Summary
Se describe un protocolo en tiempo real videoimaging de la migración neuronal en el cerebro anterior del ratón. La migración de viralmente marcados o injertado precursores neuronales se registró en rebanadas agudas en vivo utilizando de gran campo de imagen fluorescente con un intervalo de adquisición relativamente rápido para estudiar las diferentes fases de la migración de células, incluyendo las duraciones de las fases estacionaria y la migración y la velocidad de migración.
Abstract
Existe un importante cuerpo de evidencia que indica que las nuevas neuronas funcionales están constitutivamente generado a partir de un pool endógeno de las células madre neuronales en áreas restringidas del cerebro de los mamíferos adultos. Neuroblastos recién nacidos de la zona subventricular (SVZ) migran a lo largo de la corriente migratoria rostral (RMS) hasta su destino final en el bulbo olfatorio (OB) 1. En el RMS, los neuroblastos migran tangencialmente en las cadenas de envainado por procesos astrocíticos 2,3 utilizando los vasos sanguíneos como soporte estructural y una fuente de factores moleculares necesarios para la migración 4,5. En el OB, los neuroblastos desprenderse de las cadenas y migran radialmente en las diferentes capas bulbares donde se diferencian en interneuronas e integrar en la red existente 1, 6.
En este manuscrito se describe el procedimiento para la migración de células de vigilancia en rodajas agudas del cerebro de roedores. El uso de las rebanadas de agudos permite que la assessment de la migración de células en el microambiente que se parece mucho a las condiciones in vivo y en regiones del cerebro que son difíciles de acceder para imágenes in vivo. Además, se evita la condición de cultivo de largo como en el caso de cultivos de células organotípicos y que eventualmente pueden alterar las propiedades de migración de las células. Precursores neuronales en rodajas agudas se pueden visualizar utilizando la óptica DIC o proteínas fluorescentes. Etiquetado viral de precursores neuronales en la SVZ, injerto de neuroblastos reportero ratones en la SVZ de ratones de tipo salvaje, y el uso de ratones transgénicos que expresan la proteína fluorescente en neuroblastos son todos los métodos adecuados para la visualización de los neuroblastos y después de su migración. El método más tarde, sin embargo, no permite que las células individuales para ser rastreados por largos períodos de tiempo debido a la alta densidad de células marcadas. Se utilizó un microscopio de campo amplio fluorescente vertical equipado con una cámara CCD para conseguir un intervalo de adquisición relativamente rápida (una image cada 15 segundos o 30) para identificar de forma fiable el estacionaria y fases migratorias. Una identificación precisa de la duración de las fases estacionarias y migratorias es crucial para la interpretación inequívoca de los resultados. También se realizó varias adquisiciones z a paso para controlar la migración de los neuroblastos en 3D. De gran campo de imagen fluorescente se ha utilizado ampliamente para visualizar la migración neuronal 7-10. A continuación, se describe el protocolo detallado para el etiquetado de los neuroblastos, la realización de vídeo en tiempo real de imágenes de la migración neuroblast en rodajas agudas del cerebro anterior ratón adulto, y el análisis de la migración celular. Si bien el protocolo descrito ejemplifica la migración de neuroblastos en el RMS de adultos, que también se puede utilizar para seguir la migración de células en los cerebros embrionarios y posnatales temprana.
Protocol
1. Etiquetado de precursores neuronales
Los neuroblastos pueden ser visualizados utilizando ratones transgénicos que expresan selectivamente proteínas fluorescentes en neuroblastos (es decir, DCX-GFP, GFP-GAD67), por estereotácticamente la inyección de partículas virales que codifican las proteínas fluorescentes en la SVZ o RMS, o por injerto a partir de precursores neuronales reportero ratones (es decir , DCX-GFP, GFP-GAD67) en la SVZ de ratones de tipo salvaje. Se describe el procedimiento para el injerto y el etiquetado de los precursores neuronales viral.
La disociación de los neuroblastos de la SVZ de ratones reportero
- Las siguientes soluciones se requieren para la disociación neuroblasto.
Solución 40X
10 ml Pen / Estrept (Stock Pen 10.000 u / ml / Estrept 1.000 ug / ml)
10 ml de Glucosa (stock 200 mg / ml)
20 ml de piruvato de sodio (100 mM de archivo)
ove_content "> 10 ml de H 2 OPreparar alícuotas de 1 ml
Disección solución (100 ml)
HBSS 1X - 97,4 ml
HEPES (1 M) - 0,1 ml
40X solución - 2,5 ml
DNasa solución (20K unidades / ml)
DNaseI, typeIV de páncreas bovino
150.000 unidades se disuelven en 7,5 ml de H 2 O
Filtró 0,22 micras
Preparar alícuotas de 1 ml
Tripsina-DNaseI solución (10 ml)
HBSS - 8,6 ml
DNaseI (20K unidades / ml) - 0,15 ml
Tripsina-EDTA (0,5%) - 1 ml
40X solución - 0,25 ml
La trituración solución (50 ml)
ntent "> medio Neurobasal - 47,5 mlBSA (300 mg / ml) - 332,5 l
40X solución - 1,25 ml
DNaseI (20K unidades / ml) - 0,66 ml
- Anesthetize de dos a ratón adulto de tres meses de edad, que expresa una proteína fluorescente en neuroblastos con una inyección intraperitoneal de 100 l de ketamina / xilazina (10 mg / 1 mg por 10 g de peso corporal), se decapitan. Utilizamos GAD67-GFP ratones 11. Uso del bisturí, corta el cerebro coronal al nivel del ventrículo lateral, y diseccionar el SVZ en medio de disección hielo frío. Coloque la SVZ en un tubo de microcentrífuga con 500 l de tripsina-DNasa solución, y mantener en hielo durante 20 min.
- Transferir la SVZ en un tubo cónico de 15 ml que contiene 5 ml de pre-calentado (37 ° C) de tripsina-DNasa solución y se incuba a 37 ° C en 5% de CO 2 durante 30 min.
- Transferir todo el contenido en un tubo cónico de 50 ml que contiene 15 ml de tritración solución y se centrifuga a 1.000 xg durante 1 min. Aspirar el sobrenadante, añadir 10 ml de la solución de trituración, transferir las células a un nuevo tubo de 15 ml cónico, y se centrifuga a 1000 xg durante 1 min.
- Fire-pulir una pipeta Pasteur para reducir el tamaño de la punta y la capa con medio de trituración. Después de la centrifugación eliminar la mayor cantidad del sobrenadante como sea posible, y añadir 2 ml de solución de trituración en estado fresco al tubo cónico. Triturar las células en la solución de trituración (aproximadamente 50 veces arriba y abajo con pipeta Pasteur). Tomar la mitad superior del sobrenadante, que contiene las células disociadas bien, y la transfiere en un nuevo tubo de 15 ml cónico que contenía 10 ml de solución de trituración.
- Fire-polish una pipeta Pasteur para reducir aún más el tamaño de la punta. Añadir otra ml de solución 1 trituración al tubo que contiene las células disociadas restantes, continuar la trituración (aproximadamente 10 veces arriba y abajo), y transferir el contenido completo de la containin 15 ml tubo cónicog previamente disociadas células. Centrifugar a 1.000 xg durante 7 min. Descartar el sobrenadante, resuspender las células sedimentadas en 50 ml de medio neurobasal, la carga en una cámara de recuento, y contar las células.
Injerto el número deseado de células en la SVZ usando el procedimiento descrito a continuación.
Inyección estereotáxica del virus y el injerto de células disociadas
- Esterilice todos los instrumentos en un esterilizador de cuentas antes de comenzar la cirugía.
- Para las inyecciones estereotáxica, utilice micropipetas de vidrio con puntas muy finas (1-2 micras) para minimizar el daño cerebral. Para realizar una pipeta, tire un vaso capilar con un extractor de pipeta. Relleno de la pipeta con aceite de parafina hasta que medio lleno, e inserte el émbolo de un inyector de nanolitros (World Precision Instruments) en el extremo de la pipeta no tratada.
- El uso de un controlador nanolitros inyector, forzar a la baja del petróleo con el émbolo hasta que un pequeño drop de aceite de parafina extruye desde la punta fina. Bajar la pipeta en un recipiente estéril con 0.5-1 l de una solución que contiene tanto partículas virales (1x10 6-1x10 8 TU / ml) o células disociadas SVZ. Utilice la función de retirar el inyector de nanolitros para llenar la pipeta con la solución deseada. Asegúrese de que no haya burbujas de aire en el interior de la pipeta.
- Anesthetize de dos a C57Bl adulto de tres meses de edad / ratón 6 con una inyección intraperitoneal de ketamina / xilazina. Use una máquina eléctrica para afeitar la zona quirúrgica en la cabeza. Limpie bien con una gasa húmeda para quitar cualquier pelo adherente.
- Coloque el ratón sobre un marco estereotáxico y fijar la cabeza. Lavar el sitio de la inyección libre de pelo con jabón desinfectante (Hibitane) y luego con 70% de alcohol (gasa o spray). Desinfectar el sitio con Proviodine (gasa o spray) y cubrir el animal con un campo quirúrgico.
- Hacer una pequeña incisión en la piel del ratón esterilizada, y se extendió cuidadosamente la piel para exponerel cráneo subyacente. Se seca la superficie del cráneo. Utilice el bregma y la línea media como las coordenadas de origen para establecer los anterio-posterior (AP) y mediolateral-(ML) coordenadas estereotáxicas, respectivamente.
- Perforar un pequeño agujero en el cráneo a través de cada hemisferio en las coordenadas apropiado. Evite dañar el tejido cerebral subyacente. Taladre con cuidado hasta que sólo el hueso se ha roto. Limpiar el orificio y establecer las coordenadas de cero para las dorso-ventral (DV) coordenadas estereotáxicas sobre la superficie del cerebro. Utilizamos siguiendo las coordenadas (en mm) para inyecciones en la SVZ o RMS de adultos (22-24 g) C57Bl / 6 ratones: para SVZ: AP 0,70, 1,20 y DV ML 1,90; para RMS: AP 2,55, 0,82 y ML DV 3.15.
- Introducir lentamente la punta de la micropipeta de vidrio en el cerebro usando las coordenadas apropiadas DV como guías, y lentamente inyectar una pequeña cantidad (se inyecta 100-500 nl a 5 nl / s) de suspensión de células (disociada de la SVZ de ratones reportero) o una solución que contiene partículas virales. Utilizamos generalmentelentiviral o retroviral partículas 1x10 6-1x10 8 TU / ml.
- Retire lentamente la micropipeta de vidrio, suturar la piel sobre el cráneo, y coloque el ratón sobre una almohadilla térmica para una recuperación más rápida. Cuando el ratón se despierta después de la cirugía, administrar un analgésico (ketaprofen 10 mg / kg, SC, 1 inyección por día durante 3 días después de la operación-).
2. Preparación de rodajas agudas
- Las siguientes soluciones se deben preparar las rebanadas agudas: a) una artificial líquido cefalorraquídeo (ACSF) a base de sacarosa solución, denominada en lo sucesivo solución de corte, donde NaCl se sustituye por la sacarosa para amortiguar aumento de la excitabilidad neuronal durante el procedimiento de preparación rebanada, y b) ACSF que contiene NaCl, se calentó a 32 ° C en un baño de agua, en el que las rodajas se transfieren y se mantuvo hasta formación de imágenes.
- Las soluciones que contienen lo siguiente (en mM): solución de corte: 210,3 sacarosa, 3 KCl, MgCl 2 1,3 x6H 2 O, 2 CaCl 2 2 O 26 NaHCO 3, 1,25 NaH 2 PO 4, 20 glucosa; ACSF: 125 NaCl, KCl 3, 1,3 MgCl 2 x6H 2 O, 2 CaCl 2 x2H 2 O, 26 NaHCO 3, 1,25 NaH 2 PO 4, 20 glucosa. Mantener las soluciones a un pH de 7.3-7.4, y continuamente oxigenado mediante burbujeo con O 95% 2/5% CO 2.
- Se anestesia el ratón con una administración intraperitoneal de ketamina / xilazina. Preparar solución enfriada con hielo de corte con una apariencia similar a la gelatina utilizando nitrógeno líquido. Perfundir el ratón intracardiacaly con esta solución utilizando una jeringa de 20-cc.
- Este procedimiento se debe realizar rápidamente, por lo general 1-2 min para 20 ml de solución. Si los vasos sanguíneos necesita ser etiquetado, en lugar de la perfusión con la solución de corte, inyectar transcardiacally 200 l de dextrano Rojo Texas (10 mg / ml) en el ventrículo izquierdo del corazón y esperar 2-3 min antes de decapitar al ratón.
- Decapita el mouse, y rápidamente se sumergen la cabeza en solución enfriada con hielo de corte. Use las tijeras para cortar el cuero cabelludo, y cortar el cráneo por detrás del eje anterior a lo largo de la sutura sagital media del cerebelo al OB. Retire con cuidado las aletas craneales utilizando fórceps.
- Impuestos Especiales de la parte caudal del cerebro usando un escalpelo. Cortar el cerebro a lo largo de la fisura intrahemisférica, y hacer dos cortes sagitales en la parte más lateral de cada hemisferio (Figura 1A). Retire con cuidado el cerebro con una espátula, y lo colocamos en una solución de corte helada.
- Coloque los dos hemisferios por separado en un bloque de agar al 4% con el lado dorsal de tocar el agar, y el pegamento con el bloque de los dos hemisferios a la plataforma de un vibratome. Pegue el lateral con el lado cortado del hemisferio a la plataforma, manteniendo el lado medial hacia arriba (fig. 1B). Coloque la plataforma en la cámara de la vibratome y llenarlo con el corte de solución. Mantenga la solución oxigenada a través del slice preparación mediante burbujeo con% O 95 2/5% CO 2.
- Preparar 250 secciones m de espesor utilizando el vibratome. Usamos una Microm HM 650 V vibratome (Thermo Scientific) y se cortan las rebanadas a una frecuencia de 100 Hz y una velocidad de 1 mm / seg. A baja velocidad de corte y la vibración de alta frecuencia de la cuchilla se debe utilizar para obtener secciones de alta calidad. Tan pronto como una rebanada se libera de la cuchilla, saque la tarjeta de la solución de corte y colocarlo en una cámara de incubación lleno de ACSF oxigenada mantenida a 32 ° C en un baño de agua (Figura 1C).
Este procedimiento debe ser realizado lo más rápidamente posible para garantizar las rebanadas de la mejor calidad.
3. Time-lapse de imágenes de Migración neuroblasto
La formación de imágenes de los neuroblastos migratorios se debe realizar dentro de 6-8 h de la preparación de las rebanadas y 3-10 días después del marcaje neuroblastos. Para evitar cambios en los parámetros de migraciónpor inyección estereotáxica que pueden inducir daño cerebral y gliales activación uso delgada con punta de microelectrodos de vidrio (1-2 micras) para minimizar el daño cerebral, y llevar a cabo la formación de imágenes en las regiones distales del sitio de inyección (es decir, en la imagen siguiente RMS inyección en la SVZ o en el RMS de bulbo olfatorio después de la inyección en el RMS). Aunque la formación de imágenes se puede realizar hasta 21 días después de la inyección de partículas lentivirales en la SVZ, se recomienda más corto después de la inyección intervalo (3-10 días), ya que permite la visualización y el seguimiento de más células por campo de visión.
Se utilizó un campo amplio fluorescente motorizado BX61WI microscopio (Olympus) equipado con una cámara CCD (CoolSnapHQ2, Photometrics) y un objetivo de inmersión en agua de 40X con una abertura de 0,8 numérica (Olympus). Los objetivos con mayor NA proporcionará mejores imágenes de resolución. Neuroblastos con etiquetas (injertado ya sea de un ratón donante reportero o etiquetados de forma viral) se emocionaroncon un Lambda DG-4 equipado con una lámpara de 175 W xenón (Sutter Instruments) para 30-100 mseg por adquisición z. Longitud de onda múltiple de imágenes puede realizarse también utilizando juego de filtros adecuados (Chroma) para seguir la migración neuronal a lo largo de los otros elementos celulares de la RMS, tales como astrocitos marcados con fluorescencia o los vasos sanguíneos. El microscopio, cámara CCD y DG-4 fueron controlados por el software Metamorph (Molecular Device) que permitió que los diferentes parámetros del programa de adquisición de lapso de tiempo a ajustar (ver más abajo). Las rodajas se transfirieron a una cámara de PH1 Serie 20 ultra silencioso de imágenes (Harvard Apparatus) construido en el microscopio. La cámara se conectó a un sistema de calentamiento automático (TC-344B, Harvard Apparatus) y se perfundieron continuamente con ACSF oxigenada (Figura 1D). La temperatura en la cámara se mantuvo a 31-33 ° C, y la velocidad de flujo de la ACSF fue de 1-2 ml por min.
- Con cuidado, coloque la rebanada en la cámara de formación de imágenes del microscopio. Aevitar la deriva de la rebanada durante la formación de imágenes, que se estabilice poniendo cuidadosamente una malla de nylon (Warner Instruments) en la parte superior de la rebanada. La malla es de 0,12 mm de espesor y la gama de aberturas de 0,3 a 1,13 mm. Coloque la malla de modo que no obstruya el campo de la imagen (Figura 1D). Utilice un objetivo de 10X para encontrar un campo de interés, y luego active el objetivo 40X y ajustar el enfoque.
- Asegúrese de que el sector está continuamente perfundidos con ACSF y que no hay suficiente solución entre el objetivo y la rebanada. Los cambios en la tasa de perfusión ACSF, perfusión irregular, o variaciones drásticas de temperatura provoca la deriva y cambios en el plano focal durante la exploración.
- Establecer los parámetros de adquisición de lapso de tiempo-(es decir, duración de la excitación, el número de planos z, distancia entre cada sección Z, intervalo de tiempo, y la duración de la grabación) utilizando el software Metamorph, que controla el sistema de adquisición y se inicia el tiempo- lapso de adquisición. Data se guarda automáticamente por MetaMorph como archivos TIFF con cada archivo que corresponde a un punto temporal de la adquirida time-lapse video.
- Realice la imagen durante al menos 1-2 horas y tener en cuenta las fases migratorias que son interrumpidas por dos fases estacionarias. Las imágenes se pueden realizar durante un máximo de 4 horas (no se realizaron sesiones de formación de imágenes que duran más de 4 horas) sin ninguna modificación en las propiedades de migración de los neuroblastos. No celdas de la imagen en la superficie de la rebanada. Por lo general, la imagen a una profundidad de 20 a 100 micras. Se recomienda utilizar los intervalos cortos de adquisición (15 - 30 segundos) para determinar de forma fiable el principio y el final de la estacionaria y las fases de migración.
- Para evaluar la implicación de factores específicos moleculares en la migración de los precursores neuronales, ACSF normal puede estar sustituido con ACSF que contiene cualquier agente farmacológico deseado (es decir, diferentes agonistas, antagonistas, antagonistas, factores de crecimiento, etc.) Realizar imágenes para al menos1 hr en condición de control y, a continuación durante 1 h en presencia del agente farmacológico.
4. Análisis de las Migraciones neuroblasto
Utilizamos software Imaris (Bitplane) para analizar los datos. Esto nos permite un seguimiento automático de la migración de células recién nacido en 3D. El paquete incluye la 7.0F1 Imaris MeasurementsPro, Seguimiento Imaris, ImarisColoc, ImarisXT, Tracer filamento, y los módulos Inpress.
- Para abrir la película en Imaris, cargue las imágenes adquiridas (archivos TIFF) con tan sólo arrastrar y soltar la imagen del primer punto de tiempo del video en el icono del programa.
- Una vez que la película está cargada, ajustar el brillo y el contraste de la señal en la ventana de ajuste de pantalla, y configurar los parámetros del vídeo adquirida (tamaño de vóxel y el intervalo de tiempo) en las propiedades de imagen y determinar los puntos equidistantes tiempo ventanas (Fig. 4A) . Después de especificar el tamaño de vóxel, es posible ver la estructura en 3D, así como el tiempo y la escala de lavídeo.
- Para realizar el seguimiento de forma automática células grabadas, crear un punto para cada celda en el campo de la ventana Surpass por la elección de la función de puntos. Siga los pasos y ajustar los parámetros basados en los objetos fotografiados (Figura 4B). Uno de los parámetros es el diámetro de la célula que se puede medir en la ventana de la rebanada.
- Inspeccionar la fiabilidad de los objetos detectados en el tiempo. Si todas las células que migran no se detectan automáticamente, cambiar el umbral de detección (Figura 4B), y asegúrese de que todas las células han sido seleccionadas con manchas en todos los puntos temporales.
- Durante el seguimiento automático, si dos objetos de vecinos puntos de tiempo tiene ningún solapamiento entre sus fronteras / bordes, una conexión vía se hará para cada superposición. La distancia máxima y tamaño de intervalo máximo (Figura 4C) entre dos puntos que representan los puntos vecinos de tiempo de la misma pista tienen que ser especificados para que el programa se puede conectar el tiempo points. La distancia máxima es determinada por la distancia entre el mismo objeto en puntos de tiempo posteriores.
- Una vez que las pistas se hacen, es posible filtrar las pistas y eliminar pistas irrelevantes, simplemente borrarlas (Figura 4C). Las pistas pueden ser corregidos mediante la conexión y desconexión de las diferentes pistas y diferentes puntos de tiempo de la misma pista (Figura 4C).
- Una vez que todas las correcciones se han hecho, tomar una mirada final a las pistas y exportar los datos (desplazamiento de células por cada punto de tiempo, longitud de pista, longitud de desplazamiento, la duración de la pista, etc) a un archivo de Excel (Figura 4D).
5. Los resultados representativos
Hemos probado y optimizado de gran campo time-lapse de imágenes de la migración neuroblast. Etiquetado viral o el injerto de neuroblastos marcados con fluorescencia en la SVZ permitió la expresión de GFP en las células que migran robusta (Figura 2). Longitud de onda múltiple de imágenes puede be aplicada a visualizar la migración a lo largo de neuroblast otros elementos celulares de la RMS tal como vasos sanguíneos de dextrano TexasRed llenas de 4 (Figura 3 y Película 1), astrocitos marcados con fluorescencia por inyección estereotáxica de virus con un promotor específico de células gliales (Figura 2B) 12, o específicamente etiquetados astrocitos en los animales transgénicos.
De campo amplio de formación de imágenes de vídeo de la migración neuroblast en rebanadas agudas de manifiesto el comportamiento de la migración de saltatoria precursores neuronales compuestas de dos fases distintas: el desplazamiento del cuerpo de las células neuronales hacia el proceso principal separadas por una fase estacionaria (Figura 3, las películas 1 y 2) . Para identificar fiablemente la duración de las fases estacionarias y migratorias y para derivar otros parámetros de migración celular, tales como la tasa de desplazamiento (calculado sólo durante las fases de migración), de imágenes se realizó en 3D utilizando un intervalo de adquisición corto (una vez por 15 o 30 segundos). La determinación precisa de las duraciones de las fases estacionarias y la migración es crucial para la interpretación inequívoca de los datos. Por ejemplo, las diferencias en la distancia de migración durante un período de tiempo dado pueden ser inducidas o bien por cambios en la tasa de la migración o por modificaciones en la duración o la periodicidad de la migración y fases estacionarias. Estas diferentes posibilidades no pueden ser distinguidos usando intervalos largos de adquisición.
Imaris software se utilizó para analizar la migración de neuroblastos en 3D y para derivar parámetros adicionales de la migración celular, tales como duración de la pista y la longitud de la pista, así como la longitud de la pista de desplazamiento, que es un vector de desplazamiento. La rectitud pista puede ser también calculado dividiendo la longitud de la pista por la longitud de la pista de desplazamiento y que indica la rectitud de la ruta de migración de neuroblastos individual.
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Figura 1. Representación esquemática de la preparación de agudos rebanadas vivos. A) Representación esquemática de un caudal, una intrahemisférica y dos cortes sagitales. B) Representación esquemática de la colocación del cerebro del ratón sobre el bloque de agar y la plataforma de la vibratome. C) Representación esquemática de la cámara de incubación aguda división. D) Representación esquemática de la cámara de formación de imágenes construido en el microscopio vertical.
Figura 2. Etiquetado de los neuroblastos en el RMS. A imagen) bajo aumento que muestra robusto etiquetado de los neuroblastos y los vasos sanguíneos en el adulto RMS. Un retrovirus que codifica GFP se inyectó en la SVZ, y células que expresan GFP (verde) se detectaron en el RMS después de 3 días (panel izquierdo). Los vasos sanguíneos se marcaron mediante la inyección de dextrano TexasRed en el corazón del ratón (rojo, panel derecho). El recuadro muestra una magnífica altaación imagen de los vasos sanguíneos y los neuroblastos viralmente marcado asociado con los vasos sanguíneos. B) etiquetado de diferentes elementos celulares en el adulto RMS. Los neuroblastos se marcaron mediante la inyección de mCherry-codificación lentivirus en la SVZ (rojo), los astrocitos se marcaron mediante la inyección de un lentivirus que codifica GFP bajo el control de un promotor de GFAP en el RMS (verde), y los vasos sanguíneos se marcaron mediante la inyección de dextrano CascadeBlue (azul ) en el corazón. C) Representación esquemática de la inyección de células GAD67-GFP disociadas de la SVZ de un ratón GAD67-GFP en la SVZ de un adulto de tipo salvaje del ratón. D) trasplantadas GAD67-GFP células (verde) detectado en el RMS 7 días después de injertar en la SVZ. El RMS se immunostained con GFAP (azul). E) trasplantadas GAD67-GFP células (verde) se immunopositive para Dcx (rojo), pero fueron immunonegative para GFAP (azul). Haga clic aquí para ampliar la figura.
Figura 3. Time-lapse de imágenes de neuroblastos. Time-lapse de imágenes de neuroblastos (verde) la migración a lo largo de los vasos sanguíneos (rojo). Las flechas indican las fases de migración de los neuroblastos, y las puntas de flecha indican las fases estacionarias.
Figura 4. Análisis de la migración neuroblast. (AD) Las diferentes etapas del análisis de la migración neuroblastos. Los círculos rojos indican las diferentes funciones que se mencionan en el texto. Haga clic aquí para ampliar la cifra .
Imágenes de vídeo 1. Time-lapse de neuroblastos marcados por virus (verde) migran a lo largo de dextrano TexasRed etiquetados vasos sanguíneos (rojo). Click aquí para ver el video.
Video 2. Seguimiento de la migración de software neuroblast Imaris. Los puntos verdes indican los cuerpos celulares y las pistas indican la distancia de migración. Haga clic aquí para ver el vídeo .
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Discussion
La orientación correcta de los precursores neuronales a las regiones cerebrales apropiadas es un proceso fundamental que subyace en el correcto montaje y funcionamiento de los circuitos neuronales. La gran mayoría de las células migran durante el desarrollo embrionario y en el cerebro postnatal sólo en unas pocas regiones, tales como la circunvolución OB, dentado y el cerebelo, el desplazamiento neuronal todavía tiene lugar. Los mecanismos de orquestar la migración de células en el cerebro postnatal siguen siendo, sin embargo, poco conocidos. El conocimiento de los mecanismos y vías moleculares implicadas en la orientación de la migración de células maduras en los tejidos nerviosos mejorará nuestra comprensión de la orientación neuronal en el cerebro postnatal y puede tener relevancia clínica para el desarrollo de nuevas estrategias para inducir el reclutamiento neuronal en las áreas afectadas del cerebro.
En este manuscrito, se describe un protocolo para la migración de células de vigilancia en rebanadas agudas del cerebro anterior del ratón adulto. A pesar de que utiliza el adulto SVZ-OBvía como un sistema modelo, la misma técnica puede ser aplicada a seguir la migración de células en el cerebro postnatal y embrionarias precoces, así como en la lesión cerebral después de adulto. Utilizamos este protocolo a seguir la migración celular a principios de los 12 postnatal RMS, el cerebelo y el adulto después del accidente cerebrovascular cuerpo estriado (Eiriz, grado, Malva y Saghatelyan, datos no publicados).
Imagen de la migración neuroblast se realizó con agudas rodajas en vivo que permiten la migración de células a estudiar en un microambiente que imita las condiciones in vivo. Migración de células se visualizaron con inyecciones estereotáxicas de partículas virales o por injerto de neuroblastos reportero ratones en la SVZ de ratones de tipo salvaje. El análisis se llevó a cabo la migración lejos del sitio de la inyección. Para el estudio de la migración tangencial en el RMS, hemos preparado rebanadas agudas 3-5 días después de que los neuroblastos se marcaron. Para el estudio de la migración radial en el OB, las rebanadas se prepararon 7-10 días después de steinyección reotaxic en la SVZ. Viral focalización de los precursores neuronales en la SVZ adulto puede ser también utilizado para estudiar y manipular los factores implicados en el proceso de migración o por regulación positiva de la regulación negativa de señales moleculares específicas. También es posible marcar los diferentes tipos de células en el RMS y realizar múltiples longitudes de onda de imágenes para desentrañar el patrón de migración de neuroblastos largo de los vasos sanguíneos llenos de trazadores 4, 13 o astrocitos a lo largo de viralmente o genéticamente marcadas 2, 12.
Para la migración imagen neuroblast se utilizó un microscopio de fluorescencia motorizado vertical equipado con una cámara CCD que permite adquisiciones relativamente rápidos en diferentes planos z siguientes pulsos cortos (30-100 mseg) de la luz de excitación. Esto impidió fotoblanqueo y disminuyó el intervalo de tiempo entre dos adquisiciones posteriores sin interferir con la visualización en 3D de la migración neuroblasto. Otros grupos han utilizado microscopios confocal o dos fotones para controlar migr célulación en el postnatal RMS 14-16. Ambas técnicas tienen sus ventajas y limitaciones, que están principalmente relacionadas con cuestiones de resoluciones temporales y espaciales. Recomendamos el uso de intervalos cortos (15-30 segundos) entre las adquisiciones sucesivas. Las neuronas recién nacidas tienen un comportamiento relativa a la danza, y las fases de migración son interrumpidos por períodos fijos que pueden ser tan breves como 4-10 min 4. Teniendo en cuenta este tipo de migración, es importante la utilización de intervalos de adquisición relativamente rápido (15-30 segundos) entre los puntos de tiempo sucesivos para identificar de forma fiable el principio y el final de la migración y fases estacionarias. Esto es difícil de lograr cuando el intervalo de tiempo entre dos adquisiciones sucesivas está en el intervalo de varios minutos. Una determinación precisa de las fases estacionarias y la migración se requiere para definir sin ambigüedades la velocidad de migración de neuroblastos, que deben ser cuantificados sólo durante las 4 fases de migración, 17. Los largos intervalos de adquisición permite calcular el promedvelocidad e como la distancia recorrida durante un período de tiempo determinado, que también incluye las fases estacionarias. Los cambios en la velocidad media definida por este método, sin embargo, puede ser causada tanto por las diferencias en la tasa de migración (definidos sólo durante las fases de migración) o por la duración de la estacionaria y las fases de migración. Estas diferencias en los parámetros de adquisición es probable que subyacen a las diferencias en las velocidades de migración de neuroblastos reportado por diferentes grupos. Al realizar adquisiciones rápidas con un intervalo de 15-30 segundos y la determinación de la tasa de migración exclusivamente durante las fases de migración, se calculó una velocidad de migración de 120-150 micras / h 4, 12, mientras que otros grupos, que utiliza un intervalo de adquisición de 3-7 min informó una velocidad de 50-100 micras / h 14, 15, 18. El principal inconveniente de gran campo de imagen fluorescente con cámaras CCD es que proporciona una menor resolución espacial de los sistemas de exploración. Sin embargo, desde neuroblastos que migran tienen un compacto MORPhology con soma y procesos que conducen cortos, una menor resolución espacial no se opone a la identificación fiable y de seguimiento de los neuroblastos en el nivel de los cuerpos celulares y los procesos que conducen incluso (Figura 3 y Vídeos 1 y 2).
La técnica descrita en este documento permite la migración neuroblast en un microambiente estrechamente imitar las condiciones in vivo para analizar las interacciones entre los diferentes componentes del RMS a estudiar, y el papel de estas interacciones en la migración de neuroblastos a ser investigado.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR) subvención a ASJK fue parcialmente apoyado por una beca de la Universidad Laval. AS es el receptor de una Cátedra de investigación de Canadá en la neurogénesis postnatal.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Glucose (ACSF) | EMD | DX0145-3 | |
| NaCI | Sigma | S9625 | |
| KCI | Sigma | P9541 | |
| MgCI2x6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| NaH2PO4xH2O | EMD | SX0710-1 | |
| CaCI2x2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| Dextran TexasRed | Invitrogen | D1864 | |
| Dextran CascadeBlue | Invitrogen | D1976 | |
| Glucose (40X solution) | Sigma | G8769 | |
| Sodium pyruvat | Gibco | 11360-070 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| HBSS | Gibco | 14170-112 | |
| DNase I | Sigma | D-5025 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| BSA | EMD | 2930 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | |
| Ketamine/Xylazine | CDMV | 5230 | |
| Pasteur pipette | VWR | 14672-380 | |
| 15 ml conical tube | Sarstedt | 62.553.205 | |
| 50 ml conical tube | Sarstedt | 62.547.205 | |
| Glass capillaries (stereotaxic injection) | WPI | 4878 | |
| Paraffin oil | EMD | PX0045-3 | |
| Proviodine | Rougier | 65655-1370 | |
| Suture | Stoelting | 50487 | |
| Anafen | CDMV | 11508 | |
| 20 cc Syringe | VWR | SS-20L2 | |
| Petri dish | VWR | 25384-094 | |
| Agar | Laboratoire Mat | AP-0108 | |
| Glue | Permabond | 910 | |
| 95% O2/5% CO2 | Linde | 24068835 | |
| Blade | WPI | 501901 | |
| Nylon mesh | Warner Instruments | 64-0198 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 000.019 | |
| Pipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Nanoliter injector | WPI | B203MC4 | |
| Stereotaxic injection apparatus | WPI | 502900 | |
| Micro drill system | WPI | 501819 | |
| Vibratome | Thermo Scientific | 920110 | |
| Wide-field fluorescent microscope | Olympus | BX61WIF | |
| CCD camera | Photometrics | CS-HQ2-D | |
| Ultra-quiet imaging chamber | Harvard Apparatus | 64-1487 | |
| PH-1 Series 20 heater platform | Harvard Apparatus | 64-0284 | |
| Heating system | Warner Instruments | TC-344B | |
| 40X water immersion objective | Olympus | 1-UM587 | |
| 10X water immersion objective | Olympus | 1-UM583 | |
| Lambda DG-4 | Sutter Instruments | DG-4/OF | |
| MetaMorph software | Molecular Devices | 40000 | |
| Imaris software | Bitplane | BPI-IM70-F1 |
References
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