Summary
Si descrive un protocollo per tempo reale videoimaging della migrazione neuronale nel proencefalo mouse. La migrazione di viralmente-etichettati o innestate precursori neuronali è stata registrata in fettine acute vivo utilizzando ampio campo dell'imaging fluorescente con un intervallo di acquisizione relativamente rapido per studiare le diverse fasi di migrazione cellulare, comprese le durate delle fasi stazionaria e migrazione e la velocità di migrazione.
Abstract
Vi è un sostanziale corpo di prove che indicano che i nuovi neuroni funzionali sono costitutivamente generati da un pool endogeno delle cellule staminali neurali nelle aree riservate del cervello dei mammiferi adulti. Neuroblasti Newborn dalla zona subventricolare (SVZ) migrano lungo il torrente migratorio rostrale (RMS) per la loro destinazione finale nel bulbo olfattivo (OB) 1. Nel RMS, neuroblasti migrano tangenzialmente in catene ensheathed da processi astrocitari 2,3 utilizzando vasi sanguigni come supporto strutturale e una fonte di fattori molecolari richiesti per la migrazione 4,5. Nel OB, neuroblasti staccare dalle catene e migrano radialmente negli strati differenti bulbari dove si differenziano in interneuroni e integrare nella rete esistente 1, 6.
In questo manoscritto si descrive la procedura per la migrazione delle cellule di controllo in fettine acute del cervello dei roditori. L'uso di sezioni acute permette assessmento di migrazione cellulare nel microambiente che somiglianti a condizioni in vivo e nelle regioni del cervello che sono di difficile accesso per l'imaging in vivo. Inoltre, evita condizione lunga coltura come nel caso di colture organotipiche e cellule che possono eventualmente alterano le proprietà di migrazione delle cellule. Precursori neuronali in fettine acute possono essere visualizzate utilizzando ottiche DIC o proteine fluorescenti. Etichettatura virale dei precursori neuronali nel SVZ, innesto neuroblasti da topi reporter nella SVZ di topi wild-type, e l'utilizzo di topi transgenici che esprimono la proteina fluorescente in neuroblasti sono tutti i metodi adatti per la visualizzazione neuroblasti e dopo la loro migrazione. Il metodo seguito, tuttavia, non consente di singole celle essere monitorati per lunghi periodi di tempo a causa della elevata densità di cellule marcate. Abbiamo utilizzato un ampio campo di microscopio fluorescente verticale dotato di una fotocamera CCD per ottenere un intervallo di acquisizione relativamente rapido (uno image ogni 15 o 30 secondi) per identificare in maniera affidabile la fase stazionaria e migratori. Una identificazione precisa della durata delle fasi stazionarie e migratorio è cruciale per l'interpretazione univoca dei risultati. Abbiamo anche eseguito più z-step acquisizioni per monitorare la migrazione neuroblasti in 3D. Ampio campo di imaging a fluorescenza è stato ampiamente utilizzato per visualizzare migrazione neuronale 7-10. Qui, descriviamo protocollo dettagliato per l'etichettatura di neuroblasti, l'esecuzione in tempo reale di video-imaging della migrazione neuroblasti in fettine acute del proencefalo topo adulto, e analizzare la migrazione cellulare. Mentre il protocollo descritto esemplificato la migrazione dei neuroblasti del RMS adulto, può anche essere utilizzata per seguire la migrazione cellulare nel cervello embrionale e postnatale precoce.
Protocol
1. Etichettatura precursori neuronali
Neuroblasti possono essere visualizzati utilizzando topi transgenici che esprimono selettivamente proteine fluorescenti in neuroblasti (vale a dire, Dcx-GFP, GAD67-GFP), da stereotaxically iniettando particelle virali codificanti per proteine fluorescenti nel SVZ o RMS, o innesto precursori neuronali di topo giornalista (vale a dire , Dcx-GFP, GAD67-GFP) nella SVZ di topi wild-type. Descriviamo la procedura per l'innesto e l'etichettatura dei precursori neuronali virale.
La dissociazione dei neuroblasti dalla SVZ di topi reporter
- Le seguenti soluzioni sono necessari per dissociazione neuroblasti.
Soluzione 40X
10 ml Pen / Strept (Foto Penna 10.000 U / ml / Strept 1000 ug / ml)
10 ml di glucosio (immagine 200 mg / ml)
20 ml di sodio piruvato (Stock 100 mM)
ove_content "> 10 ml H 2 OPreparare aliquote da 1 ml
Dissezione soluzione (100 ml)
HBSS 1X - 97,4 ml
HEPES (1 M) - 0,1 ml
40X soluzione - 2,5 ml
DNasi soluzione (20K unità / ml)
DNaseI, typeIV da pancreas bovino
150.000 unità sciogliere in 7,5 ml H 2 O
Filtrata 0,22 micron
Preparare aliquote da 1 ml
Tripsina-DNaseI soluzione (10 ml)
HBSS - 8,6 ml
DNaseI (20K unità / ml) - 0,15 ml
Tripsina-EDTA (0,5%) - 1 ml
40X soluzione - 0,25 ml
Triturazione soluzione (50 ml)
S copi "> Neurobasal medio - 47.5 mlBSA (300 mg / ml) - 332,5 microlitri
40X soluzione - 1,25 ml
DNaseI (20K unità / ml) - 0,66 ml
- Anesthetize due-tre mesi topo adulto esprimere una proteina fluorescente in neuroblasti con una iniezione intraperitoneale di 100 pl di ketamina / xilazina (10 mg / 1 mg per 10 g di peso corporeo), poi decapitare. Usiamo GAD67-GFP topi 11. Utilizzando il bisturi, tagliare il cervello coronale a livello del ventricolo laterale, e sezionare la SVZ in mezzo dissezione ghiacciata. Collocare il SVZ in una provetta per microcentrifuga con 500 microlitri di soluzione di tripsina-DNasi, e mantenere in ghiaccio per 20 min.
- Trasferire il SVZ in una provetta conica da 15 ml contenente 5 ml di pre-riscaldato (37 ° C) tripsina-DNasi soluzione e incubare a 37 ° C in 5% CO 2 per 30 min.
- Trasferire l'intero contenuto in una provetta da 50 ml contenente 15 ml di tritgurazione soluzione e centrifugare a 1000 xg per 1 min. Aspirare il surnatante, aggiungere 10 ml di soluzione di triturazione, trasferire le cellule ad una nuova provetta 15 ml conica, e centrifugare a 1000 xg per 1 min.
- Fire-lucidare una pipetta Pasteur per ridurre la grandezza della punta e il cappotto con mezzo triturazione. Dopo la centrifugazione rimuovere quanto più possibile il surnatante e aggiungere 2 ml di soluzione di triturazione fresco al tubo conico. Triturare le celle della soluzione triturazione (circa 50 volte su e giù con pipetta Pasteur). Prendere la metà superiore del surnatante, che contiene cellule dissociate bene, e trasferirlo in una nuova provetta 15 ml conica contenente 10 ml di soluzione di triturazione.
- Fire-polacco una pipetta Pasteur per ridurre ulteriormente la grandezza della punta. Aggiungere un altro 1 ml di soluzione di triturazione alla provetta contenente le cellule rimanenti non dissociato, continuare la triturazione (circa 10 volte su e giù), e trasferire l'intero contenuto della containin 15 ml tubo conicocellule g precedentemente dissociati. Centrifugare a 1000 xg per 7 min. Scartare il surnatante, risospendere le cellule in pellet in 50 ml di terreno Neurobasal, carico in una camera di conteggio e contare le cellule.
Graft il numero desiderato di celle nella SVZ utilizzando la procedura descritta di seguito.
Iniezione stereotassica del virus e l'innesto di cellule dissociate
- Sterilizzare tutti gli strumenti con uno sterilizzatore tallone prima di iniziare l'intervento.
- Per iniezioni stereotassiche, utilizzare micropipette di vetro con punte molto sottili (1-2 micron) per ridurre al minimo i danni al cervello. Per effettuare una pipetta, tirare un capillare di vetro con un estrattore pipetta. Backfill la pipetta con olio di paraffina fino a metà pieno, e inserire lo stantuffo di un iniettore nanolitri (Strumenti di precisione del mondo) alla fine non trattato della pipetta.
- Utilizzo di un iniettore nanolitri controller, forzare verso il basso di olio con lo stantuffo fino a quando un piccolo drop di olio di paraffina estrude dalla punta sottile. Abbassare la pipetta in un recipiente sterile con 0,5-1 ml di una soluzione contenente sia particelle virali (1x10 6 1x10-8 TU / ml) o cellule dissociate SVZ. Utilizzare la funzione di ritirare l'iniettore nanolitri per riempire la pipetta con la soluzione desiderata. Assicurarsi che non vi siano bolle d'aria all'interno della pipetta.
- Anesthetize da due a tre mesi C57Bl adulti / 6 del mouse con una iniezione intraperitoneale di ketamina / xilazina. Utilizzare un rasoio elettrico per radersi il sito chirurgico sulla testa. Pulire bene con una garza umida per rimuovere tutti i capelli aderente.
- Posizionare il mouse su un telaio stereotassico e fissare la testa. Lavare i capelli senza sito di iniezione con sapone disinfettante (Hibitane) e poi con il 70% di alcool (garza o spray). Disinfettare il sito con Proviodine (garza o spray) e coprire l'animale con un campo chirurgico.
- Fai una piccola incisione nella pelle sterilizzato del mouse, e con attenzione diffondere la pelle per esporreil cranio sottostante. Asciugare la superficie del cranio. Utilizzare il bregma linea mediana e come le coordinate zero per impostare le anterio-posteriore (AP) e medio-laterale (ML) coordinate stereotassiche, rispettivamente.
- Praticare un piccolo foro nel cranio su ogni emisfero alle coordinate appropriato. Evitare di danneggiare il tessuto sottostante cervello. Praticare con attenzione fino a che solo l'osso è stato violato. Pulire il foro e impostare le coordinate zero per le dorso-ventrale (DV) coordinate stereotassiche sulla superficie del cervello. Usiamo a seguito di coordinate (in mm) per preparazioni iniettabili nel SVZ o RMS di adulti (22-24 g) topi C57BL / 6: per SVZ: AP 0.70, 1.20 e DV ML 1,90, per RMS: AP 2.55, ML 0,82 e DV 3.15.
- Inserire lentamente la punta micropipetta di vetro nel cervello utilizzando le coordinate appropriate DV come guide, e lentamente iniettare una piccola quantità (si inietta 100-500 nl a 5 Nl / sec) della sospensione cellulare (dissociato dal SVZ di topi reporter) o un soluzione contenente particelle virali. Noi di solito utilizzarelentivirale o particelle retrovirali 1x10 1x10 6-8 TU / ml.
- Estrarre lentamente la micropipetta di vetro, suturare la pelle sul cranio, e posizionare il mouse su una piastra elettrica per un recupero più rapido. Quando il mouse si sveglia dopo l'intervento chirurgico, somministrare un analgesico (ketaprofen 10 mg / kg, SC, 1 iniezione al giorno per 3 giorni post-op).
2. Preparazione fette acuta
- Le seguenti soluzioni sono tenuti a preparare le fette acuta: a) un artificiale liquido cerebro-spinale (ACSF) saccarosio soluzione basata, in appresso denominata soluzione di taglio, in cui viene sostituito da NaCl saccarosio per smorzare aumento dell'eccitazione neuronale durante la procedura di preparazione fetta, e b) ACSF contenente NaCl, riscaldata a 32 ° C in un bagno d'acqua, nella quale sono trasferiti fette e mantenuto fino imaging.
- Le soluzioni contengono (in mM): soluzione di taglio: 210,3 saccarosio, 3 KCI, 1.3 MGCI 2 x6H 2 O, 2 CACI 2 2 O 26 NaHCO 3, 1,25 NaH 2 PO 4, 20 glucosio; ACSF: 125 NaCl, 3 KCI, 1,3 MGCI x6H 2 O 2, 2 CACI 2 x2H 2 O, 26 NaHCO 3, 1,25 NaH 2 PO 4, 20 glucosio. Mantenere le soluzioni a pH 7,3-7,4, e continuamente ossigenare facendo gorgogliare con 95% O 2/5% di CO 2.
- Anestetizzare il mouse con una somministrazione intraperitoneale di ketamina / xilazina. Preparare ghiacciata soluzione di taglio con una gelatina-come l'apparenza con azoto liquido. Perfondere il mouse intracardiacaly con questa soluzione utilizzando una siringa da 20 cc.
- Questa procedura deve essere eseguita rapidamente, di solito 1-2 min per 20 ml di soluzione. Se i vasi sanguigni devono essere etichettati, invece di perfusione con soluzione di taglio, iniettare transcardiacally 200 pl di Dextran Texas Red (10 mg / ml) nel ventricolo sinistro del cuore e attendere 2-3 minuti prima di decapitare il mouse.
- Decapitare il mOuse, e rapidamente immergere la testa ghiacciata soluzione di taglio. Utilizzare le forbici per rimuovere il cuoio capelluto, e tagliare il cranio dal posteriore all'asse anteriore, lungo la metà del sutura sagittale dal cervelletto al OB. Rimuovere delicatamente i lembi del cranio con una pinzetta.
- Accise la parte caudale del cervello con un bisturi. Tagliare il cervello lungo la fessura intrahemispheric, e fare due tagli sagittali sulla parte più laterale di ciascun emisfero (Figura 1A). Rimuovere delicatamente il cervello con una spatola, e inserirlo nella soluzione di taglio ghiacciata.
- Posizionare i due emisferi separatamente su un blocco di agar 4% con il lato dorsale toccare la agar, e colla il blocco con i due emisferi alla piattaforma di un vibratomo. Incollare il taglio lateralmente lato dell'emisfero alla piattaforma, mantenendo lato mediale rivolto verso l'alto (Figura 1B). Collocare la piattaforma nella camera del vibratomo e riempirlo con il taglio soluzione. Mantenere la soluzione ossigenato in tutto il slipreparazione ce facendolo gorgogliare con% O 95 2/5% di CO 2.
- Preparare sezioni 250 micron di spessore utilizzando il vibratomo. Usiamo un Microm HM 650 V vibratomo (Thermo Scientific) e tagliare le fette a una frequenza di 100 Hz e una velocità di 1 mm / sec. A basse velocità di taglio e la vibrazione ad alta frequenza lama deve essere utilizzato per ottenere sezioni di alta qualità. Non appena una fetta viene rilasciato dalla lama, rimuoverla dalla soluzione di taglio e collocarlo in una camera di incubazione pieno ACSF ossigenato mantenuta a 32 ° C in un bagno d'acqua (Figura 1C).
Questa procedura deve essere eseguita il più rapidamente possibile per garantire le fette di migliore qualità.
3. Time-lapse imaging delle Migrazioni neuroblasti
L'imaging di neuroblasti migranti deve essere eseguita entro 6-8 ore di preparazione di fette e 3-10 giorni dopo l'etichettatura neuroblasti. Per evitare variazioni di parametri di migrazioneper iniezione stereotassica che possono indurre danni cerebrali e gliali attivazione uso punta sottile microelettrodi di vetro (1-2 micron) per ridurre al minimo il danno cerebrale, ed eseguire l'imaging in regioni distali dal sito di iniezione (cioè dell'immagine nella seguente RMS iniezione nel SVZ o nel RMS del bulbo olfattivo dopo iniezione nella RMS). Anche se l'immagine può essere effettuata fino a 21 giorni dopo l'iniezione di particelle lentivirali nella SVZ, si consiglia di breve post-iniezione intervallo (3-10 giorni), in quanto permette la visualizzazione e il monitoraggio di più cellule per campo di vista.
Abbiamo utilizzato un ampio campo di microscopio a fluorescenza motorizzato BX61WI (Olympus) equipaggiato con una telecamera CCD (CoolSnapHQ2, Photometrics) e un obiettivo 40X immersione in acqua con un'apertura numerica 0,8 (Olympus). Gli obiettivi con maggiore NA fornirà immagini a risoluzione migliore. Neuroblasti etichetta (innestato sia da un topo donatore giornalista o virale etichettati) sono stati eccitaticon un Lambda DG-4 dotato di una W 175 lampada allo xeno (Sutter Instruments) per 30-100 msec per acquisizione z. Multi-lunghezza d'onda di imaging può essere eseguita anche utilizzando appositi set di filtri (Chroma) per monitorare la migrazione neuronale lungo gli altri elementi cellulari del RMS, come astrociti contrassegnati in modo fluorescente o vasi sanguigni. Il microscopio, telecamera CCD e della DG-4 sono stati controllati da MetaMorph software (dispositivo Molecolare) che ha permesso ai diversi parametri di time-lapse programma di acquisizione da impostare (vedi sotto). Le fette sono state trasferite a una serie PH1 20 ultrasilenzioso di imaging camera (Harvard Apparatus) costruito sul microscopio. La camera è collegata ad un sistema automatico (TC-344B, Harvard Apparatus) ed è stato continuamente perfusi con ACSF ossigenato (Figura 1D). La temperatura nella camera è stata mantenuta a 31-33 ° C, e la portata del ACSF era 1-2 ml per min.
- Posizionare accuratamente la fetta nella camera di imaging del microscopio. Aevitare la deriva di slice durante l'imaging, che stabilizzano attentamente ponendo una rete di nylon (Warner Instruments) sulla parte superiore della fetta. La maglia è 0,12 mm e la gamma aperture 0,3-1,13 mm. Posizionamento della rete in modo che non ostruisca il campo di imaging (Figura 1D). Utilizzare un obiettivo 10X per trovare un campo di interesse, e quindi attivare l'obiettivo 40X e regolare la messa a fuoco.
- Assicurarsi che la sezione viene continuamente perfuso con ACSF e che ci sia una soluzione sufficiente tra l'obiettivo e la fetta. Le variazioni del tasso di perfusione ACSF, perfusione irregolari, o le variazioni drastiche della temperatura provoca deriva e variazioni del piano focale durante l'esposizione.
- Impostare i time-lapse parametri di acquisizione (cioè durata di eccitazione, il numero di piani z, z distanza tra ciascuna sezione, intervallo di tempo, e la durata della registrazione) utilizzando il software MetaMorph, che controlla il sistema di acquisizione e avviare il time- scadere di acquisizione. Data viene salvato automaticamente da MetaMorph come un file TIFF con ogni file corrispondente ad un punto momento della acquisizione time-lapse video.
- Eseguire l'imaging per almeno 1-2 ore e prendere in considerazione le fasi migratorie che sono interrotti da due fasi stazionarie. L'immagine può essere effettuata per un massimo di 4 ore (non ha effettuato sessioni di imaging di durata più di 4 ore) senza alcuna modifica nelle proprietà di migrazione dei neuroblasti. Non celle di immagine sulla superficie della fetta. Di solito immagine ad una profondità di 20 a 100 um. Si consiglia di utilizzare brevi intervalli di acquisizione (15 - 30 sec) per determinare in modo affidabile l'inizio e la fine della fase stazionaria e di migrazione.
- Per valutare il coinvolgimento di specifici fattori molecolari nella migrazione di precursori neuronali, ACSF normale può essere sostituito con ACSF contenente qualsiasi agente farmacologico desiderato (ad esempio, diversi agonisti, antagonisti, bloccanti, fattori di crescita, ecc.) Effettuare l'imaging per almeno1 ora in condizioni di controllo e quindi per 1 ora in presenza di agente farmacologico.
4. Analisi migrazione neuroblasti
Usiamo software Imaris (Bitplane) per analizzare i dati. Questo ci permette di monitorare automaticamente la migrazione delle cellule neonato in 3D. Il pacchetto include il Imaris 7.0F1 MeasurementsPro, Imaris Tracking, ImarisColoc, ImarisXT, filamento Tracer, e moduli Inpress.
- Per aprire il filmato in Imaris, caricare le immagini acquisite (file tiff) semplicemente trascinando l'immagine del primo punto temporale del video sull'icona del programma.
- Una volta che il filmato è stato caricato, regolare la luminosità e il contrasto del segnale nella finestra di regolazione del display, e impostare i parametri del video acquisito (dimensione voxel e l'intervallo di tempo) nelle proprietà immagine e impostare punti equidistanti tempo finestre (Fig. 4A) . Dopo aver specificato formato voxel, è possibile vedere la cornice in 3D così come il tempo e la scala delvideo.
- Per tenere traccia automaticamente le celle registrati, creare un posto per ogni cella del campo nella finestra Surpass scegliendo la funzione Spot. Seguire i passaggi, e impostare i parametri in base agli oggetti sotto forma di immagini (Figura 4B). Uno dei parametri è il diametro della cellula che può essere misurato nella finestra Slice.
- Controllare l'affidabilità degli oggetti rilevati nel tempo. Se tutte le cellule migranti non vengono rilevate automaticamente, modificare la soglia di rilevazione (Figura 4B), e verificare che tutte le cellule sono state selezionate con macchie a tutti i tempi.
- Durante l'inseguimento automatico, se due oggetti vicini punti temporali qualsiasi sovrapposizione tra le loro frontiere / bordi, una connessione traccia sarà effettuato per ogni sovrapposizione. La distanza massima e la dimensione massima distanza (Figura 4C) tra due punti rappresentano punti temporali adiacenti della stessa traccia deve essere specificata in modo che il programma può collegare il poin tempots. La distanza massima è determinata dalla distanza tra l'oggetto stesso a successivi punti temporali.
- Una volta che le tracce sono fatte, è possibile filtrare le tracce e rimuovere tracce irrilevanti semplicemente cancellandoli (Figura 4C). Le tracce possono essere corretti da collegare e scollegare diverse tracce e punti orari diversi della stessa traccia (Figura 4C).
- Una volta che tutte le correzioni sono state fatte, dai un ultimo sguardo le tracce ed esportare i dati (spostamento cellule per punto temporale, durata del brano, lunghezza di spostamento, durata della traccia, ecc) in un file di Excel (Figura 4D).
5. Risultati rappresentativi
Abbiamo testato e ottimizzato a grande campo time-lapse imaging della migrazione neuroblasti. Etichettatura virale o l'innesto delle neuroblasti fluorescente etichettati nella SVZ permesso di espressione GFP robusta in cellule migranti (Figura 2). Multi-lunghezza d'onda di imaging può be applicato per visualizzare migrazione lungo neuroblast altri elementi cellulari del RMS come destrano TexasRed-riempite vasi sanguigni 4 (Figura 3 e Film 1), astrociti contrassegnati in modo fluorescente mediante iniezione stereotassica di virus con un promotore specifico cellule gliali (Figura 2B) 12, o specificamente etichettati astrociti in animali transgenici.
Grande campo video-imaging della migrazione neuroblasti in fettine acute rivelato il comportamento saltatory di migrazione precursori neuronali costituiti da due fasi distinte: spostamento del corpo cellulare neuronale verso il processo principale separata da una fase stazionaria (Figura 3, Film 1 e 2) . Per identificare in maniera affidabile la durata delle fasi stazionarie e migratori e per derivare altri parametri di migrazione cellulare, quali la velocità di spostamento (calcolata solo durante le fasi di migrazione), è stata eseguita l'imaging in 3D utilizzando un breve intervallo di acquisizione (una volta per 15 o 30 sec). L'identificazione precisa delle durate delle fasi stazionarie e migrazione è cruciale per l'interpretazione univoca dei dati. Per esempio, differenze nella distanza di migrazione durante un dato periodo di tempo possono essere indotti da variazioni del tasso di migrazione o da modifiche nella durata o periodicità della migrazione e fasi stazionarie. Queste diverse possibilità non può essere distinto utilizzando lunghi intervalli di acquisizione.
Imaris software è stato utilizzato per analizzare la migrazione dei neuroblasti in 3D e per ricavare ulteriori parametri di migrazione cellulare come durata brano e durata del brano, nonché spostamento lunghezza della traccia, che è un vettore di spostamento. La rettilineità traccia può essere anche calcolato dividendo la lunghezza della traccia per la lunghezza di spostamento pista e indica la rettilineità del percorso migrazione di neuroblasti individuale.
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Figura 1. Rappresentazione schematica della preparazione di fettine acute vivi. A) Rappresentazione schematica di uno caudale, uno intrahemispheric e due tagli sagittali. B) Rappresentazione schematica di mettere il cervello del mouse sul blocco agar e la piattaforma della vibratomo. C) Rappresentazione schematica della camera di incubazione acuta fetta. D) Rappresentazione schematica della camera di imaging costruito sul microscopio montante.
Figura 2. Etichettatura dei neuroblasti in RMS. A) immagine ingrandimento basso mostra l'etichettatura robusto di neuroblasti e dei vasi sanguigni nell'adulto RMS. Un retrovirus codifica GFP è stato iniettato nella SVZ, e GFP-esprimenti cellule (verde) sono stati rilevati nel RMS dopo 3 giorni (pannello di sinistra). I vasi sanguigni sono stati marcati mediante iniezione di destrano TexasRed nel cuore del mouse (rosso, pannello di destra). L'inserto mostra una magnifica altaimmagine zione dei vasi sanguigni e neuroblasti viralmente etichettati associati con i vasi sanguigni. B) Etichettatura di diversi elementi cellulari nell'adulto RMS. Neuroblasti stati etichettati iniettando mCherry-codifica lentivirus nella SVZ (rosso), astrociti sono stati etichettati iniettando una codifica GFP lentivirus sotto il controllo di un promotore GFAP nel RMS (verde), e vasi sanguigni sono stati etichettati iniettando Dextran CascadeBlue (blu ) nel cuore. C) Rappresentazione schematica della iniezione di GAD67-GFP cellule dissociate dalla SVZ di un GAD67-GFP topo nella SVZ di un adulto di tipo selvatico topo. D) trapiantate cellule GAD67-GFP (verde) rilevati nei 7 giorni dopo l'innesto RMS nella SVZ. La RMS è immunostained con GFAP (blu). E) trapiantate cellule GAD67-GFP (verde) sono stati immunopositive per Dcx (rosso), ma erano immunonegative per GFAP (blu). Clicca qui per ingrandire la figura.
Figura 3. Time-lapse imaging di neuroblasti. Time-lapse imaging di neuroblasti (verde) la migrazione lungo i vasi sanguigni (rosso). Le frecce indicano le fasi di migrazione dei neuroblasti, e le frecce indicano le fasi stazionarie.
Figura 4. Analisi della migrazione neuroblasti. (AD) fasi differenti di migrazione analisi neuroblasti. I cerchi rossi indicano le diverse funzioni menzionate nel testo. Clicca qui per ingrandire la figura .
Immagini video 1. Time-lapse dei neuroblasti viralmente marcate (verde) la migrazione lungo destrano TexasRed vasi sanguigni etichettati (rosso). Cleccare qui per vedere il video.
Video 2. Monitoraggio neuroblasti migrazione da software Imaris. Punti verdi indicano corpi cellulari e le tracce indica la distanza di migrazione. Clicca qui per vedere il video .
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Discussion
La mirati corretta dei precursori neuronali alle regioni cerebrali appropriate è un processo fondamentale alla base il corretto montaggio e la funzione dei circuiti neurali. La grande maggioranza delle cellule migrano durante lo sviluppo embrionale e nel cervello postnatale solo in alcune regioni, come la OB, giro dentato e cervelletto, spostamento neuronale avviene ancora. I meccanismi orchestrando la migrazione delle cellule nel cervello postnatale rimangono, tuttavia, poco conosciuto. La conoscenza dei meccanismi e le vie molecolari coinvolti nel guidare la migrazione delle cellule in tessuti nervosi maturi migliorerà la nostra comprensione di un orientamento neuronale nel cervello post-natale e può avere rilevanza clinica per lo sviluppo di nuove strategie per indurre il reclutamento neuronale in zone malate del cervello.
In questo manoscritto, si descrive un protocollo per il monitoraggio della migrazione cellulare in fettine acute del proencefalo topo adulto. Mentre abbiamo usato l'adulto SVZ-OBpathway come sistema modello, la stessa tecnica può essere applicata a seguire la migrazione cellulare nel cervello embrionale e postnatale nonché nel cervello adulto dopo lesioni. Abbiamo usato questo protocollo per seguire la migrazione delle cellule nei primi anni dopo la nascita RMS 12, cervelletto e adulti post-ictus striato (Eiriz, Grado, Malva e Saghatelyan, dati non pubblicati).
Imaging della migrazione neuroblasti è stata effettuata utilizzando acuti fette dal vivo che permettono la migrazione delle cellule da studiare in un microambiente che imita da vicino le condizioni in vivo. Migrazione di cellule sono state visualizzate mediante iniezioni stereotassiche di particelle virali o innesto neuroblasti da topi reporter nella SVZ di topi wild-type. L'analisi è stata eseguita la migrazione lontano dal sito di iniezione. Per studiare la migrazione tangenziale in RMS, abbiamo preparato fettine acute 3-5 giorni dopo che i neuroblasti sono stati etichettati. Per studiare la migrazione radiale nell'OB, le fette sono state preparate 7-10 giorni dopo la steiniezione reotaxic nella SVZ. Mira virale dei precursori neuronali nel SVZ adulto può essere utilizzato anche per studiare e modulare i fattori coinvolti nel processo di migrazione o upregulating downregulating specifici segnali molecolari. È anche possibile etichettare diversi tipi di cellule in RMS ed eseguire multi-lunghezza d'onda di imaging a dipanare il modello di migrazione neuroblasti lungo i vasi sanguigni traccianti riempite 4, 13 o astrociti lungo viralmente o geneticamente etichettati 2, 12.
Per la migrazione immagine neuroblasti abbiamo usato un microscopio a fluorescenza in posizione verticale motorizzato dotato di una fotocamera CCD che ha permesso acquisizioni relativamente rapidi a diversi piani z seguenti impulsi brevi (30-100msec) della luce di eccitazione. Ciò ha impedito photobleaching ed è diminuito l'intervallo di tempo tra due successive acquisizioni, senza interferire con la visualizzazione 3D della migrazione neuroblasti. Altri gruppi hanno utilizzato microscopi confocale a due fotoni o per monitorare migr cellazione nel postnatale RMS 14-16. Entrambe le tecniche hanno i loro vantaggi e limiti, che sono principalmente relativi a questioni temporali e spaziali risoluzioni. Si consiglia di utilizzare brevi intervalli di tempo (15-30 secondi) tra le acquisizioni successive. Neuroni appena nati hanno un comportamento a salti, e le fasi di migrazione sono interrotti da periodi di sosta che possono essere il più breve 4-10 min 4. Dato questo tipo di migrazione, è importante utilizzare intervalli di acquisizione relativamente rapido (15-30 secondi) tra i punti temporali successive affidabile per identificare l'inizio e la fine della migrazione e fasi stazionarie. Questo è difficile da ottenere quando l'intervallo di tempo tra due successive acquisizioni è nell'intervallo di alcuni minuti. Una determinazione precisa delle fasi stazionarie e migrazione è necessario per definire univocamente la velocità di migrazione neuroblasti, che dovrebbe essere quantificato solo durante le fasi di migrazione 4, 17. Lunghi intervalli di acquisizione permette di calcolare la Averagvelocità e la distanza percorsa in un certo periodo di tempo che comprende anche fasi stazionarie. Cambiamenti nella velocità media definita da questo metodo, tuttavia, può essere causata da differenze nel tasso di migrazione (definito solo durante le fasi di migrazione) o dalla durata del fermo e fasi di migrazione. Queste differenze nei parametri di acquisizione è probabile che alla base delle differenze in termini di velocità di migrazione neuroblasti riportato da diversi gruppi. Eseguendo acquisizioni rapide con un intervallo di 15-30 secondi e la determinazione del tasso di migrazione esclusivamente durante le fasi di migrazione, abbiamo calcolato una velocità di migrazione di 120-150 micron / h 4, 12, mentre altri gruppi, che fanno uso di un intervallo di acquisizione di 3-7 min riportato una velocità di 50-100 micron / h 14, 15, 18. Il principale inconveniente di ampio campo dell'imaging fluorescente con telecamere CCD è che essa fornisce una risoluzione inferiore rispetto ai sistemi di scansione spaziale. Tuttavia, da neuroblasti migrano hanno un compatto PROMhology con soma e brevi processi che portano, una risoluzione inferiore spaziale non osta alla corretta identificazione e la tracciabilità dei neuroblasti a livello dei corpi cellulari e dei processi anche importanti (Figura 3 e video 1 e 2).
La tecnica che descriviamo qui consente la migrazione neuroblasti in un microambiente mimando le condizioni in vivo da analizzare, le interazioni tra i vari componenti del RMS da studiare, e il ruolo di queste interazioni nella migrazione neuroblasti da indagare.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da un Istituti canadesi di ricerca sulla salute (CIHR) concede ASJK è stato in parte sostenuto da una borsa di studio Université Laval. AS è il destinatario di un Canada Research Chair in neurogenesi postnatale.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Glucose (ACSF) | EMD | DX0145-3 | |
| NaCI | Sigma | S9625 | |
| KCI | Sigma | P9541 | |
| MgCI2x6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| NaH2PO4xH2O | EMD | SX0710-1 | |
| CaCI2x2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| Dextran TexasRed | Invitrogen | D1864 | |
| Dextran CascadeBlue | Invitrogen | D1976 | |
| Glucose (40X solution) | Sigma | G8769 | |
| Sodium pyruvat | Gibco | 11360-070 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| HBSS | Gibco | 14170-112 | |
| DNase I | Sigma | D-5025 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| BSA | EMD | 2930 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | |
| Ketamine/Xylazine | CDMV | 5230 | |
| Pasteur pipette | VWR | 14672-380 | |
| 15 ml conical tube | Sarstedt | 62.553.205 | |
| 50 ml conical tube | Sarstedt | 62.547.205 | |
| Glass capillaries (stereotaxic injection) | WPI | 4878 | |
| Paraffin oil | EMD | PX0045-3 | |
| Proviodine | Rougier | 65655-1370 | |
| Suture | Stoelting | 50487 | |
| Anafen | CDMV | 11508 | |
| 20 cc Syringe | VWR | SS-20L2 | |
| Petri dish | VWR | 25384-094 | |
| Agar | Laboratoire Mat | AP-0108 | |
| Glue | Permabond | 910 | |
| 95% O2/5% CO2 | Linde | 24068835 | |
| Blade | WPI | 501901 | |
| Nylon mesh | Warner Instruments | 64-0198 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 000.019 | |
| Pipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Nanoliter injector | WPI | B203MC4 | |
| Stereotaxic injection apparatus | WPI | 502900 | |
| Micro drill system | WPI | 501819 | |
| Vibratome | Thermo Scientific | 920110 | |
| Wide-field fluorescent microscope | Olympus | BX61WIF | |
| CCD camera | Photometrics | CS-HQ2-D | |
| Ultra-quiet imaging chamber | Harvard Apparatus | 64-1487 | |
| PH-1 Series 20 heater platform | Harvard Apparatus | 64-0284 | |
| Heating system | Warner Instruments | TC-344B | |
| 40X water immersion objective | Olympus | 1-UM587 | |
| 10X water immersion objective | Olympus | 1-UM583 | |
| Lambda DG-4 | Sutter Instruments | DG-4/OF | |
| MetaMorph software | Molecular Devices | 40000 | |
| Imaris software | Bitplane | BPI-IM70-F1 |
References
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