتائج
نحن اختبار واسعة المجال الأمثل الوقت الفاصل بين التصوير للهجرة أرومة عصبية. الفيروسية وصفها أو تطعيم neuroblasts fluorescently المسمى في SVZ يسمح للتعبير GFP قوية في الخلايا المهاجرة (الشكل 2). يمكن متعددة الطول الموجي التصوير بتطبيق البريد لتصور الهجرة أرومة عصبية على طول العناصر الخلوية الأخرى من RMS مثل الأوعية الدموية ديكستران TexasRed مملوءة 4 (الشكل 3 والفيلم 1)، النجمية fluorescently المسمى عن طريق الحقن التجسيمي من الفيروسات مع المروج الخلية الدبقية محددة (الشكل 2B) 12، أو المسمى تحديدا الخلايا النجمية في الحيوانات المعدلة وراثيا.
كشفت واسعة المجال الفيديو التصوير الهجرة أرومة عصبية حادة في سلوك شرائح قفزي من السلائف الخلايا العصبية المهاجرة تتكون من مرحلتين متميزتين: تشريد جسم الخلية العصبية تجاه عملية رائدة مفصولة الطور الثابت (الشكل 3، أفلام 1 و 2) . هو موثوق تحديد مدة الأطوار الثابتة والمهاجرة وغيرها من المعلمات لجني الهجرة الخلية مثل معدل النزوح (محسوبة فقط خلال مراحل الهجرة)، قام التصوير في 3D باستخدام فاصل زمني قصير اقتناء (مرة واحدة بنسبة 15 أو 30 ثانية). تحديد دقيق لفترات من مراحل ثابتة والهجرة أمر حاسم لا لبس فيه لتفسير البيانات. على سبيل المثال، يمكن أن يتسبب الاختلاف في المسافة من الهجرة خلال فترة زمنية معينة إما عن طريق تغييرات في معدل هجرة أو التعديلات في مدة أو تواتر الهجرة ومراحل ثابتة. لا يمكن هذه الاحتمالات المختلفة يمكن تمييزها باستخدام فترات طويلة الاستحواذ.
تم استخدام برنامج لتحليل Imaris هجرة neuroblasts في 3D ومعلمات إضافية لاستخلاص الهجرة الخلية مثل المسار وطول مدة المسار، فضلا عن تشريد طول المسار، وهو متجه التشرد. ويمكن للاستقامة المسار المحسوب أيضا بتقسيم طول المسار من المسار طول التشرد وهذا يشير الى والاستقامة من الطريق المهاجرة من أرومة عصبية الفردية.
/ 4061/4061fig1.jpg "/>
الشكل 1. التخطيطي تمثيل إعداد شرائح الحية الحادة. تمثيل) تخطيطي واحد الذيلية intrahemispheric واحد، واثنين من التخفيضات السهمي. B) تمثيل تخطيطي لوضع الماوس على الدماغ كتلة أجار ومنصة للvibratome. C) التمثيل التخطيطي الحاد شريحة غرفة الحضانة. D) تمثيل تخطيطي للغرفة مبنية على التصوير المجهر تستقيم.
الشكل 2. وضع العلامات من neuroblasts في RMS. A) صورة تظهر العلامات تضخم منخفضة قوية من neuroblasts والأوعية الدموية في RMS الكبار. تم حقن الفيروس الارتجاعي A GFP الترميز في SVZ، وتم الكشف عن الخلايا GFP، معربا عن (الأخضر) في RMS بعد 3 أيام (اللوحة اليمنى). وصفت الأوعية الدموية عن طريق حقن ديكستران TexasRed في قلب من الفأرة (أحمر، اللوحة اليمنى). وأقحم يظهر ماجنيفيك عاليةصورة أوجه الأوعية الدموية وصفت neuroblasts فيروسي المرتبطة الأوعية الدموية. B) وصفها من العناصر الخلوية المختلفة في RMS الكبار. وصفت وNeuroblasts عن طريق حقن mCherry ترميز الفيروسة البطيئة في SVZ (الحمراء)، وصفت الخلايا النجمية عن طريق حقن GFP الترميز الفيروسة البطيئة تحت سيطرة المروج GFAP في RMS (الأخضر)، وصفت والأوعية الدموية عن طريق حقن دكستران CascadeBlue (الأزرق ) في القلب. C) التمثيل التخطيطي للحقن الخلايا GFP-GAD67 فصلها عن SVZ على فأرة الحاسوب GAD67-GFP في SVZ من الماوس من النوع البري الكبار. D) زرع الخلايا GFP-GAD67 (الأخضر) في الكشف عن 7 أيام بعد التطعيم RMS في SVZ. وimmunostained وRMS مع GFAP (الأزرق). E) زرع الخلايا GFP-GAD67 (الأخضر) كانت immunopositive لDCX (أحمر)، ولكن كانت لimmunonegative GFAP (الأزرق). اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر الرقم.
الشكل 3. الوقت الفاصل بين التصوير من neuroblasts. الوقت الفاصل بين التصوير من أرومة عصبية (الأخضر) إلى جانب الهجرة الأوعية الدموية (الحمراء). وتبين الأسهم مراحل الهجرة من neuroblasts، ورؤوس سهام تشير إلى مراحل ثابتة.
الشكل 4. تحليل الهجرة أرومة عصبية. (AD) خطوات مختلفة لتحليل الهجرة neuroblasts. الدوائر الحمراء تشير إلى وظائف مختلفة المذكورة في النص. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
TexasRed الفيديو 1. الوقت الفاصل بين التصوير من neuroblasts المسمى فيروسي (الأخضر) على طول المهاجرة ديكستران الأوعية الدموية المسمى (الحمراء). Cلعق هنا لمشاهدة الفيديو.
فيديو 2. تتبع هجرة أرومة عصبية من قبل البرامج Imaris. النقاط الخضراء تشير إلى أجسام الخلايا والمسارات تشير إلى المسافة للهجرة. اضغط هنا لمشاهدة الفيديو .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
استهداف الصحيح السلائف الخلايا العصبية إلى مناطق الدماغ المناسب هو عملية الأساسية التي تقوم عليها الجمعية السليم وظيفة الدارات العصبية. الغالبية العظمى من الخلايا تهاجر أثناء التطور الجنيني وبعد الولادة في الدماغ إلا في مناطق قليلة، مثل التلفيف، OB المسنن والمخيخ، وتشريد العصبية لا يزال يأخذ مكان. آليات تدبير الهجرة الخلايا في الدماغ بعد الولادة تبقى، مع ذلك، غير مفهومة. ومعرفة الآليات والمسارات الجزيئية المشاركة في توجيه الهجرة الخلية في الأنسجة العصبية الناضجة تحسين فهمنا لاستهداف الخلايا العصبية في الدماغ بعد الولادة، وربما تكون ذات صلة السريرية لتطوير استراتيجيات جديدة للحث على توظيف الخلايا العصبية في المناطق المريضة من الدماغ.
في هذا المخطوط، ونحن تصف بروتوكول للهجرة الخلية الرصد في شرائح الدماغ الأمامي الحاد للماوس الكبار. بينما استخدمنا الكبار SVZ-OBالمسار كنظام نموذج، يمكن تطبيق نفس الأسلوب لمتابعة الهجرة خلية في المخ وبعد الولادة الجنينية المبكرة وكذلك في إصابات الدماغ الكبار بعد. استخدمنا هذا البروتوكول لمتابعة الهجرة الخلية في وقت مبكر بعد الولادة وRMS 12، المخيخ والمخ الكبار بعد المخطط (Eiriz، الصف، مالفا وSaghatelyan، بيانات غير منشورة).
تم إجراء التصوير للهجرة أرومة عصبية حادة باستخدام شرائح الحية التي تسمح درس الهجرة خلية في المكروية الذي يحاكي بشكل وثيق في ظروف الجسم الحي. وتصور الخلايا المهاجرة إما عن طريق الحقن التجسيمي من الجسيمات الفيروسية أو عن طريق التطعيم neuroblasts من الفئران مراسل في SVZ من البرية من نوع الفئران. تم إجراء تحليل الهجرة بعيدا عن موقع الحقن. لدراسة الهجرة عرضية في RMS، مستعدون شرائح الحادة 3-5 أيام بعد أن وصفت neuroblasts. لدراسة الهجرة شعاعي في OB، تم إعداد شرائح 7-10 أيام بعد الظريفreotaxic الحقن في SVZ. الفيروسية التي تستهدف السلائف الخلايا العصبية في البالغين يمكن SVZ تستخدم أيضا لدراسة وتعدل العوامل التي تدخل في عملية الهجرة من upregulating أو downregulating العظة الجزيئي محددة. ومن الممكن أيضا لتسمية أنواع مختلفة من الخلايا في RMS وأداء متعدد الطول الموجي التصوير لكشف نمط الهجرة neuroblasts على طول الأوعية الدموية مليئة التتبع 4، 13 أو فيروسي أو الخلايا النجمية على طول وراثيا المسمى 2 و 12.
للهجرة أرومة عصبية الصورة استخدمنا المجهر تستقيم مضان الآلية مجهزة الكاميرا CCD التي سمحت الاستحواذ على الطائرات السريعة نسبيا Z مختلفة بعد نبضات قصيرة (30-100msec) الضوء الإثارة. منعت هذه photobleaching وانخفض الفاصل الزمني بين عمليتي استحواذ اللاحقة دون التدخل في التصور 3D الهجرة أرومة عصبية. وقد استخدمت جماعات أخرى المجاهر مبائر أو اثنين الفوتون لرصد الخلايا migrأوجه في RMS بعد الولادة 14-16. كل التقنيات لديها مزايا والقيود، التي تتعلق أساسا بقضايا قرارات الزمانية والمكانية. نوصي باستخدام فترات قصيرة (15-30 ثانية) بين الاستحواذ على التوالي. الخلايا العصبية لديهم سلوك الأطفال حديثي الولادة قفزي، وتوقف الهجرة من مراحل فترات ثابتة التي يمكن أن تكون قصيرة بقدر 4-10 دقيقة 4. ونظرا لهذا النوع من الهجرة، فمن المهم استخدام فترات اكتساب سريع نسبيا (15-30 ثانية) بين نقاط متتالية لتحديد الوقت موثوق بداية ونهاية مراحل الهجرة وثابتة. هذا أمر يصعب تحقيقه عندما الفاصل الزمني بين عمليتي استحواذ على التوالي في نطاق من عدة دقائق. مطلوب التحديد الدقيق للمراحل ثابتة والهجرة لتعريف لا لبس فيه سرعة الهجرة أرومة عصبية، والتي ينبغي أن يكون كميا فقط خلال مراحل الهجرة 4، 17. فترات طويلة اقتناء يسمح لحساب averagسافر السرعة والمسافة ه على مدى فترة معينة من الزمن يتضمن أيضا مراحل ثابتة. التغيرات في معدل السرعة التي يحددها هذا الأسلوب، ومع ذلك، يمكن أن يكون سبب إما عن طريق الاختلافات في معدل الهجرة (المعرفة فقط خلال مراحل الهجرة) أو عن طريق مدة ثابتة ومراحل الهجرة. هذه الاختلافات في اكتساب المعلمات من المحتمل أن تكمن وراء التباين في سرعات الهجرة neuroblasts ذكرت من قبل مجموعات مختلفة. قبل تنفيذ عمليات الاستحواذ السريع مع فاصل زمني 15-30 ثانية وتحديد معدل الهجرة بشكل حصري خلال مراحل الهجرة، حسبنا بسرعة 120-150 ميكرون من الهجرة / ساعة 4 و 12، في حين مجموعات أخرى، الذين يستخدمون فاصل زمني اكتساب أفادت 3-7 دقيقة بسرعة من 50-100 ميكرون / ساعة 14 و 15 و 18. والعيب الرئيسي لحقل التصوير واسعة مع كاميرات CCD الفلورسنت هو أنه يوفر القرار المكانية أقل من أنظمة المسح الضوئي. ومع ذلك، منذ neuroblasts المهاجرة لديها morp المدمجةhology مع سوما والعمليات المؤدية قصيرة، دقة أقل المكاني لا يمنع تحديد وتتبع موثوق neuroblasts على مستوى الهيئات والعمليات المؤدية الخلية حتى (الشكل 3 وملفات الفيديو 1 و 2).
تقنية وصفنا هنا يسمح الهجرة أرومة عصبية في المكروية عن كثب في ظروف محاكاة الجسم الحي لتحليلها، إلى دراسة التفاعلات بين المكونات المختلفة للRMS، ويتم التحقيق أدوار هذه التفاعلات في الهجرة أرومة عصبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الكندية منحة الصحة (CIHR) بحوث لASJK كان مدعوما جزئيا زمالة جامعة لافال. وكما هو حاصل على كرسي أبحاث كندا في تكوين الخلايا العصبية بعد الولادة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Glucose (ACSF) | EMD | DX0145-3 | |
| NaCI | Sigma | S9625 | |
| KCI | Sigma | P9541 | |
| MgCI2x6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| NaH2PO4xH2O | EMD | SX0710-1 | |
| CaCI2x2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| Dextran TexasRed | Invitrogen | D1864 | |
| Dextran CascadeBlue | Invitrogen | D1976 | |
| Glucose (40X solution) | Sigma | G8769 | |
| Sodium pyruvat | Gibco | 11360-070 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| HBSS | Gibco | 14170-112 | |
| DNase I | Sigma | D-5025 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| BSA | EMD | 2930 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | |
| Ketamine/Xylazine | CDMV | 5230 | |
| Pasteur pipette | VWR | 14672-380 | |
| 15 ml conical tube | Sarstedt | 62.553.205 | |
| 50 ml conical tube | Sarstedt | 62.547.205 | |
| Glass capillaries (stereotaxic injection) | WPI | 4878 | |
| Paraffin oil | EMD | PX0045-3 | |
| Proviodine | Rougier | 65655-1370 | |
| Suture | Stoelting | 50487 | |
| Anafen | CDMV | 11508 | |
| 20 cc Syringe | VWR | SS-20L2 | |
| Petri dish | VWR | 25384-094 | |
| Agar | Laboratoire Mat | AP-0108 | |
| Glue | Permabond | 910 | |
| 95% O2/5% CO2 | Linde | 24068835 | |
| Blade | WPI | 501901 | |
| Nylon mesh | Warner Instruments | 64-0198 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 000.019 | |
| Pipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Nanoliter injector | WPI | B203MC4 | |
| Stereotaxic injection apparatus | WPI | 502900 | |
| Micro drill system | WPI | 501819 | |
| Vibratome | Thermo Scientific | 920110 | |
| Wide-field fluorescent microscope | Olympus | BX61WIF | |
| CCD camera | Photometrics | CS-HQ2-D | |
| Ultra-quiet imaging chamber | Harvard Apparatus | 64-1487 | |
| PH-1 Series 20 heater platform | Harvard Apparatus | 64-0284 | |
| Heating system | Warner Instruments | TC-344B | |
| 40X water immersion objective | Olympus | 1-UM587 | |
| 10X water immersion objective | Olympus | 1-UM583 | |
| Lambda DG-4 | Sutter Instruments | DG-4/OF | |
| MetaMorph software | Molecular Devices | 40000 | |
| Imaris software | Bitplane | BPI-IM70-F1 |
References
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu. Rev. Neurosci. 32, 149-184 (2009).
- Kaneko, N. New neurons clear the path of astrocytic processes for their rapid migration in the adult brain. Neuron. 67, 213-223 (2010).
- Lois, C., Alvarez-Buylla, A. Long-distance neuronal migration in the adult mammalian brain. Science. 264, 1145-1148 (1994).
- Snapyan, M. Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling. J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).
- Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. Blood vessels form a migratory scaffold in the rostral migratory stream. J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).
- Lledo, P. M., Saghatelyan, A. Integrating new neurons into the adult olfactory bulb: joining the network, life-death decisions, and the effects of sensory experience. Trends Neurosci. 28, 248-254 (2005).
- Bolteus, A. J., Bordey, A. GABA release and uptake regulate neuronal precursor migration in the postnatal subventricular zone. J. Neurosci. 24, 7623-7631 (2004).
- Martini, F. J., Valdeolmillos, M. Actomyosin contraction at the cell rear drives nuclear translocation in migrating cortical interneurons. J. Neurosci. 30, 8660-8670 (2010).
- Murase, S., Horwitz, A. F. Deleted in colorectal carcinoma and differentially expressed integrins mediate the directional migration of neural precursors in the rostral migratory stream. J. Neurosci. 22, 3568-3579 (2002).
- Wilcock, A. C., Swedlow, J. R., Storey, K. G. Mitotic spindle orientation distinguishes stem cell and terminal modes of neuron production in the early spinal cord. Development. 134, 1943-1954 (2007).
- Ono, M., Yanagawa, Y., Koyano, K. GABAergic neurons in inferior colliculus of the GAD67-GFP knock-in mouse: electrophysiological and morphological properties. Neurosci. Res. 51, 475-492 (2005).
- Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Astrocytes Control the Development of the Migration-Promoting Vasculature Scaffold in the Postnatal Brain via VEGF Signaling. J. Neurosci. 32, 1687-1704 (2012).
- Bovetti, S. Blood vessels form a scaffold for neuroblast migration in the adult olfactory bulb. J. Neurosci. 27, 5976-5980 (2007).
- Platel, J. C., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in whole-mounts of the subventricular zone. J. Physiol. 586, 3783-3793 (2008).
- Nam, S. C. Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study. J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).
- Kim, Y., Comte, I., Szabo, G., Hockberger, P., Szele, F. G. Adult mouse subventricular zone stem and progenitor cells are sessile and epidermal growth factor receptor negatively regulates neuroblast migration. PLoS One. 4, e8122 (2009).
- Bortone, D., Polleux, F. KCC2 expression promotes the termination of cortical interneuron migration in a voltage-sensitive calcium-dependent manner. Neuron. 62, 53-71 (2009).
- Comte, I. Galectin-3 maintains cell motility from the subventricular zone to the olfactory bulb. J. Cell Sci. 124, 2438-2447 (2011).
