Summary
Nous décrivons un protocole en temps réel videoimaging de la migration neuronale dans le cerveau antérieur de la souris. La migration de viralement étiquetés ou greffés précurseurs neuronales a été enregistré en direct en utilisant des tranches aiguës imagerie à grand champ fluorescent avec un intervalle d'acquisition relativement rapide pour étudier les différentes phases de la migration cellulaire, y compris les durées des phases stationnaire et la migration et la vitesse de migration.
Abstract
Il existe un ensemble considérable de preuves indiquant que les nouveaux neurones fonctionnels sont constitutivement produite à partir d'une piscine endogène des cellules souches neurales dans des zones restreintes du cerveau des mammifères adultes. Neuroblastes nés de la zone sous-ventriculaire (SVZ) migrent le long du courant de migration rostrale (RMS) vers leur destination finale dans le bulbe olfactif (OB) 1. Dans la RMS, neuroblastes migrent tangentiellement dans les chaînes entourées par des processus astrocytaires 2,3 à l'aide des vaisseaux sanguins comme un support structurel et une source de facteurs moléculaires nécessaires à la migration 4,5. Dans l'OB, les neuroblastes se détacher des chaînes et migrent radialement dans les différentes couches bulbaires où ils se différencient en interneurones et à s'intégrer dans le réseau existant 1, 6.
Dans ce manuscrit, nous décrivons la procédure de migration des cellules de suivi en tranches aiguës du cerveau des rongeurs. L'utilisation des tranches aiguës permet à l'assessment de la migration cellulaire dans le microenvironnement ressemblant à des conditions in vivo et dans les régions du cerveau qui sont difficiles d'accès pour l'imagerie in vivo. En outre, il évite état de culture autant que dans le cas des cultures organotypiques et de la cellule, qui peut éventuellement modifier les propriétés de migration des cellules. Précurseurs neuronaux en tranches aiguës peuvent être visualisés en utilisant l'optique DIC ou des protéines fluorescentes. Étiquetage virale des précurseurs neuronaux dans la SVZ, la greffe neuroblastes de souris journaliste dans la SVZ de souris de type sauvage, et en utilisant des souris transgéniques qui expriment une protéine fluorescente dans les neuroblastes sont toutes des méthodes appropriées pour la visualisation des neuroblastes et après leur migration. La méthode plus tard, cependant, ne permet pas de cellules individuelles à suivre pendant de longues périodes de temps en raison de la forte densité de cellules marquées. On utilise un grand champ du microscope à fluorescence vertical équipé d'une caméra CCD pour obtenir un intervalle d'acquisition relativement rapide (une image toutes les 15 secondes ou 30) pour identifier de manière fiable les phases stationnaire et migrateurs. Une identification précise de la durée des phases stationnaires et migrateurs est cruciale pour l'interprétation univoque des résultats. Nous avons également réalisé plusieurs acquisitions progressives z pour surveiller la migration des neuroblastes en 3D. Imagerie à grand champ fluorescente a été largement utilisé pour visualiser la migration neuronale 7-10. Ici, nous décrivons le protocole détaillé pour l'étiquetage des neuroblastes, l'exécution en temps réel de vidéo-imagerie de la migration des neuroblastes en tranches aiguës du cerveau antérieur de souris adulte, et l'analyse de la migration cellulaire. Alors que le protocole décrit exemple la migration des neuroblastes dans le RMS adulte, elle peut également être utilisée pour suivre la migration des cellules embryonnaires dans le cerveau et le début postnatal.
Protocol
1. L'étiquetage des précurseurs neuronaux
Neuroblastes peut être visualisé en utilisant des souris transgéniques qui expriment de manière sélective des protéines fluorescentes en neuroblastes (ie, DCX-GFP, GAD67-GFP), par injection stéréotaxique particules virales codant pour des protéines fluorescentes dans la SVZ ou RMS, ou par greffage de précurseurs neuronales de souris marqueurs (à savoir , DCX-GFP, GAD67-GFP) dans la SVZ de souris de type sauvage. Nous décrivons la procédure de greffage et de l'étiquetage virale des précurseurs neuronaux.
La dissociation des neuroblastes de la SVZ de souris journaliste
- Les solutions suivantes sont requises pour la dissociation des neuroblastes.
Solution 40X
10 ml Pen / Strept (Stock Pen 10 000 u / ml / Strept 1.000 ug / ml)
10 Glucose ml (Stock 200 mg / ml)
20 ml pyruvate de sodium (100 mM stock)
ove_content "> 10 ml H 2 OPréparer des aliquotes de 1 ml
Dissection solution (100 ml)
HBSS 1X - 97,4 ml
HEPES (1 M) - 0,1 ml
Solution 40X - 2,5 ml
DNase solution (20K unités / ml)
DNase I, typeIV de pancréas bovin
150.000 unités dissoudre dans 7,5 ml de H 2 O
Filtrée de 0,22 um
Préparer des aliquotes de 1 ml
Trypsine DNasel solution (10 ml)
HBSS - 8,6 ml
DNase I (20K unités / ml) - 0,15 ml
Trypsine-EDTA (0,5%) - 1 ml
Solution 40X - 0,25 ml
La trituration solution (50 ml)
ntent "> milieu Neurobasal - 47,5 mlBSA (300 mg / ml) - 332,5 pi
Solution 40X - 1,25 ml
DNase I (20K unités / ml) - 0,66 ml
- Anesthetize deux à trois souris adultes mois, exprimant une protéine fluorescente dans les neuroblastes avec une injection intrapéritonéale de 100 pi de kétamine / xylazine (10 mg / 1 mg par 10 g de poids corporel), puis décapiter. Nous utilisons GAD67-GFP souris 11. En utilisant le scalpel, couper le cerveau coronaire au niveau du ventricule latéral et disséquer la SVZ en milieu de dissection glacée. Placez la SVZ dans un microtube avec 500 ul de trypsine-DNase solution, et garder sur la glace pendant 20 min.
- Transférer la SVZ dans un tube conique de 15 ml contenant 5 ml de pré-chauffé (37 ° C) de trypsine-DNase solution et incuber à 37 ° C dans un 5% de CO2 pendant 30 min.
- Verser le contenu entier dans un tube conique de 50 ml contenant 15 ml de tritsolution guration et centrifuger à 1000 xg pendant 1 min. Aspirer le surnageant, ajouter 10 ml de solution de trituration, de transférer les cellules à un nouveau tube de 15 ml conique, et centrifuger à 1000 xg pendant 1 min.
- L'incendie polir une pipette Pasteur pour réduire la taille de la pointe et le manteau avec le milieu de trituration. Après la centrifugation, éliminer autant de surnageant que possible, et ajouter 2 ml de solution de trituration frais au tube conique. Triturer les cellules dans la solution de trituration (environ 50 fois de haut en bas avec une pipette Pasteur). Prenez la moitié supérieure du surnageant, qui contient des cellules ainsi dissociées, et de le transférer dans un nouveau tube de 15 ml conique contenant 10 ml de solution trituration.
- Fire-poli d'une pipette Pasteur pour réduire encore la taille de la pointe. Ajouter un autre 1 ml de solution trituration dans le tube contenant les cellules restantes non dissociées, continuer la trituration (environ 10 fois de haut en bas), et de transférer tout le contenu de la containin 15 ml tube coniqueg de cellules précédemment dissociés. Centrifuger à 1000 xg pendant 7 min. Jeter le surnageant, remettre en suspension le culot cellulaire dans 50 ml de milieu neurobasal, charge dans une chambre de comptage, et de compter les cellules.
Greffer le nombre désiré de cellules dans la SVZ utilisant la procédure décrite ci-dessous.
Injection stéréotaxique de greffage et le virus de cellules dissociées
- Stériliser tous les instruments à l'aide d'un stérilisateur à billes avant de commencer l'opération.
- Pour les injections stéréotaxiques, utilisez micropipettes de verre avec des pointes très fines (1-2 um) afin de minimiser les lésions cérébrales. Pour faire une pipette, tirer un capillaire en verre avec un extracteur pipette. Le remblai de la pipette avec de l'huile de paraffine jusqu'à ce que à moitié plein, et insérez le piston d'un injecteur nanolitre (World Precision Instruments) dans l'extrémité de la pipette n'est pas traitée.
- L'utilisation d'un contrôleur nanolitre injecteur, forcer vers le bas d'huile avec le piston jusqu'à ce qu'une petite drop d'huile de paraffine extrude à partir de la pointe fine. Abaissez la pipette dans un récipient stérile avec 0,5 à 1 pi d'une solution contenant soit des particules virales (1x10 6-1x10 8 TU / ml) ou de cellules dissociées SVZ. Utilisez la fonction de retrait de l'injecteur nanolitre pour remplir la pipette avec la solution souhaitée. Assurez-vous qu'il n'ya pas de bulles d'air à l'intérieur de la pipette.
- Anesthetize deux à C57Bl adultes de trois mois vieux / 6 souris avec une injection intrapéritonéale de kétamine / xylazine. Utilisez un rasoir électrique pour se raser le site chirurgical sur la tête. Bien nettoyer avec de la gaze humide pour enlever les poils adhérente.
- Placez la souris sur un cadre stéréotaxique et fixer la tête. Laver le site d'injection sans poils avec du savon désinfectant (Hibitane), puis avec de l'alcool à 70% (gaze ou spray). Désinfecter le site d'Proviodine (gaze ou spray) et couvrent l'animal avec un champ opératoire.
- Faire une petite incision dans la peau stérilisés de la souris, et bien répartir la peau pour exposerle crâne sous-jacent. Sécher la surface du crâne. Utilisez le bregma et la ligne médiane que les coordonnées du zéro pour définir les antéro-postérieur (AP) et médio-latéral (ML) coordonnées stéréotaxiques, respectivement.
- Percez un petit trou dans le crâne au-dessus de chaque hémisphère aux coordonnées approprié. Éviter d'endommager le tissu cérébral sous-jacent. Percez soigneusement jusqu'à ce que l'os a été violée. Nettoyer le trou et fixer les coordonnées du zéro pour les dorso-ventral (DV) coordonnées stéréotaxiques sur la surface du cerveau. Nous utilisons la suite de coordonnées (en mm) pour préparations injectables dans la SVZ ou RMS des adultes (22-24 g) C57Bl / 6 souris: pour SVZ: AP 0,70, 1,20 et DV ML 1,90; pour RMS: AP 2,55, 0,82 et ML DV 3,15.
- Insérez délicatement la pointe de la micropipette de verre dans le cerveau en utilisant les coordonnées appropriées DV comme guides, et injecter lentement une petite quantité (nous injectons 100-500 nl à 5 nl / s) de la suspension cellulaire (dissociée de la SVZ de souris marqueurs) ou d'un solution contenant les particules virales. Nous utilisons habituellementlentiviral ou rétrovirale particules 1x10 1x10 8 6-TU / ml.
- Retirer lentement la micropipette de verre, suturer la peau sur le crâne, et placez la souris sur un coussin chauffant pour une récupération plus rapide. Lorsque la souris se réveille après la chirurgie, administrer un analgésique (ketaprofen 10 mg / kg, SC, 1 injection par jour pendant 3 jours post-opératoires).
2. Préparation tranches aiguës
- Les solutions suivantes sont nécessaires pour préparer les tranches aiguës: a) une artificielle liquide céphalo-rachidien (ACSF) à base de saccharose en solution, ci-après dénommée solution de découpe, où NaCl est remplacé par le saccharose pour amortir augmentation de l'excitabilité neuronale au cours de la procédure de préparation de tranches, et b) ACSF contenant du NaCl, chauffé à 32 ° C dans un bain-marie, dans lequel les tranches sont transférées et maintenue jusqu'à ce que l'imagerie.
- Les solutions contenir les éléments suivants (en mM): solution de découpe: 210,3 saccharose, 3 KCI, 1,3 MgCl2 x6H 2 O, 2 CaCl 2 2 O 26 NaHCO 3, 1,25 NaH 2 PO 4, 20 glucose; ACSF: 125 NaCl, KCl 3, MgCl 2 1,3 x6H 2 O, CaCl 2 2 x2H 2 O, 26 NaHCO 3, 1,25 NaH 2 PO 4, 20 glucose. Maintenir les solutions à un pH de 7.3 à 7.4, et continuellement oxygéner par barbotage d'entre eux avec 95% O 2/5% de CO 2.
- Anesthésier la souris avec une administration intrapéritonéale de kétamine / xylazine. Préparer une solution glacée de coupe avec une apparence gélatineuse utilisant de l'azote liquide. Perfuser la souris intracardiacaly avec cette solution à l'aide d'une seringue de 20 cc.
- Cette procédure doit être effectuée rapidement, habituellement 1-2 min pour 20 ml de solution. Si les vaisseaux sanguins doivent être étiquetés, au lieu de la perfusion avec la solution de découpe, injecter transcardiacally 200 pi de Dextran Texas Red (10 mg / ml) dans le ventricule gauche du coeur et attendre 2-3 minutes avant de décapiter la souris.
- Décapiter le mouse, et rapidement plonger la tête dans une solution glacée de coupe. Utilisez les ciseaux pour enlever le cuir chevelu, et couper le crâne de la partie postérieure à l'axe long de la suture antérieure à mi-sagittal du cervelet à l'OB. Retirez doucement les volets du crâne à l'aide de pinces.
- Exciser la partie caudale du cerveau à l'aide d'un scalpel. Couper le cerveau le long de la fissure intrahemispheric, et faire deux coupes sagittales sur la partie la plus latérale de chaque hémisphère (figure 1A). Retirez délicatement le cerveau à l'aide d'une spatule, et le placer dans une solution de coupe glacée.
- Placer les deux hémisphères séparément sur un bloc de gélose 4% avec la face dorsale de toucher la gélose, et colle le bloc avec les deux hémisphères de la plate-forme d'un vibratome. Collez le côté coupé vers le latéral de l'hémisphère à la plate-forme, en gardant côté médial vers le haut (figure 1B). Placez la plate-forme dans la chambre de la vibratome et le remplir avec solution de découpe. Conserver la solution oxygénée dans le slipréparation ce par barbotage avec 95% 2 O / 5% de CO 2.
- Préparer 250 um d'épaisseur sections en utilisant le vibratome. Nous utilisons un Microm HM 650 V vibratome (Thermo Scientific) et couper les tranches à une fréquence de 100 Hz et une vitesse de 1 mm / sec. Une vitesse de coupe basse et haute fréquence de vibration lame doit être utilisé pour obtenir des articles de grande qualité. Dès qu'une tranche est libérée de la lame, retirez-le délicatement de la solution de coupe et le placer dans une chambre d'incubation rempli ACSF oxygénée maintenue à 32 ° C dans un bain d'eau (figure 1C).
Cette procédure doit être effectuée le plus rapidement possible pour s'assurer que les tranches de meilleure qualité.
3. Imagerie time-lapse de la migration des neuroblastes
L'imagerie des neuroblastes en migration doit être effectuée dans les 6-8 heures de la préparation de tranches et de 3-10 jours après le marquage neuroblastes. Pour éviter les changements de paramètres de migrationen raison de l'injection stéréotaxique qui pourraient induire des lésions cérébrales gliales et d'activation des microélectrodes de verre mince utilisation pointes (1-2 um) afin de minimiser les dommages au cerveau, et de réaliser l'imagerie dans les régions distales du site d'injection (image c'est à dire dans ce qui suit RMS injection dans la SVZ ou dans le bulbe olfactif du RMS suite à l'injection dans le RMS). Bien que l'imagerie peut être effectuée jusqu'à 21 jours après l'injection de particules lentivirales dans la SVZ, nous vous recommandons court intervalle post-injection (3-10 jours), car il permet de visualiser et de suivre plus de cellules par champ de vue.
On utilise un grand champ fluorescent motorisé BX61WI microscope (Olympus) équipé d'une caméra CCD (CoolSnapHQ2, Photometrics) et un objectif à immersion d'eau 40X avec une ouverture numérique 0,8 (Olympus). Les objectifs à plus forte NA fournira une meilleure résolution des images. Neuroblastes marqués (soit greffé à partir d'une souris donneuse journaliste ou un virus étiquetés) ont été ravisavec un Lambda DG-4 équipé d'une lampe au xénon de 175 W (Sutter Instruments) pour 30-100 msec par acquisition z. Multi-longueur d'onde d'imagerie peut également être effectuée à l'aide filtres appropriés (Chroma) pour suivre la migration des neurones le long des autres éléments cellulaires du RMS, telles que les astrocytes marqués par fluorescence ou des vaisseaux sanguins. Le microscope, une caméra CCD et de la DG-4 ont été contrôlés par le logiciel MetaMorph (Device moléculaire) qui a permis aux différents paramètres du programme d'acquisition de time-lapse à régler (voir ci-dessous). Les tranches ont été transférés à un PH1 série 20 chambre ultra-silencieux d'imagerie (Harvard Apparatus) construit sur le microscope. La chambre était reliée à un système de chauffage automatique (TC-344B, Harvard Apparatus) et a été perfusée en continu avec oxygéné ACSF (figure 1D). La température dans la chambre a été maintenue à 31-33 ° C, et la vitesse d'écoulement de l'ACSF est 1-2 ml par min.
- Placez délicatement la tranche dans la chambre d'imagerie du microscope. Àéviter la dérive de la tranche au cours de l'imagerie, de le stabiliser par précaution de placer un filet en nylon (Warner Instruments) au-dessus de la tranche. La maille est de 0,12 mm d'épaisseur et l'intervalle des ouvertures de 0,3 à 1,13 mm. Positionner le treillis de manière à ne pas obstruer le champ de formation d'image (figure 1D). Utilisez un objectif 10X pour trouver un domaine d'intérêt, puis engager l'objectif 40X et la mise au point.
- Assurez-vous que la tranche est perfusée en continu avec ACSF et qu'il ya suffisamment de solution entre l'objectif et la tranche. Les variations du taux de perfusion ACSF, la perfusion irrégulière, ou des variations brusques de température provoque la dérive et des changements dans le plan focal lors de l'imagerie.
- Régler les paramètres d'acquisition à intervalles de temps (durée de l'excitation, le nombre de plans z, la distance entre chaque profilé en Z, l'intervalle de temps, et la durée de l'enregistrement) en utilisant le logiciel MetaMorph, qui commande le système d'acquisition et de démarrer le temps caduque acquisition. Data est automatiquement enregistrée par MetaMorph en tant que fichiers TIFF avec chaque fichier correspondant à un point dans le temps de l'acquisition de time-lapse vidéo.
- Effectuez l'imagerie pendant au moins 1-2 heures et de prendre en considération les phases migratoires qui sont interrompus par deux phases stationnaires. L'imagerie peut être effectuée pour un maximum de 4 heures (nous n'avons pas effectuer des séances d'imagerie durant plus de 4 heures) sans aucune modification dans les propriétés de migration des neuroblastes. Ne pas les cellules d'image à la surface de la tranche. On habituellement d'image à une profondeur de 20 à 100 um. Nous vous recommandons d'utiliser des intervalles d'acquisition courts (15 - 30 sec) pour déterminer de façon fiable le début et la fin de l'arrêt et des phases de migration.
- Pour évaluer l'implication de certains facteurs moléculaires de la migration des précurseurs neuronaux, ACSF normale peut être substitué par ACSF contenant aucun agent pharmacologique désiré (c.-à différents agonistes, antagonistes, inhibiteurs, facteurs de croissance, etc.) Effectuer une imagerie pour au moins1 h dans un état de commande, puis pendant 1 heure en présence de l'agent pharmacologique.
4. L'analyse de la migration des neuroblastes
Nous utilisons un logiciel Imaris (Bitplane) pour analyser les données. Cela nous permet de suivre automatiquement la migration des cellules du nouveau-né en 3D. Le forfait comprend le Imaris 7.0F1 MeasurementsPro, Imaris suivi, ImarisColoc, ImarisXT, Filament Tracer et modules Inpress.
- Pour ouvrir le film dans Imaris, charger les images acquises (tiff) par simple glisser-déposer l'image du premier point de temps de la vidéo sur l'icône du programme.
- Une fois que le film est chargé, réglez la luminosité et le contraste du signal dans la fenêtre de réglage d'affichage et définissez les paramètres de la vidéo acquise (taille de voxel et l'intervalle de temps) dans les Propriétés de l'image Régler et équidistants des points les fenêtres de temps (figure 4A) . Après avoir spécifié la taille de voxel, il est possible de voir l'image en 3D ainsi que le temps et l'ampleur de lavidéo.
- Pour suivre automatiquement les cellules enregistrées, créer une place pour chaque cellule dans le champ de la fenêtre Surpass en choisissant la fonction Spots. Suivez les étapes et définissez les paramètres basés sur les objets imagés (figure 4B). L'un des paramètres est le diamètre de la cellule qui peuvent être mesurés dans la fenêtre de tranche.
- Inspectez la fiabilité des objets détectés au cours du temps. Si toutes les cellules migrantes ne sont pas automatiquement détecté, changer le seuil de détection (figure 4B), et assurez-vous que toutes les cellules ont été sélectionnés avec des taches à tous les temps.
- Pendant l'alignement automatique, si deux objets voisins du temps-points ont tout chevauchement entre leurs frontières / bords, une connexion piste sera faite pour chaque recouvrement. La distance maximale et la taille de l'écart maximal (figure 4C) entre deux points représentant les points de temps voisins de la même piste doivent être précisés afin que le programme peut se connecter au poin tempsts. La distance maximale est déterminée par la distance entre l'objet même à la suite des points de temps.
- Une fois les pistes sont faites, il est possible de filtrer les pistes et supprimer des pistes inutiles en supprimant tout simplement entre eux (figure 4C). Les pistes peuvent être corrigés en connectant et déconnectant les différentes pistes et des points de temps différents sur la même piste (4C Figure).
- Une fois que toutes les corrections ont été faites, prenez un dernier regard sur les pistes et exporter les données (déplacement de cellules par point de temps, longueur de la piste, longueur de déplacement, la durée piste, etc) dans un fichier Excel (figure 4D).
5. Les résultats représentatifs
Nous avons testé et optimisé à grand champ imagerie time-lapse de la migration des neuroblastes. L'étiquetage virale ou greffage des neuroblastes marqués par fluorescence dans la SVZ a permis l'expression de GFP dans les cellules migrent robuste (Figure 2). Multi-longueur d'onde d'imagerie peut be appliquée à visualiser la migration le long neuroblaste autres éléments cellulaires du RMS comme les vaisseaux sanguins dextrane TexasRed remplis 4 (Figure 3 et film 1), les astrocytes marqués par fluorescence par injection stéréotaxique de virus avec un promoteur spécifique de cellules gliales (Figure 2B) 12, ou plus précisément étiqueté astrocytes chez les animaux transgéniques.
Large domaine de la vidéo-imagerie de la migration des neuroblastes en tranches aiguës révélé le comportement saltatoire de la migration des précurseurs neuronaux constitués de deux phases distinctes: le déplacement du corps des cellules neuronales vers le processus de premier plan séparées par une phase stationnaire (figure 3, films 1 et 2) . Pour identifier de manière fiable la durée des phases stationnaires et migrateurs et d'en déduire d'autres paramètres de migration cellulaires tels que la vitesse de déplacement (calculé que durant les phases de migration), l'imagerie 3D a été réalisée en utilisant un intervalle d'acquisition court (une fois par 15 ou 30 sec). L'identification précise des durées des phases stationnaires et la migration est cruciale pour l'interprétation claire des données. Par exemple, des différences dans la distance de migration au cours d'une période donnée peut être provoquée soit par les variations du taux de la migration ou par des modifications de la durée ou de la périodicité de la migration et de phases stationnaires. Ces différentes possibilités ne peuvent être distinguées à l'aide de longs intervalles d'acquisition.
Imaris logiciel a été utilisé pour analyser la migration des neuroblastes en 3D et pour dériver des paramètres supplémentaires de la migration des cellules telles que la durée et la piste de longueur de piste, ainsi que la longueur de déplacement de piste, qui est un vecteur de déplacement. La rectitude piste peut être également obtenu en divisant la longueur de piste par piste de déplacement de la longueur et il indique la rectitude de la voie de migration neuroblaste individu.
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Figure 1. Représentation schématique de la préparation des tranches aiguës en direct. Une représentation) Schéma d'une caudale, une intrahemispheric et deux coupes sagittales. Représentation schématique B) de placer le cerveau de la souris sur le bloc d'agar et de la plate-forme vibratome. Représentation schématique C) de la chambre d'incubation tranche aiguë. Représentation schématique D) de la chambre d'imagerie repose sur la microscope droit.
Figure 2. L'étiquetage des neuroblastes dans le SGD. A l'image) à faible grossissement montrant l'étiquetage robuste des neuroblastes et des vaisseaux sanguins chez l'adulte RMS. Un rétrovirus codant pour la GFP a été injecté dans la SVZ et cellules exprimant la GFP (vert) ont été détectées dans le SGD après 3 jours (panneau de gauche). Les vaisseaux sanguins ont été marqués par l'injection de dextran TexasRed dans le cœur de la souris (rouge, panneau de droite). L'encart montre une grande magnifiction l'image des vaisseaux sanguins et des neuroblastes virale étiquetés associés aux vaisseaux sanguins. B) L'étiquetage des différents éléments cellulaires chez l'adulte RMS. Neuroblastes ont été marqués par injection mCherry-encodage lentivirus dans la SVZ (rouge), les astrocytes ont été marqués par l'injection d'un lentivirus codant pour la GFP sous le contrôle d'un promoteur GFAP dans le RMS (vert), et les vaisseaux sanguins ont été marqués par l'injection de Dextran CascadeBlue (bleu ) dans le cœur. Représentation schématique C) de l'injection de GAD67-GFP cellules dissociées de la SVZ d'une souris GAD67-GFP dans la SVZ d'un adulte souris de type sauvage. D) transplantées des cellules GFP-GAD67 (vert) détectées dans les 7 jours après la greffe RMS dans la SVZ. Le RMS est immunomarquées avec GFAP (en bleu). E) transplantées des cellules GFP-GAD67 (vert) étaient immunopositif pour Dcx (rouge), mais étaient immunonegative pour la GFAP (en bleu). Cliquez ici pour agrandir la figure.
Figure 3. Imagerie time-lapse de neuroblastes. Imagerie time-lapse de neuroblastes (vert) de migration le long des vaisseaux sanguins (rouge). Les flèches indiquent les phases de migration des neuroblastes, et les flèches indiquent les phases stationnaires.
Figure 4. Analyse de la migration des neuroblastes. (AD) Différentes étapes de la migration des neuroblastes analyse. Les cercles rouges indiquent les différentes fonctions mentionnées dans le texte. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Imagerie vidéo 1. Time-lapse de neuroblastes virale étiquetés (vert) migrant le long de dextrane TexasRed vaisseaux sanguins étiquetés (rouge). Clécher ici pour voir la vidéo.
Vidéo 2. Suivi de migration des neuroblastes par le logiciel Imaris. Les points verts indiquent les corps cellulaires et les pistes indiquent la distance de migration. Cliquez ici pour voir la vidéo .
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Discussion
Le ciblage correct des précurseurs neuronaux pour les régions du cerveau appropriés est un processus fondamental qui sous-tend l'ensemble et le bon fonctionnement des circuits neuronaux. La grande majorité des cellules migrent pendant le développement embryonnaire et dans le cerveau postnatal seulement dans quelques régions, comme l'OB, le gyrus denté et le cervelet, le déplacement neuronale a toujours lieu. Les mécanismes orchestrant la migration des cellules dans le cerveau postnatal reste cependant mal connus. La connaissance des mécanismes et des voies moléculaires impliquées dans l'orientation de la migration cellulaire dans les tissus nerveux matures permettra d'améliorer notre compréhension de ciblage des neurones dans le cerveau après la naissance et peut avoir une pertinence clinique pour le développement de nouvelles stratégies visant à induire le recrutement des neurones dans les zones atteintes du cerveau.
Dans ce manuscrit, nous décrivons un protocole pour la migration des cellules de suivi en tranches aiguës du cerveau antérieur de souris adulte. Alors que nous avons utilisé l'adulte SVZ-OBvoie comme système modèle, la même technique peut être appliquée à suivre la migration des cellules embryonnaires dans le cerveau et le début postnatales ainsi que dans la lésion cérébrale adulte à la suite. Nous avons utilisé ce protocole pour suivre la migration des cellules au début des années RMS postnatal 12, cervelet et adulte post-AVC striatum (Eiriz, Grade, Malva et Saghatelyan, données non publiées).
Imagerie de la migration des neuroblastes été réalisée en utilisant des tranches aiguës en direct qui permettent la migration des cellules à étudier dans un microenvironnement qui imite étroitement des conditions in vivo. Migration des cellules ont été visualisées soit par des injections stéréotaxiques de particules virales ou par greffage neuroblastes de souris journaliste dans la SVZ de souris de type sauvage. L'analyse de la migration a été effectuée loin du site d'injection. Pour étudier la migration tangentielle dans le SGD, nous avons préparé des tranches aiguës 3-5 jours après les neuroblastes ont été marqués. Pour étudier la migration radiale dans l'OB, les tranches ont été préparés 7-10 jours après une stereotaxic injection dans la SVZ. Ciblage virale de précurseurs neuronaux chez l'adulte SVZ peut être également utilisé pour étudier et moduler les facteurs impliqués dans le processus de migration en régulation à la hausse ou à la régulation négative de signaux moléculaires spécifiques. Il est également possible de marquer différents types de cellules dans le RMS et d'effectuer plusieurs longueurs d'onde d'imagerie à démêler le motif de la migration des neuroblastes le long des vaisseaux sanguins remplis de traceurs 4, 13 ou astrocytes long virale ou génétiquement marquées 2, 12.
Pour la migration des neuroblastes image que l'on a utilisé un microscope à fluorescence motorisé verticale équipé d'une caméra CCD qui a permis à des acquisitions relativement rapides sur des plans différents suivant z impulsions courtes (30-100 ms) de la lumière d'excitation. Cela a empêché photoblanchiment et une diminution de l'intervalle de temps entre deux acquisitions successives sans interférer avec la visualisation 3D de la migration des neuroblastes. D'autres groupes ont utilisé des microscopes confocaux ou à deux photons pour surveiller migr celluletion dans la période postnatale RMS 14-16. Les deux techniques ont leurs avantages et leurs limites, qui sont principalement liés à des questions temporelles et spatiales résolutions. Nous vous recommandons d'utiliser de courts intervalles (15-30 sec) entre les acquisitions successives. Nouveaux neurones ont un comportement saltatoire, et les phases de migration sont interrompues par des périodes fixes qui peuvent être aussi bref que 4-10 min 4. Compte tenu de ce type de migration, il est important d'utiliser des intervalles d'acquisition relativement rapide (15-30 sec) entre les points temporels successifs à identifier de manière fiable le début et la fin de la migration et des phases stationnaires. Ceci est difficile à réaliser lorsque l'intervalle de temps entre deux acquisitions successives est de l'ordre de plusieurs minutes. Une détermination précise des phases stationnaires et la migration est nécessaire pour définir sans ambiguïté la vitesse de migration des neuroblastes, qui doit être quantifié que pendant les 4 phases de migration, 17. Intervalles d'acquisition à long permet de calculer la Average vitesse que la distance parcourue pendant une certaine période de temps, qui comprend également les phases stationnaires. Les variations de la vitesse moyenne définie par cette méthode, cependant, peut être causée soit par des différences dans le taux de migration (défini uniquement lors des phases de migration) ou par la durée de l'arrêt et des phases de migration. Ces différences dans les paramètres d'acquisition sont susceptibles de sous-tendre les différences dans les vitesses de migration des neuroblastes rapporté par différents groupes. En effectuant des acquisitions rapides avec un intervalle de 15-30 sec et de déterminer le taux de migration exclusivement pendant les phases de migration, nous avons calculé une vitesse de migration de 120-150 um / h 4, 12, tandis que d'autres groupes, qui utilisent un intervalle d'acquisition de 3-7 min rapporté une vitesse de 50-100 um / h 14, 15, 18. Le principal inconvénient de grand champ imagerie de fluorescence avec des caméras CCD est qu'il fournit une résolution spatiale inférieure que les systèmes de numérisation. Cependant, depuis la migration des neuroblastes ont un compact MORPhology avec soma et courtes processus menant, une plus faible résolution spatiale n'empêche pas l'identification fiable et le suivi des neuroblastes au niveau des corps cellulaires et les processus menant même (figure 3 et Vidéos 1 et 2).
La technique que nous décrivons ici permet la migration des neuroblastes dans un microenvironnement étroitement imitant des conditions in vivo à analyser les interactions entre les différentes composantes du RMS à étudier, et le rôle de ces interactions dans la migration des neuroblastes à étudier.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par les Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC) subvention pour ASJK a été partiellement financé par une bourse de l'Université Laval. AS est le titulaire d'une chaire de recherche du Canada en neurogenèse postnatale.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Glucose (ACSF) | EMD | DX0145-3 | |
| NaCI | Sigma | S9625 | |
| KCI | Sigma | P9541 | |
| MgCI2x6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| NaH2PO4xH2O | EMD | SX0710-1 | |
| CaCI2x2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| Dextran TexasRed | Invitrogen | D1864 | |
| Dextran CascadeBlue | Invitrogen | D1976 | |
| Glucose (40X solution) | Sigma | G8769 | |
| Sodium pyruvat | Gibco | 11360-070 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| HBSS | Gibco | 14170-112 | |
| DNase I | Sigma | D-5025 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| BSA | EMD | 2930 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | |
| Ketamine/Xylazine | CDMV | 5230 | |
| Pasteur pipette | VWR | 14672-380 | |
| 15 ml conical tube | Sarstedt | 62.553.205 | |
| 50 ml conical tube | Sarstedt | 62.547.205 | |
| Glass capillaries (stereotaxic injection) | WPI | 4878 | |
| Paraffin oil | EMD | PX0045-3 | |
| Proviodine | Rougier | 65655-1370 | |
| Suture | Stoelting | 50487 | |
| Anafen | CDMV | 11508 | |
| 20 cc Syringe | VWR | SS-20L2 | |
| Petri dish | VWR | 25384-094 | |
| Agar | Laboratoire Mat | AP-0108 | |
| Glue | Permabond | 910 | |
| 95% O2/5% CO2 | Linde | 24068835 | |
| Blade | WPI | 501901 | |
| Nylon mesh | Warner Instruments | 64-0198 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 000.019 | |
| Pipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Nanoliter injector | WPI | B203MC4 | |
| Stereotaxic injection apparatus | WPI | 502900 | |
| Micro drill system | WPI | 501819 | |
| Vibratome | Thermo Scientific | 920110 | |
| Wide-field fluorescent microscope | Olympus | BX61WIF | |
| CCD camera | Photometrics | CS-HQ2-D | |
| Ultra-quiet imaging chamber | Harvard Apparatus | 64-1487 | |
| PH-1 Series 20 heater platform | Harvard Apparatus | 64-0284 | |
| Heating system | Warner Instruments | TC-344B | |
| 40X water immersion objective | Olympus | 1-UM587 | |
| 10X water immersion objective | Olympus | 1-UM583 | |
| Lambda DG-4 | Sutter Instruments | DG-4/OF | |
| MetaMorph software | Molecular Devices | 40000 | |
| Imaris software | Bitplane | BPI-IM70-F1 |
References
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