Summary
Vi beskriver ett protokoll för realtid videoimaging av neuronala migration i mus framhjärnan. Migrationen av viralt märkta eller ympas neuronala prekursorer noterades i akuta levande skivor med brett fält fluorescerande avbildning med en relativt snabb förvärv intervall för att studera de olika faserna av cellmigration, inklusive varaktigheten för den stationära och faser migration och hastighet migration.
Abstract
Det finns en avsevärd mängd bevis för att nya funktionella nervceller konstitutivt genereras från en endogen pool av neurala stamceller i begränsade områden av den vuxna däggdjur hjärnan. Nyfödda neuroblaster från subventrikulära zonen (SVZ) vandrar längs rostrala vandrande ström (RMS) till slutdestinationen i luktbulben (OB) 1. I RMS, neuroblaster vandrar tangentiellt i kedjor ensheathed av astrocytiska processer 2,3 med blodkärl som strukturellt stöd och en källa av molekylära faktorer som krävs för migration 4,5. I OB, neuroblaster lossna från kedjorna och migrera radiellt in i de olika bulbära lagren där de differentierar till interneuronen och integreras i det befintliga nätet 1, 6.
I detta manuskript beskriver vi proceduren för övervakning cellmigration vid akuta skivor av gnagare hjärnan. Användningen av akut skivor låter assessment av cellmigration i mikromiljön som nära liknar till in vivo förhållanden och i hjärnan regioner som är svåra att komma åt för in vivo imaging. Dessutom undviker man långa odling skick som i fallet med organotypiska och cellkulturer som så småningom kan ändra migration egenskaper cellerna. Neuronala prekursorer i akuta skivor kan visualiseras med användning av DIC optik eller fluorescerande proteiner. Viral märkning av neuronala prekursorer i SVZ, ympning neuroblaster från reporter möss i SVZ av vildtypsmöss, och användning av transgena möss som uttrycker fluorescerande protein i neuroblaster är alla lämpliga metoder för att visualisera neuroblaster och efter deras migrering. Den senare metoden, emellertid, inte tillåter individuella celler som skall spåras under långa tidsperioder på grund av den höga densiteten av märkta celler. Vi använde ett brett fält fluorescerande upprätt mikroskop utrustat med en CCD-kamera för att uppnå en relativt snabb förvärv intervall (ett imaGE var 15 eller 30 sekunder) att tillförlitligt identifiera stationära och migrerande faser. En exakt identifiering av den tid de stationära och vandrande faser är avgörande för entydig tolkning av resultaten. Vi utförde också flera z-steg förvärv för att övervaka neuroblaster migration i 3D. Wide-området fluorescerande avbildning har använts i stor utsträckning för att visualisera neuronala migration 7-10. Här beskriver vi detaljerat protokoll för märkning neuroblaster, utför realtidsvideo-avbildning av neuroblast migration i akuta skivor av den vuxna musen framhjärnan och analysera cellmigration. Medan den beskrivna protokoll exemplifieras migration av neuroblaster i vuxna RMS, kan den också användas för att följa cellmigration i embryonala och tidiga postnatala hjärnor.
Protocol
1. Märkning Neuronala Prekursorer
Neuroblaster kan visualiseras med användning av transgena möss som selektivt uttrycker fluorescerande proteiner i neuroblaster (dvs. DCX-GFP, GAD67-GFP), genom stereotaxiskt injicera viruspartiklar kodar fluorescerande proteiner i SVZ eller RMS, eller genom ympning neuronala prekursorer från reporter möss (dvs. , DCX-GFP, GAD67-GFP) i SVZ av vildtypsmöss. Vi beskriver förfarandet för ympning och viral märkning av neuronala prekursorer.
Dissociation av neuroblaster från SVZ av rapportgener möss
- Följande lösningar krävs för neuroblast dissociation.
40X lösning
10 ml Pen / Strept (Stock Pen 10.000 U / ml / Strept 1.000 pg / ml)
10 ml Glukos (Lager 200 mg / ml)
20 ml natriumpyruvat (Lager 100 mM)
ove_content "> 10 ml H 2 OBered 1 ml alikvoter
Dissektion lösning (100 ml)
HBSS 1X - 97,4 ml
HEPES (1 M) - 0,1 ml
40X lösning - 2,5 ml
DNas-lösning (20K enheter / ml)
DNasI, typeIV från bovin pankreas
150.000 enheter löses i 7,5 ml H-O 2
Filtrerad 0,22 um
Bered 1 ml alikvoter
Trypsin-DNasI-lösning (10 ml)
HBSS - 8,6 ml
DNasI (20K enheter / ml) - 0,15 ml
Trypsin-EDTA (0,5%) - 1 ml
40X lösning - 0,25 ml
Triturering lösning (50 ml)
ntent "> Neurobasal medel - 47,5 mlBSA (300 mg / ml) - 332,5 pl
40X lösning - 1,25 ml
DNasI (20K enheter / ml) - 0,66 ml
- Söva två-till tre månader gamla vuxen mus som uttrycker en fluorescerande protein i neuroblaster med en intraperitoneal injektion av 100 pl av ketamin / xylazin (10 mg / 1 mg per 10 g kroppsvikt), sedan halshugga. Vi använder GAD67-GFP-möss 11. Med hjälp av skalpell, skiva hjärnan koronalt i nivå med den laterala ventrikeln, och dissekera ut SVZ i iskall dissektion mediet. Placera SVZ i ett mikrocentrifugrör med 500 pl trypsin-DNas-lösning, och hålla på is under 20 minuter.
- Överför SVZ i ett 15 ml koniskt rör innehållande 5 ml förvärmd (37 ° C) trypsin-DNas-lösning och inkubera vid 37 ° C i en 5% CO 2 i 30 min.
- Överför hela innehållet i ett 50 ml koniskt rör innehållande 15 ml trituration lösning och centrifugera vid 1.000 x g under 1 min. Aspirera supernatanten, tillsätt 10 ml triturering lösning överföra cellerna till ett nytt 15 ml koniskt rör och centrifugera vid 1000 xg i 1 minut.
- Brand-polera en pasteurpipett för att minska spetsen storlek och päls med finfördelning medium. Efter centrifugering ta bort så mycket av supernatanten som möjligt, och tillsätt 2 ml färsk triturering lösning på det koniska röret. Finfördela cellerna i tritureringsprocessen lösningen (ungefär 50 gånger upp och ner med Pasteurpipett). Ta den övre halvan av supernatanten, vilken innehåller väl dissocierade celler, och överföra den till en ny 15 ml koniskt rör innehållande 10 ml triturering lösning.
- Brand-polish en pasteurpipett för att ytterligare minska spetsen storlek. Lägga till ytterligare 1 ml triturering lösning på rör som innehåller de återstående odissocierad cellerna, fortsätter finfördelning (ungefär 10 gånger upp och ner), och överför hela innehållet till 15 ml koniskt rör containing tidigare dissocierade celler. Centrifugera vid 1.000 x g under 7 min. Kasta bort supernatanten, återsuspendera de pelleterade cellerna i 50 ml Neurobasal medium, ladda in en räknekammare, och räkna cellerna.
Graft önskat antal celler i SVZ användning av förfarandet som beskrivs nedan.
Stereotaxisk injektion av viruset och ympning av dissocierade celler
- Sterilisera alla instrument med en pärla autoklav innan operationen.
- För stereotaktiska injektioner, använd glas mikropipetter med mycket tunna spetsar (1-2 pm) för att minimera hjärnskador. För att göra en pipett, dra ett glas kapillär med en pipett avdragare. Återfyllning pipetten med paraffin olja tills halvfullt, och sätt kolven i en nanoliter injektor (World precisionsinstrument) i den obehandlade änden av pipetten.
- Med hjälp av en nanoliter injektor styrenhet tvinga oljan nedåt med kolven tills en liten DROp av paraffinolja extruderar från den tunna spetsen. Sänk pipetten i en steril behållare med 0,5-1 fil av en lösning innehållande antingen viruspartiklar (1x10 6-1x10 8 TU / ml) eller dissocierade celler SVZ. Använd dra funktion nanoliter injektorn att fylla pipetten med den önskade lösningen. Se till att det inte finns några luftbubblor inne i pipetten.
- Bedöva två-till tre månader gamla vuxna C57BL / 6 mus med en intraperitoneal injektion av ketamin / xylazin. Använd en elektrisk rakapparat för att raka operationsområdet på huvudet. Rengör väl med våt gasväv för att avlägsna fastsittande hår.
- Placera musen på en stereotaktisk ram och fixera huvudet. Tvätta håret utan injektionsstället med desinfektionsmedel tvål (Hibitane) och därefter med 70% alkohol (gasväv eller spray). Desinficera området med Proviodine (gasväv eller spray) och täck djuret med en kirurgiska området.
- Göra ett litet snitt i det steriliserade huden på musen, och försiktigt sprida huden för att exponeraunderliggande skallen. Torka ytan av skallen. Använd bregma och mittlinjen som noll koordinaterna för att ställa in anterio-posterior (AP) och medio-laterala (ML) stereotaktiska koordinater, respektive.
- Borra ett litet hål i skallen över varje hemisfär vid lämplig koordinaterna. Undvik att skada den underliggande hjärnvävnaden. Borra försiktigt tills bara benet har brutits. Rengör hålet och nollställa koordinaterna för de dorso-ventrala (DV) stereotaktiska koordinater på ytan av hjärnan. Vi använder följande koordinat (i mm) för injektioner till SVZ eller RMS vuxen (22-24 g) C57BL / 6 möss: för SVZ: AP 0,70, ML 1,20 och DV 1,90, för RMS: AP 2,55, ML 0,82 och DV 3,15.
- Långsamt in spetsen glasmikropipett i hjärnan med hjälp av lämpliga DV koordinaterna som guider, och sakta injicera en liten mängd (vi injicerar 100-500 nl vid 5 nl / sek) av cellsuspension (skiljas från SVZ av reporter möss) eller en lösning innehållande viruspartiklar. Vi brukar användalentiviral eller retrovirala partiklar 1x10 6-1x10 8 TU / ml.
- Dra långsamt upp glasmikropipett, sy huden över skallen och placera musen på en värmedyna för snabbare återhämtning. När musen vaknar efter operationen, administrera ett analgetikum (ketaprofen 10 mg / kg, SC, 1 injektion per dag under 3 dagar efter op).
2. Förbereda Akut skivor
- Följande lösningar är skyldiga att upprätta akuta skivor: a) en konstgjord cerebrospinalvätska (ACSF) sackaros-baserad lösning, nedan kallad skärande lösning, där NaCl ersätts av sackaros för att dämpa ökad neuronal retbarhet under skiva beredningen förfarandet och b) ACSF innehållande NaCl, värmdes till 32 ° C i ett vattenbad, i vilket skivorna överförs och upprätthålls tills avbildning.
- Lösningarna innehåller följande (i mM): skärning lösning: 210,3 sackaros, 3 KCl, 1,3 MgCl 2 x6H 2 O, 2 Caci 2 2 O 26 NaHCOs 3, 1,25 NaH 2 PO 4, 20 glukos, ACSF: 125 NaCl, 3 KCl, 1,3 MgCl 2 x6H 2 O, 2 Caci 2 X2h 2 O, 26 NaHCOs 3, 1,25 NaH 2 PO 4, 20 glukos. Bibehåll lösningarna vid ett pH av 7,3-7,4, och ständigt syresätta genom bubbling dem med 95% O 2/5% CO 2.
- Bedöva musen med en intraperitoneal administrering av ketamin / xylazin. Förbered iskall lösning för kapning med en geléliknande utseende användning av flytande kväve. Perfundera musen intracardiacaly med denna lösning med hjälp av en 20-cc spruta.
- Detta förfarande bör utföras snabbt, oftast 1-2 min för 20 ml lösning. Om blodkärlen måste märkas, i stället för att perfusion med den skärande lösningen, injicera transcardiacally 200 pl dextran Texas Red (10 mg / ml) i den vänstra ventrikeln av hjärtat och vänta 2-3 min innan halshugga musen.
- Halshugga på mOuse, och snabbt doppa huvudet i iskall lösning för kapning. Använd saxen för att avlägsna hårbotten, och skär skallen från den bakre till främre axel längs mitten sagital sutur från lillhjärnan till OB. Ta försiktigt bort de kraniala flikarna med pincett.
- Excidera kaudala delen av hjärnan med användning av en skalpell. Skär hjärnan längs intrahemispheric fissuren och gör två sagittala snitt på den laterala delen av varje hemisfär (Figur 1A). Ta försiktigt bort hjärnan med hjälp av en spatel och placera den i iskall lösning för kapning.
- Placera två hjärnhalvorna separat på en 4% agar blocket med ryggsidan röra agar och limma blocket med de två hjärnhalvorna till plattformen för ett vibratome. Limma lateralt skära sidan av hemisfären till plattformen, hålla mediala sidan uppåt (figur 1B). Placera plattformen i kammare vibratome och fyll den med skärande lösning. Förvara lösningen syresätts hela SLIce preparat genom att den bubblas med 95% O 2/5% CO 2.
- Förbered 250 im tjocka sektioner med hjälp av vibratome. Vi använder en mikroM HM 650 V vibratome (Thermo Scientific) och skär skivorna med en frekvens på 100 Hz och en hastighet av 1 mm / sek. En låg skärhastighet och högfrekvent blad vibrationer bör användas för att erhålla högkvalitativa sektioner. Så snart en skiva frigörs från bladet, försiktigt ta bort den från den skärande lösningen och placera den i en inkubation kammare fylld med syresatt ACSF hålls vid 32 ° C i ett vattenbad (figur 1C).
Detta förfarande bör utföras så snabbt som möjligt för att säkerställa bästa kvalitet skivor.
3. Time-lapse avbildning av Neuroblast Migration
Den avbildning av migrerande neuroblaster bör utföras inom 6-8 timmar för att förbereda skivor och 3-10 dagar efter neuroblaster märkning. För att undvika förändringar i migration parametrarpå grund av stereotaktisk injektion som kan framkalla hjärnskada och gliaceller aktivering använder tunna spets mikroelektroder glas (1-2 pm) för att minimera hjärnskador, och utför avbildning i regionerna distalt från injektionsstället (dvs bilden i RMS följande injektion i SVZ eller i RMS luktbulben efter injektion in RMS). Även om avbildning kan utföras upp till 21 dagar efter injektion av lentivirala partiklar i SVZ rekommenderar vi kortare efter injektionen intervall (3-10 dagar) eftersom det tillåter visualisera och spåra fler celler per synfält.
Vi använde ett brett fält fluorescerande motoriserade BX61WI mikroskop (Olympus) utrustad med en CCD-kamera (CoolSnapHQ2, ljustekniska) och en 40X vatten nedsänkning mål med en 0,8 numerisk apertur (Olympus). Målen med högre NA ger bättre upplösning. Märkta neuroblaster (ympade antingen från en reporter donator mus eller viralt märkta) var gladamed en Lambda GD-4 utrustad med en 175 W xenonlampa (Sutter Instruments) för 30-100 ms per z förvärvet. Flera våglängder avbildning kan också utföras med användning av lämpliga filter set (Chroma) att spåra neuronala migration längs de andra cellulära element av RMS, såsom fluorescensmärkta astrocyter eller blodkärl. Mikroskop, CCD-kamera och GD-4 kontrollerades av Metamorph programvara (Molecular Device) som gjorde det möjligt för olika parametrar time-lapse förvärv programmet ställas in (se nedan). Skivorna överfördes till en PH1 serie 20 ultratyst avbildning kammare (Harvard Apparatus) bygger på mikroskopet. Kammaren är ansluten till ett automatiskt värmesystem (TC-344b, Harvard Apparatus) och kontinuerligt genomspolades med syresatt ACSF (figur 1D). Temperaturen i kammaren hölls vid 31-33 ° C och flödeshastigheten för ACSF var 1-2 ml per minut.
- Placera försiktigt skivan i avbildning kammare mikroskop. Tillundvika drivande av skiva under avbildning, stabilisera den genom att försiktigt placera en nylonnät (Warner Instruments) ovanpå skivan. Nätet är 0,12 mm tjockt och öppningarna intervallet 0,3 till 1,13 mm. Placera nätet så att det inte hindrar bildfältet (Figur 1D). Använd en 10X mål att hitta ett område av intresse och sedan aktivera 40X mål och justera fokus.
- Se till att skivan kontinuerligt perfusion med ACSF och att det finns tillräckligt med lösning mellan målet och skivan. Förändringar i graden av ACSF perfusion, oregelbunden perfusion eller drastiska temperaturvariationer orsakar drivande och förändringar i fokalplanet under avbildning.
- Ställ in tid-lapse förvärv parametrar (dvs. varaktighet excitation, antalet z plan, avståndet mellan varje z-sektion, tidsintervall och varaktighet på inspelningen) med hjälp av Metamorph programvaran som styr förvärv systemet och starta tid förfaller förvärv. DaTA sparas automatiskt av Metamorph som TIFF-filer med varje fil som motsvarar en tidpunkt av det förvärvade time-lapse video.
- Utför avbildning minst 1-2 timmar och ta hänsyn till flyttande faser som avbryts av två stationära faser. Den avbildning kan utföras upp till 4 timmar (vi inte utföra imaging sessioner som varar mer än 4 timmar) utan några ändringar i migrationen egenskaper neuroblaster. Gör inte bild celler på ytan av skivan. Vi bild vanligen på ett djup av 20 till 100 um. Vi rekommenderar att du använder korta förvärv mellanrum (15 - 30 sek) att tillförlitligt bestämma början och slutet av den stationära och faser migration.
- För att bedöma deltagande av specifika molekylära faktorer i migreringen av neuronala prekursorer kan normalt ACSF ersättas med ACSF innehållande önskad farmakologiskt medel (dvs olika agonister, antagonister, blockerare, tillväxtfaktorer, etc.). Utför avbildning minst1 timme i kontroll tillstånd och sedan under 1 h i närvaro av det farmakologiska medlet.
4. Analysera Neuroblast Migration
Vi använder Imaris programvara (Bitplane) för att analysera data. Det ger oss möjlighet att automatiskt spåra nyfödda cellmigration i 3D. Den Imaris 7.0F1 paketet ingår MeasurementsPro, Imaris Tracking, ImarisColoc, ImarisXT, glödlampor Tracer, och moduler inpress.
- För att öppna filmen i Imaris, ladda de förvärvade bilder (TIFF-filer) genom att helt enkelt dra och släppa bilden av den första tidpunkten för video på programikonen.
- När filmen är laddad, justera ljusstyrka och kontrast på signalen i displayen justering fönstret och ställa in parametrarna för det förvärvade video (voxel storlek och tidsintervall) i Bildegenskaper och Set ekvidistant tidpunkter fönster (figur 4A) . Efter att ha angett voxel storlek är det möjligt att någon ram i 3D samt tid och omfattningvideo.
- Att automatiskt spåra inspelade celler, skapa en plats för varje cell i fältet i Överträffa fönstret genom att välja Spots funktionen. Följ stegen och ställa in parametrar baserade på de avbildade föremålen (Figur 4B). En av parametrarna är diametern av cellen som kan mätas i Slice fönstret.
- Inspektera tillförlitligheten av de detekterade objekten över tiden. Om alla migrerande cellerna inte upptäcks automatiskt, ändra tröskeln för detektion (Figur 4B), och se till att alla celler har valts med fläckar vid alla tidpunkter.
- Under automatisk spårning, om två föremål från närliggande tidpunkter har någon överlappning mellan sina gränser / kanter, kommer en spåranslutning göras för varje överlappning. Det maximala avståndet och maximal gap storlek (Figur 4C) mellan två punkter som representerar närliggande tidpunkter i samma spår måste preciseras så att programmet kan ansluta tiden points. Det maximala avståndet bestäms av avståndet mellan samma objekt vid efterföljande tidpunkter.
- När spåren är gjorda, är det möjligt att filtrera spåren och ta bort irrelevanta spår genom att helt enkelt ta bort dem (figur 4C). Spår kan korrigeras genom att ansluta och koppla olika spår och olika punkter tid för samma spår (Figur 4C).
- När alla korrigeringar har gjorts, ta en sista titt på spåren och exportera data (cell förskjutning per tidpunkt, spårlängd, förskjutning längd Låt Längd mm) till en Excel-fil (Figur 4D).
5. Representativa resultat
Vi testade och optimerade brett fält time-lapse avbildning av neuroblast migration. Viral märkning eller ympning av fluorescensmärkta neuroblaster i SVZ tillåten för robust GFP-uttryck i migrerande celler (figur 2). Flera våglängder avbildning kan be tillämpas för visualisera neuroblast migrering längs andra cellulära element av RMS såsom dextran TexasRed fyllda blodkärl 4 (Figur 3 och film 1), astrocyter fluorescensmärkta genom stereotaxisk injektion av virus med en gliacell promotor (Figur 2B) 12, eller specifikt märkta astrocyter i transgena djur.
Wide-området video-avbildning av neuroblast migration i akuta skivor avslöjade saltatorisk beteende migrera neuronala prekursorer består av två separata faser: förskjutning av neuronala cellkroppen mot den ledande processen åtskilda av en stationär fas (figur 3, Filmer 1 och 2) . Tillförlitligt identifiera hur länge de stationära och vandrande faser och att härleda andra parametrar cellmigration som graden av förskjutning (beräknad endast under övergångsfaser) var avbildning utförs i 3D med hjälp av en kort förvärv intervall (en gång per 15 eller 30 sek). Den exakta identifieringen av löptider för stationära och övergångsfaser är avgörande för entydig tolkning av data. Till exempel kan skillnader i avstånd migration under en given tidsperiod induceras antingen genom förändringar i graden av migrationen eller av ändringar i längd eller periodicitet migrationen och stationära faser. Dessa olika möjligheter kan inte särskiljas med långa förvärv mellanrum.
Imaris mjukvara användes för att analysera migration av neuroblaster i 3D och att härleda ytterligare parametrar av cellmigration, såsom spår varaktighet och banlängd, liksom spår förskjutning längd, vilket är en vektor av förskjutning. Spåret rakhet kan också beräknas genom att dividera spårlängden av spåret förskjutning längd och den indikerar rakheten hos migrerande rutten enskilda neuroblast.
/ 4061/4061fig1.jpg "/>
Figur 1. Schematisk representation av beredningen av akuta levande skivor. A) Schematisk representation av en caudal, en intrahemispheric och två sagittala snitt. B) Schematisk representation av att placera musen hjärnan på agar blocket och plattform vibratome. C) Schematisk representation av akut skiva inkubationskammaren. D) Schematisk representation av det bildgivande kammarens byggd på den upprättstående mikroskop.
Figur 2. Märkning av neuroblaster i RMS. A) Låg förstoring bild som visar stark märkning av neuroblaster och blodkärl i den vuxna RMS. Ett retrovirus kodar för GFP injicerades i SVZ, och GFP-uttryckande celler (grön) detekterades i RMS efter 3 dagar (vänstra panelen). Blodkärl märktes genom att injicera dextran TexasRed i hjärtat av musen (röd, höger panel). Den infällda bilden visar en hög magnifiction bild av blodkärl och viralt märkta neuroblaster samband med blodkärl. B) Märkning av olika cellulära element i den vuxna RMS. Neuroblaster märktes genom att injicera mCherry-kodande lentivirus i SVZ (röd), var astrocyter märktes genom injicering av en GFP lentivirus kodar under kontroll av en GFAP-promotor i RMS (grön), och blodkärl märktes genom att injicera Dextran CascadeBlue (blå ) i hjärtat. C) Schematisk representation av injektion av GAD67-GFP celler dissocierade från SVZ av en GAD67-GFP mus i SVZ av en vuxen vildtyp mus. D) Transplanterade GAD67-GFP celler (grön) detekteras i RMS 7 dagar efter ympning i SVZ. RMS är immunfärgades med GFAP (blå). E) Transplanterade GAD67-GFP celler (grön) var immunopositiva för DCX (röd), men var immunonegative för GFAP (blå). Klicka här för att se större bild.
Figur 3. Time-lapse avbildning av neuroblaster. Time-lapse avbildning av neuroblast (grön) migrering längs blodkärl (röd). Pilarna indikerar övergångsfaser av neuroblaster, och pilarna indikerar de stationära faserna.
Figur 4. Analys av neuroblast migration. (AD) Olika steg neuroblaster migration analys. De röda cirklarna indikerar olika funktioner som nämns i texten. Klicka här för att se större bild .
Video 1. Time-lapse avbildning av viralt märkta neuroblaster (grön) migrerar längs dextran TexasRed märkta blodkärl (röd). Cslicka här för att se videon.
Video 2. Spårning neuroblast migration Imaris programvara. Gröna prickar indikerar cellkroppar och spår anger avståndet för migration. Klicka här för att se video .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den korrekta målinriktning av neuronala prekursorer till lämpliga hjärnregioner är en fundamental process som ligger till grund för korrekt montering och funktion av neurala kretsar. De allra flesta celler migrerar under embryonal utveckling och den postnatala hjärnan endast i ett fåtal regioner, till exempel OB, dentate gyrus och cerebellum, neuronal förskjutning sker fortfarande. De mekanismer iscensätta cellmigration i den postnatala hjärnan kvarstår dock dåligt kända. Kunskap om mekanismer och molekylära involverade i att vägleda cellmigration i mogna nervvävnader kommer att förbättra vår förståelse av neuronal inriktning i den postnatala hjärnan och kan ha klinisk betydelse för utvecklingen av nya strategier för att framkalla neuronal rekryteringen till sjuka områden i hjärnan.
I detta manuskript, beskriver vi ett protokoll för övervakning av cellmigration i akuta skivor av vuxen mus framhjärnan. Medan vi använde vuxna SVZ-OBväg som ett modellsystem, kan samma teknik användas för att följa cellmigration i de embryonala och tidiga postnatala hjärnor liksom i den vuxna hjärnan efter skada. Vi använde detta protokoll för att följa cellmigration under den neonatala RMS 12, lillhjärnan och vuxna efter stroke striatum (Eiriz, grad, Malva och Saghatelyan, opublicerade data).
Avbildning av neuroblast migrering utfördes med hjälp av akuta levande skivor som gör cellmigration studeras i en mikromiljö som nära efterliknar in vivo förhållanden. Migrerande celler visualiserades antingen genom stereotaktiska injektioner av virala partiklar eller genom ympning neuroblaster från reporter möss i SVZ av vildtypsmöss. Migreringen utfördes långt från injektionsstället. Att studera tangentiell migration i RMS, förberedde vi akuta skivor 3-5 dagar efter det att neuroblaster var märkta. Att studera radiell migration i OB, var skivorna beredda 7-10 dagar efter en stereotaxic injektion i SVZ. Viral inriktning av neuronala prekursorer i den vuxna SVZ kan också användas för att studera och modulera faktorer som migreringen genom att uppreglera eller nedreglera specifika molekylära signaler. Det är också möjligt att märka olika celltyper i RMS och utföra flera våglängder avbildning att reda mönstret av neuroblaster migration längs spårämne fyllda blodkärl 4, 13 eller längs viralt eller genetiskt märkta astrocyter 2, 12.
Att bilden neuroblast migrering använde vi en motoriserad fluorescens upprätt mikroskop utrustat med en CCD-kamera som tillät relativt snabba förvärv på olika z plan efter korta pulser (30-dröja över 100 msek) av excitationsljus. Detta hindrade fotoblekning och minskade tidsintervallet mellan två på varandra följande förvärv utan att störa 3D-visualisering av neuroblast migration. Andra grupper har använt konfokala eller två foton mikroskop för att övervaka cellens MIGRring i den postnatala RMS 14-16. Båda teknikerna har sina fördelar och begränsningar, som huvudsakligen är relaterade till tid och rum resolutioner frågor. Vi rekommenderar att du använder korta intervaller (15-30 sek) mellan successiva förvärv. Nyfödda nervceller har saltatorisk beteende och övergångsfaser avbryts av stationära perioder som kan vara så kort som 4-10 min 4. Med tanke på denna typ av migration, är det viktigt att använda relativt snabba förvärv intervall (15-30 sek) mellan successiva tidpunkter att tillförlitligt identifiera början och slutet av migration och stationära faser. Detta är svårt att uppnå när tidsintervallet mellan två successiva förvärv ligger i intervallet flera minuter. En exakt bestämning av de stationära och övergångsfaser krävs för att entydigt definiera hastigheten på neuroblast migration, som bör kvantifieras endast under övergångsfaser 4, 17. Långa förvärv mellanrum gör det möjligt att beräkna average hastighet som den sträcka över en viss tidsperiod som även stationära faser. Förändringar i medelhastighet som definieras av denna metod kan dock orsakas antingen av skillnader i graden av migration (definierade endast under övergångsfaser) eller genom längden på stationära och faser migration. Dessa skillnader i ackvisitionsparametrar sannolikt bakom skillnaderna i hastigheter neuroblaster migration rapporterats av olika grupper. Genom att utföra snabba förvärv med en 15-30 sek intervall och bestämma graden av migration endast under övergångsfaser, beräknade vi en hastighet på migration av 120-150 nm / h 4, 12, medan andra grupper, som använder ett förvärv intervall 3-7 minuter rapporterade en hastighet av 50-100 um / h 14, 15, 18. Den huvudsakliga nackdelen med brett fält fluorescerande avbildning med CCD-kameror är att det ger lägre spatial upplösning än avsökningssystem. Eftersom flyttande neuroblaster har en kompakt MORPhology med soma och korta ledande processer utesluter en lägre spatial upplösning inte tillförlitlig identifiering och spårning av neuroblaster i nivå med cellkroppar och även ledande processer (figur 3 och videoklipp 1 och 2).
Tekniken beskriver vi här gör neuroblast migration i en mikromiljö nära efterliknar in vivo förhållanden som skall analyseras, till samverkan mellan olika delar av RMS studeras och de roller dessa interaktioner i neuroblast migrering till utredas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av en kanadensisk Institutes of Health Research (CIHR) bidrag till ASJK delvis stöds av en Université Laval gemenskap. AS är mottagaren av ett Kanada forskning ordförande i postnatal neurogenes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Glucose (ACSF) | EMD | DX0145-3 | |
| NaCI | Sigma | S9625 | |
| KCI | Sigma | P9541 | |
| MgCI2x6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| NaH2PO4xH2O | EMD | SX0710-1 | |
| CaCI2x2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| Dextran TexasRed | Invitrogen | D1864 | |
| Dextran CascadeBlue | Invitrogen | D1976 | |
| Glucose (40X solution) | Sigma | G8769 | |
| Sodium pyruvat | Gibco | 11360-070 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| HBSS | Gibco | 14170-112 | |
| DNase I | Sigma | D-5025 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| BSA | EMD | 2930 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | |
| Ketamine/Xylazine | CDMV | 5230 | |
| Pasteur pipette | VWR | 14672-380 | |
| 15 ml conical tube | Sarstedt | 62.553.205 | |
| 50 ml conical tube | Sarstedt | 62.547.205 | |
| Glass capillaries (stereotaxic injection) | WPI | 4878 | |
| Paraffin oil | EMD | PX0045-3 | |
| Proviodine | Rougier | 65655-1370 | |
| Suture | Stoelting | 50487 | |
| Anafen | CDMV | 11508 | |
| 20 cc Syringe | VWR | SS-20L2 | |
| Petri dish | VWR | 25384-094 | |
| Agar | Laboratoire Mat | AP-0108 | |
| Glue | Permabond | 910 | |
| 95% O2/5% CO2 | Linde | 24068835 | |
| Blade | WPI | 501901 | |
| Nylon mesh | Warner Instruments | 64-0198 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 000.019 | |
| Pipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Nanoliter injector | WPI | B203MC4 | |
| Stereotaxic injection apparatus | WPI | 502900 | |
| Micro drill system | WPI | 501819 | |
| Vibratome | Thermo Scientific | 920110 | |
| Wide-field fluorescent microscope | Olympus | BX61WIF | |
| CCD camera | Photometrics | CS-HQ2-D | |
| Ultra-quiet imaging chamber | Harvard Apparatus | 64-1487 | |
| PH-1 Series 20 heater platform | Harvard Apparatus | 64-0284 | |
| Heating system | Warner Instruments | TC-344B | |
| 40X water immersion objective | Olympus | 1-UM587 | |
| 10X water immersion objective | Olympus | 1-UM583 | |
| Lambda DG-4 | Sutter Instruments | DG-4/OF | |
| MetaMorph software | Molecular Devices | 40000 | |
| Imaris software | Bitplane | BPI-IM70-F1 |
References
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu. Rev. Neurosci. 32, 149-184 (2009).
- Kaneko, N. New neurons clear the path of astrocytic processes for their rapid migration in the adult brain. Neuron. 67, 213-223 (2010).
- Lois, C., Alvarez-Buylla, A. Long-distance neuronal migration in the adult mammalian brain. Science. 264, 1145-1148 (1994).
- Snapyan, M. Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling. J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).
- Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. Blood vessels form a migratory scaffold in the rostral migratory stream. J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).
- Lledo, P. M., Saghatelyan, A. Integrating new neurons into the adult olfactory bulb: joining the network, life-death decisions, and the effects of sensory experience. Trends Neurosci. 28, 248-254 (2005).
- Bolteus, A. J., Bordey, A. GABA release and uptake regulate neuronal precursor migration in the postnatal subventricular zone. J. Neurosci. 24, 7623-7631 (2004).
- Martini, F. J., Valdeolmillos, M. Actomyosin contraction at the cell rear drives nuclear translocation in migrating cortical interneurons. J. Neurosci. 30, 8660-8670 (2010).
- Murase, S., Horwitz, A. F. Deleted in colorectal carcinoma and differentially expressed integrins mediate the directional migration of neural precursors in the rostral migratory stream. J. Neurosci. 22, 3568-3579 (2002).
- Wilcock, A. C., Swedlow, J. R., Storey, K. G. Mitotic spindle orientation distinguishes stem cell and terminal modes of neuron production in the early spinal cord. Development. 134, 1943-1954 (2007).
- Ono, M., Yanagawa, Y., Koyano, K. GABAergic neurons in inferior colliculus of the GAD67-GFP knock-in mouse: electrophysiological and morphological properties. Neurosci. Res. 51, 475-492 (2005).
- Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Astrocytes Control the Development of the Migration-Promoting Vasculature Scaffold in the Postnatal Brain via VEGF Signaling. J. Neurosci. 32, 1687-1704 (2012).
- Bovetti, S. Blood vessels form a scaffold for neuroblast migration in the adult olfactory bulb. J. Neurosci. 27, 5976-5980 (2007).
- Platel, J. C., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in whole-mounts of the subventricular zone. J. Physiol. 586, 3783-3793 (2008).
- Nam, S. C. Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study. J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).
- Kim, Y., Comte, I., Szabo, G., Hockberger, P., Szele, F. G. Adult mouse subventricular zone stem and progenitor cells are sessile and epidermal growth factor receptor negatively regulates neuroblast migration. PLoS One. 4, e8122 (2009).
- Bortone, D., Polleux, F. KCC2 expression promotes the termination of cortical interneuron migration in a voltage-sensitive calcium-dependent manner. Neuron. 62, 53-71 (2009).
- Comte, I. Galectin-3 maintains cell motility from the subventricular zone to the olfactory bulb. J. Cell Sci. 124, 2438-2447 (2011).
