Summary
Vi beskriver en protokol for real-time videoimaging af neuronal migration i mus forhjerne. Migrationen af viralt mærkede eller podes neuronale forstadier blev indspillet i akutte levende udsnit med bred felt fluorescerende billeddannelse med en relativt hurtig overtagelse interval for at studere de forskellige faser af cellemigration, herunder varigheden af den stationære og overgangsfaser og hastigheden af migration.
Abstract
Der er en betydelig mængde af beviser tyder på, at nye funktionelle neuroner konstitutivt genereres fra en endogen pulje af neurale stamceller i begrænsede områder af den voksne pattedyrs hjerne. Nyfødte neuroblaster fra subventricular zone (SVZ) vandrer langs rostral vandrende strøm (RMS) til deres endelige bestemmelsessted i lugtekolben (OB) 1. I RMS, migrere neuroblaster tangentialt i lænker ensheathed af astrocytiske processer 2,3 ved hjælp af blodkar som en strukturel støtte og en kilde til molekylære faktorer, der er nødvendige for migration 4,5. I OB, frigøre neuroblaster fra kæderne og migrere radialt ind i de forskellige bulbære lag, hvor de differentierer til interneuroner og integreres i det eksisterende net 1, 6.
I dette manuskript vi beskrive proceduren for overvågning af cellemigration i akutte skiver af gnaver hjernen. Anvendelsen af akutte skiver tillader assessment af cellemigrering i mikromiljøet, der nøje ligner til in vivo betingelser og i de områder af hjernen, der er vanskelige at få adgang til in vivo billeddannelse. Derudover undgår det lange dyrkning tilstand som i tilfælde af organotypiske og cellekulturer, der måtte ændre de migrationsegenskaber i cellerne. Neuronale prækursorer i akutte skiver kan visualiseres under anvendelse af DIC optik eller fluorescerende proteiner. Viral mærkning af neuronale prækursorer i SVZ, podning neuroblaster fra reporter-mus i SVZ af vildtype-mus, og anvendelse af transgene mus, der udtrykker fluorescerende protein i neuroblaster er alle egnede fremgangsmåder til visualisering af neuroblaster og efter deres vandring. Den senere metode er imidlertid ikke tillader individuelle celler, der skal spores i lange perioder på grund af den høje tæthed af mærkede celler. Vi anvendte en bred felt fluorescerende opretstående mikroskop udstyret med et CCD-kamera til at opnå en relativt hurtig opsamling interval (en image hver 15 eller 30 sekunder) til pålideligt identificere den stationære og vandrende faser. En præcis identifikation af varigheden af den stationære og vandrende faser er afgørende for entydig fortolkning af resultaterne. Vi har også foretaget flere z-trinvise overtagelser at overvåge neuroblaster migration i 3D. Wide-field fluorescerende billeddannelse har været brugt i udstrakt grad at visualisere neuronal migration 7-10. Her beskriver vi detaljeret protokol til mærkning neuroblaster, der udfører real-time video-imaging af neuroblast migration i akutte skiver af den voksne mus forhjerne, og analysere celle migration. Mens den beskrevne protokol eksemplificeret migrationen af neuroblaster i den voksne RMS, kan den også anvendes til at følge cellemigrering i embryoniske og tidlige postnatale hjerner.
Protocol
1. Mærkning Neuronale Precursors
Neuroblaster kan visualiseres ved anvendelse transgene mus, som selektivt udtrykker fluorescerende proteiner i neuroblaster (dvs. DCX-GFP, Gad67-GFP), ved stereotaksisk injektion af viruspartikler, der koder for fluorescerende proteiner i SVZ eller RMS, eller ved podning af neuronale prækursorer fra reporter-mus (dvs. , DCX-GFP, Gad67-GFP) i SVZ af vildtype-mus. Vi beskriver proceduren for podning og viral mærkning af neuronale prækursorer.
Dissociation af neuroblaster fra SVZ af reporter-mus
- Følgende løsninger er nødvendige for neuroblast dissociation.
40X løsning
10 ml Pen / Strept (Stock Pen 10.000 U / ml / Strept 1000 ug / ml)
10 ml Glucose (Stock 200 mg / ml)
20 ml natriumpyruvat (Stock 100 mM)
ove_content "> 10 ml H2OFremstille 1 ml aliquoter
Dissection opløsning (100 ml)
HBSS 1X - 97,4 ml
HEPES (1 M) - 0,1 ml
40X opløsning - 2,5 ml
DNase-opløsning (20K enheder / ml)
DNaseI, typeIV fra bovin pancreas
150.000 enheder opløses i 7,5 ml H2O
Filtreredes 0,22 um
Fremstille 1 ml aliquoter
Trypsin-DNaseI opløsning (10 ml)
HBSS - 8,6 ml
DNaseI (20K enheder / ml) - 0,15 ml
Trypsin-EDTA (0,5%) - 1 ml
40X opløsning - 0,25 ml
Triturering opløsning (50 ml)
ntent "> Neurobasal medium - 47,5 mlBSA (300 mg / ml) - 332,5 gl
40X opløsning - 1,25 ml
DNaseI (20K enheder / ml) - 0,66 ml
- Bedøve to til tre måneder gamle voksne mus udtrykker et fluorescerende protein i neuroblaster med en intraperitoneal injektion af 100 ul ketamin / xylazin (10 mg / 1 mg pr 10 g legemsvægt), derefter halshugge. Vi bruger GAD67-GFP-mus 11. Ved hjælp af skalpel, hjernen skive coronally på niveauet for den laterale ventrikel, og dissekere den SVZ i iskoldt dissektionsmedium. Anbring SVZ i et mikrocentrifugerør med 500 pi af trypsin-DNase opløsningen, og holde på is i 20 minutter.
- Overfør SVZ i et 15 ml konisk rør indeholdende 5 ml forvarmet (37 ° C) trypsin-DNase-opløsning og inkuber ved 37 ° C i en 5% CO2 i 30 minutter.
- Overfør hele indholdet i en 50 ml konisk rør indeholdende 15 ml TRITguration opløsning, og der centrifugeres ved 1.000 x g i 1 min. Aspirer supernatanten, tilsættes 10 ml triturering opløsning, overføres cellerne til en ny 15 ml konisk rør, og centrifugeres ved 1000 x g i 1 min.
- Fire-polere en Pasteur pipette for at reducere spidsen størrelse og pels med triturering medium. Efter centrifugering fjernes så meget af supernatanten som muligt, og der tilsættes 2 ml frisk triturering løsning på det konisk rør. Tritureres cellerne i trituration løsning (omkring 50 gange op og ned med Pasteur pipette). Tag den øverste halvdel af supernatanten, som indeholder godt dissocierede celler, og anbringes i en ny 15 ml konisk rør indeholdende 10 ml triturering opløsning.
- Fire-polish en Pasteur pipette at reducere yderligere spidsen størrelse. Tilføj yderligere 1 ml triturering løsning på røret indeholdende de tilbageværende udissocierede celler, fortsætte triturering (ca. 10 gange op og ned), og overfører hele indholdet til 15 ml koniske rør containing tidligere dissocierede celler. Centrifuger ved 1.000 x g i 7 min. Supernatanten fjernes, genopslæmmes pelleterede celler i 50 ml Neurobasal medium, belastning i et tællekammer, og tæl cellerne.
Graft det ønskede antal celler i SVZ anvendelse af proceduren beskrevet nedenfor.
Stereotaktisk injektion af viruset og podning af dissocierede celler
- Steriliser alle de instrumenter ved hjælp af en perle sterilisator, før du starter operationen.
- For stereotaktisk injektioner, bruge glas mikropipetter med meget tynde spidser (1-2 um) for at minimere hjerneskade. For at gøre en pipette, trække et glas kapillar med en pipette aftrækker. Opfyldning pipetten med paraffin olie indtil halv-fuld, og sæt stemplet af en nanoliter injektor (World Precision Instruments) i den ubehandlede ende af pipetten.
- Ved hjælp af en nanoliter injektor controller, olie nedad tvinge med stemplet, indtil en lille drop af paraffinolie ekstruderer fra den tynde spids. Sænke pipetten i en steril beholder med 0,5-1 ul af en opløsning indeholdende enten virale partikler (1x10 6-1x10 8 TU / ml) eller dissocierede SVZ celler. Brug trække funktion af nanoliter injektor til at fylde pipetten med den ønskede opløsning. Sørg for at der ikke er luftbobler inde i pipetten.
- Bedøve to til tre måneder gamle voksne C57BL / 6 mus med en intraperitoneal injektion af ketamin / xylazin. Brug en elektrisk barbermaskine til barbering operationsstedet på hovedet. Rens godt med våd gaze for at fjerne eventuelle vedhængende hår.
- Anbring musen på en stereotaktisk ramme og fastsætte hovedet. Vask hårfri injektionsstedet med desinficerende sæbe (Hibitane) og derefter med 70% alkohol (gaze eller spray). Desinficer stedet med Proviodine (gaze eller spray), og dække dyret med en kirurgisk felt.
- Lave et lille snit i den steriliserede huden af mus, og forsigtigt at huden for at blotlæggeden underliggende kraniet. Tørre overfladen af kraniet. Brug bregma og midterlinjen som nul-koordinater for at indstille anterio-posteriore (AP) og medio-laterale (ML) koordinater stereotaksisk hhv.
- Bore et lille hul i kraniet over hver halvkugle på et passende koordinater. Ikke at beskadige det underliggende hjernevæv. Bor forsigtigt, indtil kun knoglen er blevet misligholdt. Rens hullet og indstilles til nul koordinater for de dorso-ventrale (DV) stereotaksisk koordinater på overfladen af hjernen. Vi bruger følgende koordinater (i mm) for injektioner i SVZ eller RMS af voksne (22-24 g) C57BL / 6 mus: for SVZ: AP 0,70, ML 1,20 og DV 1,90, for RMS: AP 2,55, ML 0,82 og DV 3.15.
- Sæt langsomt glas mikropipettespids ind i hjernen ved hjælp af de relevante DV koordinater som guider, og langsomt indsprøjte en lille mængde (vi injicere 100-500 nl ved 5 nl / sek) cellesuspension (dissocieret fra SVZ af reporter mus) eller en opløsning indeholdende viruspartikler. Vi plejer at brugelentiviral eller retrovirale partikler 1x10 6-1x10 8 TU / ml.
- Langsomt trække glasmikropipette, sutur huden over kraniet, og placere musen på en varmepude for hurtigere genopretning. Når musen vågner efter operationen, administrere en analgetisk (ketaprofen 10 mg / kg, SC, 1 injektion dagligt i 3 dage post-op).
2. Forberedelse Akutte Slices
- Følgende løsninger skal udarbejde akutte skiver: a) en kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) saccharose-baseret løsning, i det følgende benævnt skæring løsning, hvor NaCl erstattes af saccharose at dæmpe øget neuronal excitabilitet under skive forberedelse procedure, og b) ACSF indeholdende NaCl, opvarmet til 32 ° C i et vandbad, hvori skiverne overføres og opretholdes indtil billeddannelse.
- De løsninger indeholder følgende (i mM): opskæring løsning: 210,3 sucrose, 3 KCI, 1,3 MgCl2 x6H 2 O, 2 CACI 2 2 O 26 NaHCO 3, 1,25 NaH 2 PO 4, 20 glucose, ACSF: 125 NaCl, 3 KCI, 1,3 MgCl2 x6H 2 O, 2 CACI 2 x2H 2 O, 26 NaHCO 3, 1,25 NaH 2 PO 4, 20 glucose. Opretholde opløsninger ved en pH på 7,3-7,4, og kontinuerligt oxygenat ved at boble dem med 95% O2 / 5% CO2.
- Bedøve mus med en intraperitoneal indgivelse af ketamin / xylazin. Forbered iskold skæring opløsning med en gelé-lignende udseende med flydende nitrogen. Perfundere musen intracardiacaly med denne opløsning under anvendelse af en 20-cc sprøjten.
- Denne procedure skal udføres hurtigt, sædvanligvis 1-2 min for 20 ml opløsning. Hvis blodkarrene skal mærkes, i stedet for perfusion med den skærende opløsning, injiceres transcardiacally 200 pi Dextran Texas Red (10 mg / ml) i den venstre ventrikel af hjertet, og Vent 2-3 min før skar hovedet af musen.
- Halshugge af mOuse, og hurtigt fordybe hovedet i iskold skæring løsning. Brug saks til at fjerne hovedbunden, og skære kraniet fra den bageste til forreste akse langs midten sagital sutur fra lillehjernen til OB. Fjern forsigtigt kranie flapper med pincet.
- Udskære caudale del af hjernen under anvendelse af en skalpel. Skær hjernen langs intrahemispheric revne og gøre to sagittale snit på den laterale del af hver halvkugle (figur 1A). Fjern forsigtigt hjernen ved hjælp af en spatel, og læg den i iskold skæring løsning.
- Anbring de to halvkugler separat på en 4% agar blokken med den dorsale side rørende agaren, og lim blokken med de to halvkugler til ladet af en vibratome. Lim den sideværts skære side af halvkugle til platformen, holde mediale side opad (figur 1B). Placer platformen i kammer vibratome og fyld den med skærende opløsning. Hold opløsningen iltet hele SLIce præparat ved at boble den med 95% O2 / 5% CO2.
- Forbered 250 um tykke sektioner ved hjælp af vibratome. Vi anvender en uM HM 650 V vibratome (Thermo Scientific) og skæres skiverne ved en frekvens på 100 Hz og en hastighed på 1 mm / sek. En lav skærehastighed og højfrekvens klinge vibration bør anvendes til at opnå en høj kvalitet sektioner. Så snart en skive frigives fra kniven forsigtigt fjerne den fra den skærende opløsningen og anbringes i en rugekammeret fyldt med oxygeneret ACSF holdt ved 32 ° C i et vandbad (figur 1C).
Denne procedure skal udføres så hurtigt som muligt for at sikre den bedste kvalitet skiver.
3. Time-lapse Imaging af neuroblast Migration
De billeddannende af migrerende neuroblaster bør udføres inden for 6-8 timer i forberedelsen af skiver og 3-10 dage efter neuroblaster mærkning. For at undgå ændringer i migration parametrepå grund af stereotaktisk injektion, som kan foranledige hjerneskade og glia aktivering brug spids glasmikroelektroder (1-2 um) for at minimere hjerneskade, og udfører billedbehandling i regionerne distale fra injektionsstedet (dvs. billede i RMS følgende injektion i SVZ eller i RMS af lugtekolben efter injektion i RMS). Selvom imaging kan udføres op til 21 dage efter injektion af lentivirale partikler i SVZ, anbefaler vi kortere efter injektion interval (3-10 dage), da det giver visualisere og spore flere celler pr synsfelt.
Vi anvendte en bred felt fluorescerende motoriseret BX61WI mikroskop (Olympus) udstyret med et CCD-kamera (CoolSnapHQ2, Photometrics) og en 40X nedsænkning i vand mål med et 0,8 numerisk åbning (Olympus). Målene med højere NA vil give bedre opløsning. Mærkede neuroblaster (podet enten fra en reporter donor mus eller viralt mærkede) var begejstredemed en Lambda DG-4 er udstyret med en 175 W xenon lampe (Sutter Instruments) for 30-100 msek per z købet. Multi-bølgelængde billeddannelse kan også udføres under anvendelse af passende filtersæt (Chroma) til at spore neuronal migration langs de andre cellulære elementer i RMS, såsom fluorescensmærkede astrocytter eller blodkar. Mikroskopet, CCD kamera og DG-4 blev kontrolleret af MetaMorph software (Molecular Device), som tillod de forskellige parametre for time-lapse erhvervelse program skal indstilles (se nedenfor). Skiverne blev overført til en PH1 Serie 20 ultra-quiet imaging kammer (Harvard Apparatus) bygget på mikroskopet. Kammeret blev forbundet til et automatisk varmesystem (TC-344B, Harvard Apparatus) og blev kontinuerligt perfunderet med oxygeneret ACSF (figur 1D). Temperaturen i kammeret blev holdt ved 31-33 ° C, og strømningshastigheden af ACSF var 1-2 ml pr.
- Læg forsigtigt skive i den billeddannende kammer af mikroskopet. Tilundgå at glide af skive under billeddannelse, stabilisere det ved omhyggeligt at placere en nylon mesh (Warner Instruments) oven på skive. Masken er 0,12 mm tyk, og åbningerne området fra 0,3 til 1,13 mm. Placer maske, så den ikke hindrer imaging felt (Figur 1D). Brug en 10X målsætning at finde et interesseområde, og derefter trække 40X mål og justere fokus.
- Sørg for, at udsnittet kontinuerligt perfunderes med ACSF og at der er nok løsning mellem målsætning og skive. Ændringer i antallet af ACSF perfusion, uregelmæssig perfusion, eller drastiske temperaturudsving forårsager drifting og ændringer i brændplanet under billedbehandling.
- Indstil time-lapse erhvervelse parametre (dvs. varighed af excitation, antallet af z-planer, afstanden mellem hver z-sektion, tidsinterval, og varigheden af optagelsen) ved hjælp af MetaMorph software, som styrer indfangningssystemet og start time- bortfalder erhvervelse. Data gemmes automatisk ved MetaMorph som en TIFF-filer med hver fil svarer til en gang punkt på den overtagne time-lapse video.
- Udfør billeddannelse i mindst 1-2 timer og tager hensyn til vandrende faser, som er afbrudt af to stationære faser. De billeddannende kan udføres i op til 4 timer (vi ikke udføre billedbehandling sessioner varer mere end 4 timer) uden ændringer i migrationen egenskaber neuroblaster. Må ikke billedet celler på overfladen af skiven. Vi normalt billede i en dybde på 20 til 100 um. Vi anbefaler at bruge korte erhvervelse intervaller (15 - 30 sek) for pålideligt at bestemme begyndelsen og slutningen af den stationære og overgangsfaser.
- At vurdere gelse af specifikke molekylære faktorer i migrationen af neuronale precursorer, kan den normale ACSF være substitueret med ACSF indeholdende helst ønsket farmakologisk middel (dvs. forskellige agonister,-antagonister blokkere, vækstfaktorer, osv.). Udføre billeddannelse i mindst1 time i kontrol tilstand og derefter i 1 time i nærvær af det farmakologiske middel.
4. Analyserer neuroblast Migration
Vi bruger Imaris software (Bitplane) til at analysere dataene. Dette giver os mulighed for automatisk at spore nyfødte cellemigration i 3D. Den Imaris 7.0F1 pakken inkluderer MeasurementsPro, Imaris Tracking, ImarisColoc, ImarisXT, Filament Tracer, og Inpress moduler.
- Hvis du vil åbne filmen i Imaris, indlæse de erhvervede (TIFF-filer) ved blot at trække og slippe billedet af det første tidspunkt af videoen på programikonet.
- Når filmen er indlæst, skal du justere lysstyrken og kontrasten af signalet i Display vinduet til justering, og indstille parametrene i den overtagne video (voxel størrelse og tidsinterval) i billedet egenskaber og sæt lige langt tid points vinduer (fig. 4A) . Efter at have angivet voxelstørrelse, er det muligt at ramme i 3D samt tidspunktet og omfanget afvideo.
- Hvis du automatisk spore indspillede celler, skal du oprette en stedet for hver celle i feltet i Overgå vinduet ved at vælge Spots funktionen. Følg trinene, og indstille parametre baseret på de afbildede objekter (figur 4B). En af faktorerne er diameteren af den celle, der kan måles i Slice vinduet.
- Undersøg pålideligheden af de fundne objekter over tid. Hvis alle migrerende celler ikke registreres automatisk, skal du ændre tærsklen for detektion (figur 4B), og sørg for, at alle celler er udvalgt med pletter på alle tidspunkter.
- Under automatisk sporing, hvis to objekter fra tilstødende tid-point har nogen overlapning mellem deres grænser / kanter vil et spor tilslutning ske for hver overlap. Den maksimale afstand og maksimal afstand størrelse (fig. 4C) mellem to punkter med tilstødende tidspunkter af samme spor skal være opfyldt, for at programmet kan forbinde den tid points. Den maksimale afstand er bestemt af afstanden mellem det samme objekt på senere tidspunkter.
- Når banerne er fremstillet, er det muligt at filtrere sporene og fjerne irrelevante spor ved simpelthen at slette dem (figur 4C). Spor kan afhjælpes ved at forbinde og afbryde forskellige baner og forskellige tidspunkter i det samme spor (figur 4C).
- Når alle rettelser er foretaget, tage et sidste blik på sporene og eksportere data (celle forskydning pr tidspunkt, banelængde, forskydning længde, track varighed osv.) til en Excel-fil (figur 4D).
5. Repræsentative resultater
Vi har testet og optimeret bred felt time-lapse billeder af neuroblast migration. Viral mærkning eller podning af fluorescensmærkede neuroblaster i SVZ tilladt for robust GFP-ekspression i migrerende celler (figur 2). Multi-bølgelængde imaging kan be anvendes til at visualisere neuroblast migration langs andre cellulære elementer i RMS såsom dextran TexasRed fyldte blodkar 4 (figur 3 og Movie 1), astrocytter fluorescensmærkede ved stereotaktisk injektion af virus med en glialcelle-promotor (figur 2B) 12, eller specifikt mærket astrocytter i transgene dyr.
Bred felt video-billeddannelse af neuroblast migration i akutte skiver viste saltatory adfærd migrere neuronale prækursorer sammensat af to adskilte faser: forskydning af det neuronale cellelegeme mod den førende fremgangsmåde adskilt af en stationær fase (fig. 3, film 1 og 2) . Til pålideligt identificere varigheden af den stationære og den vandrende faser og at udlede andre cellemigrering parametre, såsom graden af forskydning (beregnet kun i overgangsfaser), blev billeddannelse udført i 3D under anvendelse af en kort erhvervelse interval (én gang per 15 eller 30 sek). Den præcise identifikation af varighederne af de stationære og migration faser er afgørende for entydig fortolkning af data. For eksempel kan forskelle i afstand vandring under en given tidsperiode induceres enten af ændringer i hastigheden af migrering eller af ændringer i varigheden og hyppigheden af migration og stationære faser. Disse forskellige muligheder kan ikke skelnes med lange erhvervelse intervaller.
Imaris software blev anvendt til analyse af migration af neuroblaster i 3D, og at udlede yderligere parametre af cellemigrering, såsom spor varighed og banelængde, og spor forskydning længde, som er en vektor for forskydning. Sporet rethed kan også beregnes ved at dividere banelængde af sporet forskydning længde og angiver det rethed af migrerende rute individuelle neuroblast.
/ 4061/4061fig1.jpg "/>
Figur 1. Skematisk repræsentation af fremstillingen af akutte levende skiver. A) Skematisk repræsentation af en caudal, en intrahemispheric og to sagittale snit. B) Skematisk gengivelse af at placere musen hjernen på agaren blok og platform vibratome. C) Skematisk gengivelse af akut skive rugekammeret. D) Skematisk gengivelse af den billeddannende kammeret bygget på den opretstående mikroskop.
Figur 2. Mærkning af neuroblaster i RMS. A) Lav forstørrelse billede, der viser robust mærkning af neuroblaster og blodkar i den voksne RMS. En retrovirus koder for GFP blev injiceret i SVZ, og GFP-udtrykkende celler (grøn) ses i RMS efter 3 dage (venstre panel). Blodkar blev mærket ved at injicere dextran TexasRed ind i hjertet af musen (rød, højre panel). Det indsatte viser en høj magnification billede af blodkar og viralt mærkede neuroblaster forbundet med blodkar. B) mærkning af forskellige cellulære elementer i den voksne RMS. Neuroblaster blev mærket ved at injicere mCherry-kodende lentivirus i SVZ (rød) blev astrocytter mærket ved at injicere et lentivirus koder for GFP under kontrol af en GFAP promotor i RMS (grøn) og blodkar blev mærket ved injektion af dextran CascadeBlue (blue ) i hjertet. C) Skematisk gengivelse af injektionen af GAD67-GFP-celler dissocieret fra SVZ af et GAD67-GFP musen i SVZ af voksne vildtype-mus. D) Transplanterede GAD67-GFP-celler (grøn) påvist i de RMS 7 dage efter podning i SVZ. RMS er immunfarvet med GFAP (blå). E) Transplanterede GAD67-GFP-celler (grøn) var immunopositive for DCX (rød), men var immunonegative for GFAP (blå). Klik her for at se større figur.
Figur 3. Time-lapse billeder af neuroblaster. Time-lapse billeder af neuroblast (grøn) migration langs blodkar (rød). Pilene viser overgangsfaser af neuroblaster, og pilespidser angiver de stationære faser.
Figur 4. Analyse af neuroblast migration. (AD) forskellige trin i neuroblaster migrationsanalysen. De røde cirkler angiver de forskellige funktioner, der er nævnt i teksten. Klik her for at se større figur .
Video 1. Time-lapse billeder af viralt mærkede neuroblaster (grøn) migrerer langs dextran TexasRed mærkede blodkar (rød). Cslikke her for at se video.
Video 2. Tracking neuroblast migration ved Imaris software. Grønne prikker indikerer cellelegemer og spor angiver afstanden til migration. Klik her for at se video .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den korrekte målretning af neuronale prækursorer til de passende områder af hjernen er en grundlæggende proces ligger til grund for korrekt samling og funktion af neurale kredsløb. Langt størstedelen af celler migrerer under embryonisk udvikling og i den postnatale hjerne kun i nogle få regioner, såsom OB, gyrus dentatus og cerebellum, stadig neuronal forskydning finder sted. De mekanismer orkestrere cellemigrering i den postnatale hjerne dog fortsat dårligt forstået. Kendskab til de mekanismer og molekylære reaktioner der er involveret i vejlede cellemigration i modne nervevæv vil forbedre vores forståelse af neuronal målretning i den postnatale hjerne og kan have klinisk relevans for udviklingen af nye strategier til at fremkalde neuronal rekruttering til syge områder af hjernen.
I dette manuskript, beskriver vi en protokol til overvågning cellemigration i akutte skiver af den voksne mus forhjerne. Mens vi brugte den voksne SVZ-OBreaktionsvej som modelsystem, kan den samme teknik anvendes til at følge cellemigration i de embryoniske og tidlige postnatale hjerner såvel som i den voksne hjerne efter skade. Vi brugte denne protokol til at følge cellemigrering i den tidlige postnatale RMS 12, cerebellum og voksne efter slagtilfælde striatum (Eiriz, Grade, Malva og Saghatelyan, upublicerede data).
Scanning af neuroblast migration blev udført under anvendelse akutte levende skiver, der tillader cellemigration at blive undersøgt i et mikromiljø, der nøje efterligner in vivo betingelser. Migrerende celler blev visualiseret enten ved stereotaktisk injektion af viruspartikler, eller ved podning af neuroblaster fra reporter-mus i SVZ af vildtype-mus. Migrationsanalysen blev udført langt fra injektionsstedet. At studere tangential migration i RMS, vi forberedt akutte skiver 3-5 dage efter de neuroblaster var mærket. At studere radial migration i OB, blev skiverne forberedt 7-10 dage efter et stereotaxic injektion i SVZ. Viral målretning af neuronale prækursorer i den voksne SVZ kan også bruges til at studere og modulere faktorer involveret i overgangsprocessen ved at opregulere eller nedregulere specifikke molekylære signaler. Det er også muligt at mærke forskellige celletyper i RMS og udfører multi-bølgelængde billeddannelse at optrævle mønster af neuroblaster migration langs tracer fyldte blodkar 4, 13 eller langs viralt eller genetisk mærkede astrocytter 2, 12.
Til billede neuroblast migration vi bruges en motoriseret fluorescens opretstående mikroskop udstyret med et CCD-kamera, der tillades relativt hurtige erhvervelser ved forskellige z planer efter korte pulser (30-100msec) af excitationslys. Dette forhindrede fotoblegning og faldt tidsintervallet mellem to efterfølgende erhvervelser uden at forstyrre 3D-visualisering af neuroblast migration. Andre grupper har brugt konfokale eller to-foton mikroskoper at overvåge cell migrtion i den postnatale RMS 14-16. Begge teknikker har deres fordele og begrænsninger, som hovedsageligt relateret til tidsmæssige og rumlige resolutioner spørgsmål. Vi anbefaler at bruge korte intervaller (15-30 sek) mellem successive opkøb. Nyfødte neuroner har saltatory adfærd, og overgangsfaser er afbrudt af stationære perioder, der kan være så kort som 4-10 min 4. I betragtning af denne type overførsel er det vigtigt at anvende relativt hurtig opsamling mellemrum (15-30 sekunder) mellem successive tidspunkter til pålideligt identificere begyndelsen og slutningen af migration og stationære faser. Dette er vanskeligt at opnå, når tidsintervallet mellem to på hinanden erhvervelser er i området fra flere minutter. En præcis bestemmelse af de stationære og migration faser er forpligtet til utvetydigt definere hastigheden af neuroblast migration, som skal kvantificeres kun i overgangsfaser 4, 17. Lange erhvervelse intervaller gør det muligt at beregne average hastighed som den afstand, over en vis periode, der også omfatter stationære faser. Ændringer i den gennemsnitlige hastighed defineret ved denne fremgangsmåde, kan imidlertid forårsaget af forskelle i graden af migration (kun defineret i overgangsfaser) eller af varigheden af den stationære og overgangsfaser. Disse forskelle i erhvervelse parametre er tilbøjelige til at ligge til grund for forskellene i hastigheder på neuroblaster migration rapporteret af forskellige grupper. Ved at udføre hurtige opkøb med en 15-30 sekunder interval og fastlæggelsen af satsen for migration udelukkende under overgangsfaser, beregnede vi en hastighed af migration på 120-150 um / h 4, 12, mens andre grupper, der bruger en erhvervelse interval på 3-7 min rapporterede en hastighed på 50-100 um / time 14, 15, 18. Den største ulempe ved bred felt fluorescerende billeddannelse med CCD-kameraer er, at det giver lavere rumlig opløsning end scanningssystemer. Da migrerende neuroblaster har en kompakt MORPhology med soma og korte ledende processer, har en lavere rumlig opløsning ikke til hinder for pålidelig identifikation og sporing af neuroblaster på niveau med cellelegemer og endda førende processer (figur 3 og videoer 1 og 2).
Den teknik, som vi beskriver heri tillader neuroblast migration i et mikromiljø nøje efterligne in vivo betingelser, der skal analyseres, til samspillet mellem forskellige dele af RMS blive undersøgt, og rollerne for disse interaktioner i neuroblast migration, der skal undersøges.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af en canadisk Institutes of Health Research (CIHR) tilskud til ASJK blev delvis støttet af en Université Laval fællesskab. AS er modtageren af en Canada Research Chair i postnatal neurogenese.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Glucose (ACSF) | EMD | DX0145-3 | |
| NaCI | Sigma | S9625 | |
| KCI | Sigma | P9541 | |
| MgCI2x6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| NaH2PO4xH2O | EMD | SX0710-1 | |
| CaCI2x2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| Dextran TexasRed | Invitrogen | D1864 | |
| Dextran CascadeBlue | Invitrogen | D1976 | |
| Glucose (40X solution) | Sigma | G8769 | |
| Sodium pyruvat | Gibco | 11360-070 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| HBSS | Gibco | 14170-112 | |
| DNase I | Sigma | D-5025 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| BSA | EMD | 2930 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | |
| Ketamine/Xylazine | CDMV | 5230 | |
| Pasteur pipette | VWR | 14672-380 | |
| 15 ml conical tube | Sarstedt | 62.553.205 | |
| 50 ml conical tube | Sarstedt | 62.547.205 | |
| Glass capillaries (stereotaxic injection) | WPI | 4878 | |
| Paraffin oil | EMD | PX0045-3 | |
| Proviodine | Rougier | 65655-1370 | |
| Suture | Stoelting | 50487 | |
| Anafen | CDMV | 11508 | |
| 20 cc Syringe | VWR | SS-20L2 | |
| Petri dish | VWR | 25384-094 | |
| Agar | Laboratoire Mat | AP-0108 | |
| Glue | Permabond | 910 | |
| 95% O2/5% CO2 | Linde | 24068835 | |
| Blade | WPI | 501901 | |
| Nylon mesh | Warner Instruments | 64-0198 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 000.019 | |
| Pipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Nanoliter injector | WPI | B203MC4 | |
| Stereotaxic injection apparatus | WPI | 502900 | |
| Micro drill system | WPI | 501819 | |
| Vibratome | Thermo Scientific | 920110 | |
| Wide-field fluorescent microscope | Olympus | BX61WIF | |
| CCD camera | Photometrics | CS-HQ2-D | |
| Ultra-quiet imaging chamber | Harvard Apparatus | 64-1487 | |
| PH-1 Series 20 heater platform | Harvard Apparatus | 64-0284 | |
| Heating system | Warner Instruments | TC-344B | |
| 40X water immersion objective | Olympus | 1-UM587 | |
| 10X water immersion objective | Olympus | 1-UM583 | |
| Lambda DG-4 | Sutter Instruments | DG-4/OF | |
| MetaMorph software | Molecular Devices | 40000 | |
| Imaris software | Bitplane | BPI-IM70-F1 |
References
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu. Rev. Neurosci. 32, 149-184 (2009).
- Kaneko, N. New neurons clear the path of astrocytic processes for their rapid migration in the adult brain. Neuron. 67, 213-223 (2010).
- Lois, C., Alvarez-Buylla, A. Long-distance neuronal migration in the adult mammalian brain. Science. 264, 1145-1148 (1994).
- Snapyan, M. Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling. J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).
- Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. Blood vessels form a migratory scaffold in the rostral migratory stream. J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).
- Lledo, P. M., Saghatelyan, A. Integrating new neurons into the adult olfactory bulb: joining the network, life-death decisions, and the effects of sensory experience. Trends Neurosci. 28, 248-254 (2005).
- Bolteus, A. J., Bordey, A. GABA release and uptake regulate neuronal precursor migration in the postnatal subventricular zone. J. Neurosci. 24, 7623-7631 (2004).
- Martini, F. J., Valdeolmillos, M. Actomyosin contraction at the cell rear drives nuclear translocation in migrating cortical interneurons. J. Neurosci. 30, 8660-8670 (2010).
- Murase, S., Horwitz, A. F. Deleted in colorectal carcinoma and differentially expressed integrins mediate the directional migration of neural precursors in the rostral migratory stream. J. Neurosci. 22, 3568-3579 (2002).
- Wilcock, A. C., Swedlow, J. R., Storey, K. G. Mitotic spindle orientation distinguishes stem cell and terminal modes of neuron production in the early spinal cord. Development. 134, 1943-1954 (2007).
- Ono, M., Yanagawa, Y., Koyano, K. GABAergic neurons in inferior colliculus of the GAD67-GFP knock-in mouse: electrophysiological and morphological properties. Neurosci. Res. 51, 475-492 (2005).
- Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Astrocytes Control the Development of the Migration-Promoting Vasculature Scaffold in the Postnatal Brain via VEGF Signaling. J. Neurosci. 32, 1687-1704 (2012).
- Bovetti, S. Blood vessels form a scaffold for neuroblast migration in the adult olfactory bulb. J. Neurosci. 27, 5976-5980 (2007).
- Platel, J. C., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in whole-mounts of the subventricular zone. J. Physiol. 586, 3783-3793 (2008).
- Nam, S. C. Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study. J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).
- Kim, Y., Comte, I., Szabo, G., Hockberger, P., Szele, F. G. Adult mouse subventricular zone stem and progenitor cells are sessile and epidermal growth factor receptor negatively regulates neuroblast migration. PLoS One. 4, e8122 (2009).
- Bortone, D., Polleux, F. KCC2 expression promotes the termination of cortical interneuron migration in a voltage-sensitive calcium-dependent manner. Neuron. 62, 53-71 (2009).
- Comte, I. Galectin-3 maintains cell motility from the subventricular zone to the olfactory bulb. J. Cell Sci. 124, 2438-2447 (2011).
