Summary
Vi beskriver en protokoll for real-time videoimaging av neuronal migrasjon i musen forebrain. Migreringen av virally-merkede eller podet neuronal forløpere ble registrert i akutte levende stykker med vid-feltet fluorescerende avbildning med en relativt rask oppkjøp intervall å studere de forskjellige faser av celle migrasjon, herunder varighetene av den stasjonære og migrasjon faser og hastigheten migrasjon.
Abstract
Det er en betydelig mengde bevis som indikerer at nye funksjonelle nerveceller er konstitutivt generert fra en endogen pool av nevrale stamceller i avgrensede områder av den voksne hjernen hos pattedyr. Nyfødte neuroblasts fra subventricular sone (SVZ) vandrer langs rostral vandrende strøm (RMS) til sin endelige destinasjon i luktelappen (OB) 1. I RMS, neuroblasts migrere tangentielt i kjedene ensheathed etter astrocytic prosesser 2,3 bruker blodkar som en strukturell støtte og en kilde for molekylær faktorer som kreves for migrasjon 4,5. I OB, neuroblasts løsner fra kjedene og migrere radialt inn i de forskjellige slagflaten lagene der de differensieres til interneurons og integrere i eksisterende nettverk 1, 6.
I dette manuskriptet beskriver vi fremgangsmåten for overvåking cellemigrering i akutte stykker av gnager hjernen. Bruken av akutte stykker lar assessment av cellemigrering i mikromiljøet som tett ligner til in vivo forhold og i hjernen som er vanskelig å få tilgang til for in vivo avbildning. I tillegg unngår den lang dyrking stand som i tilfelle av organotypic og cellekulturer som kan til slutt endre migrasjon egenskapene til cellene. Neuronal forløpere i akutte skiver kan visualiseres ved hjelp av DIC optikk eller fluorescerende proteiner. Viral merking av nevrale forløpere i SVZ, pode neuroblasts fra reporter mus i SVZ av vill-type mus, og bruker transgene mus som uttrykker fluorescerende protein i neuroblasts er alle egnede metoder for å visualisere neuroblasts og følge deres migrasjon. Den senere fremgangsmåte er imidlertid ikke tillater enkeltceller spores over lengre tid på grunn av den høye tettheten av merkede celler. Vi brukte et bredt felt fluorescerende oppreist mikroskop utstyrt med et CCD-kamera for å oppnå en relativt hurtig oppkjøp intervall (en image hver 15 eller 30 sek) for å pålitelig identifisere den stasjonære og trekkende faser. En presis identifisering av varigheten av de stasjonære og vandrende faser er avgjørende for entydig tolkning av resultatene. Vi har også utført flere z-trinn oppkjøp for å overvåke neuroblasts migrasjon i 3D. Wide-field fluorescerende imaging har blitt brukt mye til å visualisere neuronal migrasjon 7-10. Her beskriver vi detaljert protokoll for merking neuroblasts, utføre real-time video-avbildning av neuroblast migrasjon i akutte skiver av den voksne mus forebrain, og analysere celle migrasjon. Mens den beskrevne protokoll eksemplifiseres migrering av neuroblasts i den voksne RMS, kan den også brukes til å følge cellemigrering i embryonale og tidlig postnatale hjerner.
Protocol
1. Merking Neuronal Forstadier
Neuroblasts kan visualiseres ved hjelp av transgene mus som selektivt uttrykker fluorescerende proteiner i neuroblasts (dvs. DCX-GFP, Gad67-GFP), etter stereotaxically injisere viruspartikler koder fluorescerende proteiner i SVZ eller RMS, eller ved å pode nevrale forløpere fra reporter mus (dvs. , DCX-GFP, Gad67-GFP) i SVZ av vill-type mus. Vi beskriver prosedyren for pode og viral merking av neuronmembraner forløpere.
Dissosiasjon av neuroblasts fra SVZ av reporter mus
- Følgende løsninger krever neuroblast dissosiasjon.
40X løsning
10 ml Pen / strept (Stock Pen 10.000 u / ml / strept 1000 ug / ml)
10 ml Glukose (Stock 200 mg / ml)
20 ml Natrium Pyruvat (Stock 100 mM)
ove_content "> 10 ml H 2 OForbered 1 ml alikvoter
Disseksjon oppløsning (100 ml)
HBSS 1X - 97,4 ml
HEPES (1 M) - 0,1 ml
40X løsning - 2,5 ml
DNase-løsning (20K enheter / ml)
DNaseI, typeIV fra storfe bukspyttkjertelen
150.000 enheter løses i 7,5 ml H 2 O
Filtrert 0,22 mikrometer
Forbered 1 ml alikvoter
Trypsin-DNaseI oppløsning (10 ml)
HBSS - 8,6 ml
DNaseI (20K enheter / ml) - 0,15 ml
Trypsin-EDTA (0,5%) - 1 ml
40X løsning - 0,25 ml
Triturering oppløsning (50 ml)
ntent "> Neurobasal medium - 47,5 mlBSA (300 mg / ml) - 332,5 pl
40X løsning - 1,25 ml
DNaseI (20K enheter / ml) - 0,66 ml
- Anesthetize to til tre måneder gamle voksen mus uttrykker en fluorescerende protein i neuroblasts med en intraperitoneal injeksjon av 100 ul av ketamin / xylazin (10 mg / 1 mg per 10 g kroppsvekt), deretter halshogge. Vi bruker GAD67-GFP mus 11. Bruke skalpell, slice hjernen coronally på nivået av den laterale ventrikkel, og dissekere ut SVZ i iskaldt disseksjon medium. Plasser SVZ i mikrosentrifugerør med 500 pl trypsin-DNase-løsning, og holde på is i 20 min.
- Overfør SVZ inn i en 15 ml konisk rør inneholdende 5 ml forvarmet (37 ° C) trypsin-DNase-løsning og inkuberes ved 37 ° C i en 5% CO 2 i 30 min.
- Overføre hele innholdet i en 50 ml konisk rør inneholdende 15 ml av trituration løsning og sentrifuger ved 1000 xg i 1 min. Aspirer supernatanten, tilsett 10 ml utgnidning løsning, overføre cellene til en ny 15 ml konisk rør og sentrifuger ved 1000 xg i 1 min.
- Brann-polere en Pasteur pipette for å redusere dysestørrelse og frakk med utgnidning medium. Etter sentrifugering fjerne så mye av supernatanten som mulig, og tilsett 2 ml frisk triturering løsning på konisk tube. Triturate cellene i trituration løsning (omtrent 50 ganger opp og ned med Pasteur pipette). Ta den øvre halvdelen av supernatanten, som inneholder godt dissosierte celler, og overføre den til en ny 15 ml konisk rør inneholdende 10 ml av utgnidning oppløsning.
- Brann-polish en Pasteur pipette for å redusere ytterligere spissen størrelse. Legge til en annen 1 ml trituration løsning på røret som inneholder de resterende undissociated celler, fortsetter triturering (omtrent 10 ganger opp og ned), og overfører hele innholdet til 15 ml konisk tube containing tidligere dissosierte celler. Sentrifuger ved 1000 xg i 7 minutter. Kast supernatanten, resuspendere de pelleterte celler i 50 ml neurobasal medium, last inn i et tellekammer, og telle cellene.
Pode ønsket antall celler i SVZ ved hjelp av fremgangsmåten som er beskrevet nedenfor.
Stereotaksiske injeksjon av viruset og pode av dissosierte celler
- Sterilisere alle instrumentene med en perle sterilizer før operasjonen.
- For stereotaksiske injeksjoner, bruke glass mikropipetter med svært tynne tips (1-2 mikrometer) for å minimere hjerneskade. Å lage en pipette, trekker et glass kapillær med en pipette avtrekker. Tilbakefylling pipetten med parafin olje til halv full, og sett stempelet av en nanoliter injektoren (World Precision Instruments) i ubehandlet enden av pipetten.
- Ved hjelp av en nanoliter injektor kontrolleren, presse oljen nedover med stempelet til en liten DROp av parafin olje profilselskap fra den tynne tuppen. Senk pipetten i en steril beholder med 0,5 til 1 pl av en oppløsning inneholdende enten viruspartikler (1x10 6-1x10 8 TU / ml) eller dissosierte SVZ celler. Bruk trekke funksjon nanoliter injektoren å fylle pipetten med ønsket oppløsning. Pass på at det ikke er noen luftbobler inne i pipetten.
- Anesthetize to til tre måneder gamle voksen C57BL / 6 mus med en intraperitoneal injeksjon av ketamin / xylazin. Bruk en elektrisk barbermaskin til å barbere det kirurgiske området på hodet. Rengjør godt med våt gasbind for å fjerne tilhenger hår.
- Plasser musen på en stereotaksiske ramme og fikse hodet. Vaske håret-free injeksjonsstedet med desinfiserende såpe (Hibitane) og deretter med 70% alkohol (gasbind eller spray). Desinfiser området med Proviodine (gasbind eller spray) og dekke dyret med en kirurgisk felt.
- Lag et lite snitt i den steriliserte huden av musen, og nøye spre huden å eksponereden underliggende skallen. Tørke overflaten av skallen. Bruk bregma og midtlinjen som null koordinater for å angi anterio-posterior (AP) og medio-lateral (ML) stereotaksiske koordinater, henholdsvis.
- Lag et lite hull i skallen over hver halvkule på riktig koordinater. Unngå å skade den underliggende hjernevev. Bor forsiktig til bare benet har blitt brutt. Rengjør hullet og angi null koordinater for de dorso-ventrale (DV) stereotaksiske koordinater på overflaten av hjernen. Vi bruker følgende koordinater (i mm) til injeksjon i SVZ eller RMS av voksen (22-24 g) C57BL / 6 mus: for SVZ: 0.70 AP, ML 1,20 og DV 1,90, for RMS: 2,55 AP, ML 0,82 og DV 3.15.
- Langsomt sette glasset mikropipette tuppen inn i hjernen ved hjelp av den tilhørende DV koordinater som guider, og injiser langsomt en liten mengde (vi injiserer 100-500 nl ved 5 nl / sek) cellesuspensjon (dissosiert fra SVZ av rapportørgrupper mus) eller en oppløsning inneholdende virale partikler. Vi bruker vanligvislentiviral eller retroviral partikler 1x10 6-1x10 8 TU / ml.
- Trekk sakte glass mikropipette sy huden over skallen, og plassere musen på en varmepute for raskere restitusjon. Når musen våkner etter operasjonen, administrere et smertestillende (ketaprofen 10 mg / kg, SC, en injeksjon per dag i løpet av 3 dager post-op).
2. Forbereder Akutte Slices
- Følgende løsninger er nødvendig for å fremstille akutte stykker: a) en kunstig cerebrospinalvæsken (ACSF) sukrose-basert løsning, heretter referert til som kutte løsningen der NaCl erstattes av sukrose for å dempe økt nevronale eksitabilitet under stykket forberedelse prosedyren, og b) ACSF inneholdende NaCl, oppvarmet til 32 ° C i et vannbad, i hvilke skiver er overført og opprettholdt inntil bildebehandling.
- Løsningene inneholde følgende (i mM): skjæring løsning: 210,3 sukrose, 3 KCI, 1,3 MgCI 2 x6H 2 O, 2 CACI 2 2 O 26 3 NaHCO, 1,25 NaH 2 4 PO, 20 glukose, ACSF: 125 NaCl, 3 KCI, 1,3 MgCI 2 x6H 2 O, 2 CACI 2 x2H 2 O, 26 3 NaHCO, 1,25 NaH 2 PO 4, 20 glukose. Oppretthold løsningene ved en pH av 7,3 til 7,4, og kontinuerlig oksygenat ved bobling dem med 95% O 2/5% CO2.
- Anesthetize musen med en intraperitoneal administrasjon av ketamin / xylazin. Forbered iskald skjæring løsning med en gelé-lignende utseende ved bruk av flytende nitrogen. Perfuse musen intracardiacaly med denne løsningen ved hjelp av en 20-cc sprøyte.
- Denne prosedyren skal utføres raskt, vanligvis 1-2 min for 20 ml oppløsning. Hvis blodårene må merkes, istedenfor perfusing med klippeutstyr løsningen, injiserer transcardiacally 200 ul Dextran Texas Red (10 mg / ml) inn i den venstre ventrikkel av hjertet og vent 2-3 min før decapitating musen.
- Halshogge den mOuse, og raskt fordype hodet i iskaldt cutting løsning. Bruk saks til å fjerne hodebunnen, og kutte skallen fra bakre til fremre aksen langs midten sagital sutur fra lillehjernen til OB. Forsiktig fjerne den kraniale flaps med pinsett.
- Avgiftsdirektoratet caudal delen av hjernen ved hjelp av en skalpell. Skjær hjernen langs intrahemispheric sprekken, og lage to sagittale kutt på den mest laterale delen av hver halvkule (Figur 1A). Fjern forsiktig hjernen ved hjelp av en slikkepott, og legg den i iskaldt cutting løsning.
- Plasser de to halvkuler separat på en 4% agar blokk med dorsal side berøre agar, og lim blokken med de to halvkuler til plattformen av en vibratome. Lim sideveis kutte siden av halvkule til plattformen, holde medial siden opp (figur 1B). Plasser plattformen i kammeret i vibratome og fylle det med å kutte løsning. Holde løsningen oksygenert hele SLIce forberedelse av boblende det med 95% O 2/5% CO 2.
- Forbered 250 mikrometer tykke seksjoner ved hjelp av vibratome. Vi bruker en mikroM HM 650 V vibratome (Thermo Scientific) og kutte stykker ved en frekvens på 100 Hz og en hastighet på 1 mm / sek. En lav skjærehastighet og høyfrekvent blad vibrasjoner bør benyttes for å oppnå høy kvalitet seksjoner. Så snart et stykke frigjøres fra bladet, fjerner du det forsiktig fra kniven løsning og plassere den i en inkubasjonstid kammer fylt med oksygenrikt ACSF opprettholdt ved 32 ° C i vannbad (figur 1C).
Denne prosedyren skal utføres så raskt som mulig for å sikre den beste kvaliteten skiver.
3. Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration
Avbildning av vandrende neuroblasts bør utføres innen 6-8 timer av utarbeidelse av skiver og 3-10 dager etter neuroblasts merking. Å unngå endringer i migrasjon parameterepå grunn av stereotaksiske injeksjon som kan indusere hjerneskade og glial aktivering bruke tynne spisser glass microelectrodes (1-2 mikrometer) for å minimere hjerneskade, og utfører bildebehandling i regionene distale fra injeksjonsstedet (dvs. bilde i RMS følgende injeksjon i SVZ eller i RMS luktelappen etter injeksjon i RMS). Selv om bildebehandling kan utføres inntil 21 dager etter injeksjon av lentiviral partikler i SVZ, anbefaler vi kortere etter injeksjon intervall (3-10 dager) siden det gir visualisere og sporing flere celler per synsfelt.
Vi brukte et bredt felt fluorescerende motorisert BX61WI mikroskop (Olympus) utstyrt med et CCD-kamera (CoolSnapHQ2, fotometriske) og en 40X vann nedsenking objektivet med et 0,8 numerisk apertur (Olympus). Målene med høyere NA vil gi bedre oppløsning. Merkede neuroblasts (podet enten fra en reporter donor mus eller virally merket) var glademed en Lambda DG-4 er utstyrt med en 175 W xenon lampe (Sutter Instruments) for 30-100 msek per z oppkjøpet. Multi-bølgelengde avbildning kan også utføres ved hjelp av egnede filtersett (Chroma) for å spore nevronale migrasjon langs de andre cellulære elementer i RMS, som fluorescensmerkede astrocytes eller blodårer. Mikroskop, CCD kamera og DG-4 ble kontrollert av MetaMorph programvare (Molecular Device) som tillot forskjellige parametere time-lapse anskaffelsesprogram settes (se nedenfor). Sektorene ble overført til en PH1 Series 20 ultrastille bildebehandling kammer (Harvard Apparatus) bygget på mikroskopet. Kammeret ble koblet til en automatisk varmesystem (TC-344B, Harvard Apparatus) og ble kontinuerlig perfundert med oksygenrikt ACSF (figur 1D). Temperaturen i kammeret ble holdt ved 31-33 ° C, og strømningshastigheten av den ACSF var 1-2 ml per min.
- Forsiktig plassere stykket i bildebehandling kammer av mikroskop. Tilunngå drivende av stykke under avbildning, stabilisere det ved forsiktig å plassere en nylon mesh (Warner Instruments) på toppen av skiven. Maskene er 0,12 mm tykk og åpninger utvalget 0,3 til 1,13 mm. Plasser mesh slik at det ikke hindrer bildebehandling feltet (Figur 1D). Bruk en 10X mål å finne et felt av interesse, og deretter engasjere 40X objektiv og justere fokus.
- Sørg for at stykket er kontinuerlig perfused med ACSF og at det er nok løsning mellom objektiv og stykket. Endringer i frekvensen av ACSF perfusjon, uregelmessig perfusjon eller drastiske temperaturvariasjoner forårsaker avdrift og endringer i fokalplanet under avbildning.
- Still time-lapse oppkjøpet parametre (dvs. varighet eksitasjon, antall z fly, avstand mellom hver z-delen, tidsintervall, og varigheten på opptaket) ved hjelp av MetaMorph programvare som styrer innsamlingssystem og starte tid- forfalle oppkjøpet. Data lagres automatisk av MetaMorph som en tiff-filer med hver fil som tilsvarer én gang poenget med ervervet time-lapse video.
- Utfør bildebehandling for minst 1-2 timer og ta hensyn til trekkende faser som blir avbrutt av to stasjonære faser. Imaging kan utføres for inntil 4 timers (vi ikke utfører bildebehandling økter som varer mer enn 4 timer) uten endringer i migrasjonen egenskapene til neuroblasts. Gjøre ikke bilde celler på overflaten av stykket. Vi vanligvis image på en dybde på 20 til 100 mikrometer. Vi anbefaler å bruke korte oppkjøp intervaller (15 - 30 sek) til pålitelig bestemme begynnelsen og slutten av den stasjonære og migrasjon faser.
- For å vurdere involvering av spesifikke molekylære faktorer i migrasjon av nevrale forløpere, kan normal ACSF erstattes med ACSF inneholder noen ønsket farmakologisk agent (dvs. ulike agonister, antagonister, betablokkere, vekstfaktorer, osv.). Utføre bildebehandling for minst1 hr i kontroll tilstand og deretter i 1 time i nærvær av den farmakologiske middel.
4. Analysere Neuroblast Migration
Vi bruker Imaris programvare (Bitplane) for å analysere dataene. Dette gir oss muligheten til å automatisk spore nyfødt celle migrasjon i 3D. Den Imaris 7.0F1 pakken inkluderer MeasurementsPro, Imaris Tracking, ImarisColoc, ImarisXT, Filament Tracer, og InPress moduler.
- Å åpne filmen i Imaris, legger de oppkjøpte bilder (tiff-filer) ved å dra og slippe bildet av den første gangen punktet i videoen på programmets ikon.
- Når filmen er lastet, justere lysstyrken og kontrasten på signalet i vinduet justering vinduet, og sette parametre i den overtatte video (voxel størrelse og tidsintervall) i Bildeegenskaper og Set like langt tid poeng vinduer (Fig. 4A) . Etter å ha angitt den voxel størrelsen, er det mulig å se en ramme i 3D samt tiden og omfanget avvideo.
- Å automatisk spore innspilte celler, lage et sted for hver celle i feltet i overgå vinduet ved å velge Spots funksjonen. Følg fremgangsmåten, og sette parametre basert på den avbildede objekter (figur 4B). En av parametrene er diameteren av den celle som kan måles i Slice vinduet.
- Inspisere påliteligheten av oppdagede objekter over tid. Hvis alle de trekkende cellene ikke oppdages automatisk, endre terskelen for påvisning (figur 4B), og sørg for at alle cellene er valgt med flekker på alle tidspunkter.
- Under den automatiske avspillingen, hvis to objekter fra nabokommunene tidspunkter har noen overlapping mellom deres grenser / kanter, vil et spor tilkobling gjøres for hver overlapping. Den maksimale avstanden og maksimal gap størrelse (Figur 4C) mellom to flekker representerer tilgrensende tidspunkt på samme spor må spesifiseres slik at programmet kan koble tiden points. Den maksimale avstanden bestemmes av avstanden mellom det samme objektet ved etterfølgende tidspunkter.
- Når sporene er gjort, er det mulig å filtrere sporene og fjerne irrelevante spor ved å slette dem (Figur 4C). Spor kan rettes opp ved tilkobling og frakobling ulike spor og ulike tidspunkt på samme spor (figur 4C).
- Når alle endringer har blitt gjort, ta en siste titt på sporene og eksportere data (celle forskyvning per tidspunkt, spor lengde, fortrengning lengde, spor varighet etc.) til en Excel-fil (Figur 4D).
5. Representant Resultater
Vi testet og optimalisert widescreen-feltet time-lapse avbildning av neuroblast migrasjon. Viral merking eller pode av fluorescensmerkede neuroblasts i SVZ tillatt for robust GFP uttrykk i migrere celler (figur 2). Multi-bølgelengde bildebehandling kan be påføres visualisere neuroblast migrering sammen andre cellulære elementer i RMS som Dextran TexasRed-fylt blodkar 4 (figur 3 og film 1), astrocytes fluorescensmerkede etter stereotaksiske injeksjon av virus med en glial celle spesifikk promoter (figur 2B) 12, eller spesielt merket astrocytes i transgene dyr.
Bredt-field video-avbildning av neuroblast migrasjon i akutte skiver avslørte saltatory oppførselen migrere neuronal prekursorer sammensatt av to distinkte faser: forskyvning av neuronalt cellelegemét mot ledende prosess atskilt med en stasjonær fase (figur 3, Filmer 1 og 2) . Å pålitelig identifisere varigheten av de stasjonære og trekkende faser og å utlede andre celle migrasjon parametere som hastigheten av forskyvningen (beregnet kun under migreringen faser), ble utført i bildebehandling 3D ved hjelp av en kort oppkjøp intervall (en gang per 15 eller 30 sek). Den nøyaktige identifikasjon av varighetene av de stasjonære og migrasjon faser er avgjørende for den entydige tolkning av data. For eksempel, kan forskjeller i avstanden av migrasjon i en gitt tidsperiode bli indusert enten ved endringer i frekvensen av migrering eller ved modifikasjoner i varigheten eller periodisitet av migrasjon og stasjonære faser. Disse ulike mulighetene ikke kan skilles ved hjelp av lange oppkjøp mellomrom.
Imaris programvare ble brukt til å analysere den migrering av neuroblasts i 3D, og å utlede ytterligere parametere av cellemigrering som spor varighet og spor lengde, samt spor fortrengning lengde, som er en vektor av forskyvningshastigheten. Sporet retthet kan også beregnes ved å dele Beltelengde ved banen fortrengning lengde og det indikerer retthet av den utvandrende ruten for individuell neuroblast.
/ 4061/4061fig1.jpg "/>
Figur 1. Skjematisk fremstilling av utarbeidelse av akutte levende skiver. A) Skjematisk framstilling av en caudal, en intrahemispheric og to sagittale kutt. B) Skjematisk fremstilling av å plassere musen hjernen på agar blokk og plattform for vibratome. C) Skjematisk fremstilling av akutt stykke inkubasjon kammer. D) Skjematisk fremstilling av bildebehandling kammer bygget på stående mikroskop.
Figur 2. Merking av neuroblasts i RMS. A) Lav forstørrelse bilde som viser robust merking av neuroblasts og blodkar i voksen RMS. Et retrovirus koding GFP ble injisert i SVZ, og GFP-uttrykke celler (grønt) ble observert i RMS etter 3 dager (venstre panel). Blodkar ble merket ved å injisere dextran TexasRed inn i hjertet av musen (rød, høyre panel). Det innfelte viser en høy magnificasjon bilde av blodkar og virally merket neuroblasts knyttet blodkar. B) Merking av ulike cellulære elementer i den voksne RMS. Neuroblasts ble merket ved å injisere mCherry-koding lentivirus i SVZ (rød), ble astrocytes merket ved å injisere en lentivirus koding GFP under kontroll av en GFAP arrangøren i RMS (grønn) og blodkar ble merket ved å injisere Dextran CascadeBlue (blå ) i hjertet. C) Skjematisk fremstilling av injeksjon av GAD67-GFP celler dissosiert fra SVZ av en GAD67-GFP mus i SVZ av en voksen vill-type mus. D) transplanterte GAD67-GFP celler (grønn) påvist i RMS 7 dager etter pode i SVZ. RMS er immunostained med GFAP (blå). E) transplanterte GAD67-GFP celler (grønn) var immunopositive for DCX (rød), men var immunonegative for GFAP (blå). Klikk her for å se større figur.
Figur 3. Time-lapse avbildning av neuroblasts. Time-lapse avbildning av neuroblast (grønn) migrasjon langs blodkar (rød). Pilene viser migrasjon fasene av neuroblasts, og pilene angir stasjonære faser.
Figur 4. Analyse av neuroblast migrasjon. (AD) Ulike trinn neuroblasts migrasjon analyse. De røde sirklene viser de forskjellige funksjonene som er nevnt i teksten. Klikk her for å se større figur .
Video 1. Time-lapse avbildning av virally merket neuroblasts (grønn) migrere langs dekstran TexasRed merket blodkar (rød). Cslikke her for å vise video.
Video 2. Sporing neuroblast migrasjon av Imaris programvare. Grønne prikker indikerer celle organer og spor angi avstanden til migrasjon. Klikk her for å se video .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Riktig målretting av nevrale forløpere til de aktuelle områder av hjernen er en fundamental prosess underliggende riktig montering og funksjon av nevrale kretser. Det store flertallet av cellene vandrer under embryonal utvikling og postnatal hjernen bare i noen få regioner, slik som OB, dentate gyrus og lillehjernen, neuronal forskyvning fortsatt finner sted. Mekanismene orkestrering celle migrasjon i postnatal hjernen gjenstår imidlertid, dårlig forstått. Kunnskap om de mekanismer og molekylære stier involvert i å veilede celle migrasjon i modne nervøse vev vil forbedre vår forståelse av neuronal målretting i postnatal hjernen og kan ha klinisk relevans for utvikling av nye strategier for å indusere neuronal rekruttering i syke områder av hjernen.
I dette manuskriptet, beskriver vi en protokoll for overvåking celle migrasjon i akutte skiver av den voksne mus forebrain. Mens vi brukte voksen SVZ-OBsti som modellsystem, kan den samme teknikken kan brukes til å følge cellemigrering i embryonale og tidlig postnatale hjerner samt i den voksne hjernen etter skade. Vi brukte denne protokollen til å følge celle migrasjon i tidlig postnatal 12 RMS, lillehjernen og voksen post-takts striatum (Eiriz, Grade, Malva og Saghatelyan, upubliserte data).
Avbildning av neuroblast migrasjon ble utført ved hjelp akutte levende skiver som tillater celle migrasjon å bli studert i en mikromiljøet som etterligner in vivo forhold. Migrere celler ble visualisert enten ved stereotaksiske injeksjoner av viruspartikler eller ved innpoding neuroblasts fra rapportørgrupper mus inn i SVZ av vill-type mus. Migreringen Analysen ble utført langt fra injeksjonsstedet. Å studere tangential migrasjon i RMS, utarbeidet vi akutte skiver 3-5 dager etter at neuroblasts ble merket. Å studere radial migrasjon i OB, ble skivene forberedt 7-10 dager etter en stereotaxic injeksjon i SVZ. Viral målretting av nevrale forløpere i den voksne SVZ kan også brukes til å studere og modulere faktorer involvert i overføringsprosessen ved upregulating eller downregulating spesifikke molekylære signaler. Det er også mulig å merke forskjellige celletyper i RMS og utføre multi-bølgelengde imaging å rakne mønsteret av neuroblasts migrering sammen tracer fylt blodkar 4, 13 eller langs virally eller genetisk merket astrocytes 2, 12.
Til bilde neuroblast migrasjon brukte vi en motorisert fluorescens oppreist mikroskop utstyrt med en CCD-kamera som tillot relativt raske oppkjøp på ulike z flyene etter korte pulser (30-100msec) av eksitasjon lys. Dette hindret photobleaching og redusert tidsintervallet mellom to påfølgende oppkjøp uten å forstyrre 3D visualisering av neuroblast migrasjon. Andre grupper har brukt confocal eller to-foton mikroskop for å overvåke celle migrasjon i postnatal RMS 14-16. Begge teknikkene har sine fordeler og begrensninger, som i hovedsak relatert til tid og rom resolusjoner problemer. Vi anbefaler å bruke korte intervaller (15-30 sek) mellom suksessive oppkjøp. Nyfødte nevroner har saltatory atferd, og migrasjon faser blir avbrutt av perioder med stillstand som kan være så kort som 4-10 min 4. Gitt denne typen migrasjon, er det viktig å bruke relativt raske kjøp intervaller (15-30 sek) mellom suksessive tidspunkter å pålitelig identifisere begynnelsen og slutten av migrasjon og stasjonære faser. Dette er vanskelig å oppnå når tidsintervallet mellom to suksessive oppkjøp er i størrelsesorden flere minutter. En presis bestemmelse av de stasjonære og migrasjon faser er nødvendig for å entydig definere hastigheten på neuroblast migrasjon, som bør kvantifiseres kun under migreringen fasene 4, 17. Lange oppkjøpet intervaller gjør det mulig å beregne average hastighet som avstanden over en viss periode av tid som også inkluderer stasjonære faser. Endringer i den gjennomsnittlige hastigheten definert av denne metoden, kan imidlertid forårsaket enten av forskjeller i graden av migrasjon (definert kun under migrering faser) eller ved varigheten av den stasjonære og migrasjon faser. Disse forskjellene i oppkjøpet parametere er sannsynlig ligge til grunn de avvik i hastigheter på neuroblasts migrasjon rapportert av ulike grupper. Ved å utføre raske oppkjøp med en 15-30 sek intervall og bestemme frekvensen av migrasjon utelukkende under overføringen faser, beregnet vi en hastighet på migrasjon av 120-150 mikrometer / 4 h, 12, mens andre grupper, som bruker et oppkjøp intervall 3-7 min rapporterte en hastighet på 50-100 mikrometer / 14 h, 15, 18. Den største ulempen med wide-feltet fluoriserende bildebehandling med CCD-kameraer er at det gir lavere romlig oppløsning enn skanning systemer. Men siden migrere neuroblasts har en kompakt morphology med soma og korte ledende prosesser, ikke en lavere romlig oppløsning ikke være til hinder for sikker identifikasjon og sporing av neuroblasts på nivået av cellen organer og selv ledende prosesser (Figur 3 og videoer 1 og 2).
Teknikken vi beskriver her gjør neuroblast migrasjon i en mikromiljøet tett etterligne in vivo forhold som skal analyseres, til samspillet mellom ulike komponenter i RMS skal studere, og hvilke roller disse interaksjonene i neuroblast migrasjon skal undersøkes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av en kanadiske Institutes of Health Research (CIHR) tilskudd til ASJK ble delvis støttet av en Université Laval fellesskap. AS er mottaker av en Canada Research Chair i postnatal neurogenesis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Glucose (ACSF) | EMD | DX0145-3 | |
| NaCI | Sigma | S9625 | |
| KCI | Sigma | P9541 | |
| MgCI2x6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| NaH2PO4xH2O | EMD | SX0710-1 | |
| CaCI2x2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| Dextran TexasRed | Invitrogen | D1864 | |
| Dextran CascadeBlue | Invitrogen | D1976 | |
| Glucose (40X solution) | Sigma | G8769 | |
| Sodium pyruvat | Gibco | 11360-070 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| HBSS | Gibco | 14170-112 | |
| DNase I | Sigma | D-5025 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| BSA | EMD | 2930 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | |
| Ketamine/Xylazine | CDMV | 5230 | |
| Pasteur pipette | VWR | 14672-380 | |
| 15 ml conical tube | Sarstedt | 62.553.205 | |
| 50 ml conical tube | Sarstedt | 62.547.205 | |
| Glass capillaries (stereotaxic injection) | WPI | 4878 | |
| Paraffin oil | EMD | PX0045-3 | |
| Proviodine | Rougier | 65655-1370 | |
| Suture | Stoelting | 50487 | |
| Anafen | CDMV | 11508 | |
| 20 cc Syringe | VWR | SS-20L2 | |
| Petri dish | VWR | 25384-094 | |
| Agar | Laboratoire Mat | AP-0108 | |
| Glue | Permabond | 910 | |
| 95% O2/5% CO2 | Linde | 24068835 | |
| Blade | WPI | 501901 | |
| Nylon mesh | Warner Instruments | 64-0198 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 000.019 | |
| Pipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Nanoliter injector | WPI | B203MC4 | |
| Stereotaxic injection apparatus | WPI | 502900 | |
| Micro drill system | WPI | 501819 | |
| Vibratome | Thermo Scientific | 920110 | |
| Wide-field fluorescent microscope | Olympus | BX61WIF | |
| CCD camera | Photometrics | CS-HQ2-D | |
| Ultra-quiet imaging chamber | Harvard Apparatus | 64-1487 | |
| PH-1 Series 20 heater platform | Harvard Apparatus | 64-0284 | |
| Heating system | Warner Instruments | TC-344B | |
| 40X water immersion objective | Olympus | 1-UM587 | |
| 10X water immersion objective | Olympus | 1-UM583 | |
| Lambda DG-4 | Sutter Instruments | DG-4/OF | |
| MetaMorph software | Molecular Devices | 40000 | |
| Imaris software | Bitplane | BPI-IM70-F1 |
References
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu. Rev. Neurosci. 32, 149-184 (2009).
- Kaneko, N. New neurons clear the path of astrocytic processes for their rapid migration in the adult brain. Neuron. 67, 213-223 (2010).
- Lois, C., Alvarez-Buylla, A. Long-distance neuronal migration in the adult mammalian brain. Science. 264, 1145-1148 (1994).
- Snapyan, M. Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling. J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).
- Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. Blood vessels form a migratory scaffold in the rostral migratory stream. J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).
- Lledo, P. M., Saghatelyan, A. Integrating new neurons into the adult olfactory bulb: joining the network, life-death decisions, and the effects of sensory experience. Trends Neurosci. 28, 248-254 (2005).
- Bolteus, A. J., Bordey, A. GABA release and uptake regulate neuronal precursor migration in the postnatal subventricular zone. J. Neurosci. 24, 7623-7631 (2004).
- Martini, F. J., Valdeolmillos, M. Actomyosin contraction at the cell rear drives nuclear translocation in migrating cortical interneurons. J. Neurosci. 30, 8660-8670 (2010).
- Murase, S., Horwitz, A. F. Deleted in colorectal carcinoma and differentially expressed integrins mediate the directional migration of neural precursors in the rostral migratory stream. J. Neurosci. 22, 3568-3579 (2002).
- Wilcock, A. C., Swedlow, J. R., Storey, K. G. Mitotic spindle orientation distinguishes stem cell and terminal modes of neuron production in the early spinal cord. Development. 134, 1943-1954 (2007).
- Ono, M., Yanagawa, Y., Koyano, K. GABAergic neurons in inferior colliculus of the GAD67-GFP knock-in mouse: electrophysiological and morphological properties. Neurosci. Res. 51, 475-492 (2005).
- Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Astrocytes Control the Development of the Migration-Promoting Vasculature Scaffold in the Postnatal Brain via VEGF Signaling. J. Neurosci. 32, 1687-1704 (2012).
- Bovetti, S. Blood vessels form a scaffold for neuroblast migration in the adult olfactory bulb. J. Neurosci. 27, 5976-5980 (2007).
- Platel, J. C., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in whole-mounts of the subventricular zone. J. Physiol. 586, 3783-3793 (2008).
- Nam, S. C. Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study. J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).
- Kim, Y., Comte, I., Szabo, G., Hockberger, P., Szele, F. G. Adult mouse subventricular zone stem and progenitor cells are sessile and epidermal growth factor receptor negatively regulates neuroblast migration. PLoS One. 4, e8122 (2009).
- Bortone, D., Polleux, F. KCC2 expression promotes the termination of cortical interneuron migration in a voltage-sensitive calcium-dependent manner. Neuron. 62, 53-71 (2009).
- Comte, I. Galectin-3 maintains cell motility from the subventricular zone to the olfactory bulb. J. Cell Sci. 124, 2438-2447 (2011).
