Summary
Bu makale ayrıntıları Multiplex microneedle tabanlı sensör yapımı. Aygıt bir hızlı ve seçici bir şekilde birden fazla analitlerin in situ numune alma ve elektrokimyasal analizi için geliştirilmektedir. Biz klinik tıp tasavvur ve biyomedikal araştırmalar, bu microneedle tabanlı sensörler için kullanır.
Abstract
Biyolojik-ilgili moleküllerin hızlı analiz için minimal invaziv çoğaltılmış izleme sisteminin geliştirilmesi kronik tıbbi durumlar onların ani fizyolojik devletin uyduruk değerlendirmesi muzdarip bireyler sunabilir. Ayrıca, karmaşık ve çok etkenli tıbbi koşulların analizi için bir araştırma aracı olarak hizmet verebilir. Gerçekleştirilecek böyle bir Çoklu Analit sensör amacıyla, kullanıcıya ağrı veya zarar vermeden gerçekleşmesi gerekir interstisyel sıvı örneklenmesi, minimal invaziv olmalı ve analiz hızlı yanı sıra seçici olmalıdır.
Başlangıçta ağrısız ilaç dağıtımı için geliştirilmiş, microneedles deri yoluyla aşı ve farmakolojik ajanlar (örn., insülin) teslim etmek için kullanılmıştır. 1-2 bu cihazlar interstisyel alanına erişmeye beri mikroelektrotla entegre microneedles transdermal olarak kullanılabilir elektrokimyasal sensör. Glukoz, glutamat, laktat seçici algılama, hydrogen peroksit, ve askorbik asit transdüklenmesinden elemanı olarak hizmet veren karbon fiberler, karbon modifiye macunlar, ve platin kaplı polimer microneedles ile entegre microneedle-elektrot cihazlar ile ortaya konmuştur. 3-7,8
Bu microneedle sensör teknolojisi, birden fazla analitlerin yerinde ve eş zamanlı tespiti için yeni ve sofistike analitik yaklaşım sağlamıştır. Multiplexing hızlı ve minimal invazif bir şekilde karakterize etmek aksi zor karmaşık mikroçevrelerde, izleme imkanı sunuyor. Örneğin, bu teknolojinin hücre dışı düzeylerinde eş zamanlı olarak izlenmesi için yararlanılabilir, glukoz, laktat ve pH, 9 önemli metabolik hastalıkların 7,10-14 göstergeleri (örn., kanser proliferasyonu) ve egzersiz indüklenen asidozu olan. 15
Protocol
1. Microneedle Fabrikasyon
- Üç boyutlu modelleme yazılımı Solidworks (Dassault Systemes SA, Velizy, Fransa) kullanarak, bir piramit şeklindeki içi boş microneedle dizisi tasarlamak (Şekil 1). 3-5
- Magics RP 13 yazılım (Materialise NV, Leuven, Belçika) kullanarak microneedle dizi için bir destek yapısı tasarlayın. Destek yapısı reçine imalat sırasında cihaz akmasına izin veriyor ve microneedles dayandığı bir temel sağlar. Örneğin, bir destek yapısı Şekil 1 'de gösterilmiştir.
- Bağlantılı destek ve microneedle dizi dosyaları üretim süreci kontrol Perfactory RP yazılımı (EnvisionTEC GmbH, Gladbeck, Almanya), içine yüklenir. Bu yazılım paketi içinde, fabrikasyon olarak microneedle dizilerin sayısını seçin ve fabrikasyon plaka üzerinde cihazların yerleşimini belirleyecektir.
- Perfactory hızlı pr için 180 mW de ultraviyole modunda çalıştırın kalibrasyonototyping üretim sistemi ve enerji sapma doğrulamak ± 2 mW içinde.
- Imalat tamamlandıktan sonra, 15 dakika isopropanole tablaya gelen microneedle diziler kaldırmak ve geliştirmek. Sıkıştırılmış hava ile dizileri tamamen kuruması ve polimerizasyon sağlamak için Otoflash Postcuring Sistemi (EnvisionTEC GmbH, Gladbeck, Almanya) içinde 50 saniye süreyle, oda sıcaklığında microneedles tedavisi.
- Mikroskobu ile microneedle fabrikasyon Validate ve her microneedle delik içi boş ve engelsiz olduğunu doğrulayın. Tam-imal microneedles Şekil 2 'de gösterilmiştir.
2. Karbon Yapıştır Elektrot Diziler Fabrikasyon
- Delikler kesip oldu düz esnek kablo (21039-0249), altta yatan bireysel adreslenebilir bağlayan bakır teller ortaya çıkarmak için bir 60 W Model 6.75 CO 2 ve raster / vektör lazer sistemi (Universal Laser Systems, Inc, Scottsdale, AZ) kullanın ticari bir kaynağı (Mo elde edilenlex Bağlayıcı Corp, Lisle, IL) (Şekil 3 (A ve B)). Uygun lazer ablasyon tabağa hizalamak için bir jig içinde düz esnek kablolar yerleştirin. Esnek bir kablo yalıtım kısmında 500 um çapındaki oyukları oluşturmak için bir yaklaşım rastering kullanabilir. Ablasyon için Patterns CorelDraw Oluşturuldu (Corel, Ottawa, Ontario) ve lazer sistemine gönderilir.
- 40 psi bir airbrush bu spreyler aseton ile değiştirilmiş yassı esnek kablolar temizleyin. Izopropanol ve deiyonize su ile durulayarak bunları temizleme tamamlayın. Hiçbir yalıtım filmi maruz bakır şeritler üzerinde kaldığı bir mikroskop altında doğrulayın.
- Bir sonraki adım karbon macunlar ambalajlanması için bir holding boşluğu yaratmaktır. Melinex bandı (basınca duyarlı akrilik yapıştırıcı ile tek bir tarafı kaplanmıştır 0.002 "kalınlığında) elektrot ablasyon elektrot şeritler üzerine odaklı şeritler, ve düzgün bir bağlantı sağlamak için 2 dakika için 3000 psi sıkıştırılmış olarak aynı deseni ile ablate edilmektir. Bu case, kavite çapı 750 mikron olduğunu.
- Melinex bant ek bir katman (0.004 "basınca duyarlı akrilik yapıştırıcı ile iki tarafı kaplı kalınlığı) daha sonra tek taraflı yapışkan bant ile aynı desen ablaze ve karbon pasta elektrot dizileri için tahvil microneedle diziler uyumu sonra kullanılır .
3. Fonksiyonel Karbon Pastalar Sentezi ve Elektrot Çürükler ve Paketleme
- Glükoz duyarlı karbon pasta önceki bir tarifi off dayanır ve homojen bir karışım elde edilinceye kadar glukoz oksidaz ve poli (ethylenimine) 2.2 mg 10 mg karıştırılması ile elde edilir. 16 bu karışım, karbon üzerinde rodyum tozu, 60 mg (için % 5 yükleme) ilave edilir. 40 mg mineral yağ ilave edilir ve daha sonra karıştırılır. Macunlar hazırlandıktan sonra bir hafta kadar kullanılır; macunlar ° C'de kullanılıncaya kadar 4 depolanır.
- PH duyarlı karbon pasta karışım% 30 (w / w), mineral yağ ve% 70 (w / w) grafit p ile elde edilirowder. Bölüm 3.4 'de açıklandığı gibi elektrot boşluğuna yapıştırın paketleyin. 0,5 M fosforik asit içinde 10 mM Fast Blue RR diazonyum tuzu (4-benzoilamino-2 ,5-dimethoxybenzenediazonium klorür hemi (çinko klorür) tuz) çözeltisi. 17 yapmak için, paketlenmiş macun elektrot üzerinde bu çözelti, 20 ul damla yerleştirin 30 dakika kendiliğinden Fast Blue PR diazonyum tuzu chemisorb için. Tampon veya deiyonize su kullanılmadığı da deiyonize su ve mağaza ile durulayın.
- Laktat duyarlı karbon pasta önceki bir tarifi off dayanır ve karbon tozu ve laktat oksidaz 2.5 mg üzerinde rodyum 2.5 mg karıştırılması ile elde edilir, beş rotasyon için sonikasyon ile 5 dakika ve vorteks ile 5 dakika arasında değişen. 18
- Hazırlanan düz esnek bir kablo içine modifiye macunlar ambalaj elektrot boşlukları üzerine ilgili macunlar uygulanarak gerçekleştirilir. Mala ve paketi t gibi plastik ince bir parçası (örneğin, plastik bir tartın teknenin bir kenarına) kullanmadüzgün bir yüzey elde edilene kadar o yapıştırın. Fazla macun çıkana kadar ikinci bir temiz ağırlığındaki tekne ile tekrarlayın. Deiyonize su ile yıkayın. Şematik karbon macunlar ambalaj, boşluklar oluşturmak için lazer ablasyon gösteren ve microneedle entegrasyon (bölüm 2 ve 3 açıklanan) Şekil 3'te sunulmuştur.
4. Algılama ve sensör kalibrasyon
- Laktat algılama M fosfat tampon maddesi (pH = 7,5). Şekil 4 (a) laktat saptanması için elektrokatalitik reaksiyon şematik bir içerir -0,15 V sensörünün chronoamperometric tepkisi ölçerek ve 0.1 'de 15 saniye sonra, mevcut kayıt gerçekleştirilir .
- Glikoz algılama -0,05 V sensörünün chronoamperometric tepkisi ölçerek ve 0.1 M fosfat tampon maddesi (pH 7.0) içinde 15 saniye sonra, mevcut kayıt ile benzer bir şekilde gerçekleştirilir. Şekil 4 (b) için elektrokatalitik reaksiyon şematik bir içerir dglikoz etection.
- pH 100 mV / s -0.7 V 0.8 V siklik voltametrik taramaları çalıştıran ve oksidatif pik potansiyeli konumu kaydederek izlenir. PH tespiti için redoks reaksiyon şematik Şekil 5 de gösterilmiştir.
- Glikoz ve laktat sensörleri için kalibrasyon eğrileri ilgili analit arda eklemelerle oluşturulabilir; bölümler 5.1 ve 5.2 'de açıklandığı gibi chronoamperometric ölçümleri her analit eklenmesinden sonra yapmaktadır. Alternatif olarak, sabit bir potansiyel chronoamperometric ölçümleri mevcut stabilizasyonu için her bir analit yanı arasında yeterli bir süre (saniye ~ 10-100) izin verirken karıştırma altında yapılabilir.
- pH kalibrasyon eğrileri 1.0 pH birimi artışlarla 5 ile 8 arasında bilinen bir pH değerleri serisi içinde oksidatif pik potansiyelinin ölçümü pozisyonu ve bölüm 5.3 'te tarif edildiği gibi siklik voltamogramları kayıt tarafından oluşturulabilir.
5.. Temsilcisi Results
Modifiye karbon yapıştırın dolu microneedles ile sakin çözümleri chronoamperometric eğrileri (örneğin, glukoz algılama veya laktat tespiti için) almak, geçerli derhal ilgili algılama potansiyeli başvurusu üzerine düşecektir. Sonunda kararlı bir duruma değerine azalacağı. Bir temsili Sonuç, Şekil 6'da gösterilmiştir; bu sonuç, laktat microneedle az laktat ve kaydın 2 mM ilave elde edildi. Kısaca, her solüsyon laktat eklenmesinden sonra karıştırılmıştır edilmelidir. 15 saniyeden sonra mevcut laktat konsantrasyonu arttıkça artar üzerine; mevcut tepki sonra bilinmeyen bir çözelti içinde laktat konsantrasyonunu belirlemek için kullanılabilir. Alternatif olarak, sürekli izleme artan bir glukoz konsantrasyonu (Şekil 5) içeren bir çözelti için gösterildiği gibi karıştırılan bir çözeltisine (ya da bir akıcı solüsyonu içinde) da kullanılabilir. Yine, mevcut üzerinde artış t artanO glukoz konsantrasyonu bilinmeyen bir çözeltisine glikoz tepkisi standardize etmek için kullanılabilir. Yeterli zaman çözüm stabilize etmek için izin vermek için her başak sonra izin verilmelidir. 0.1 M fosfat tampon içinde pH duyarlı microneedle az siklik voltamogramları 5 ila Şekil 6 'da 8 1 pH birimi artışlarla, dört farklı pH çözümler üzerinde gösterilir. PH artışı ile oksidatif pik potansiyeli kaymalar, bu fenomen pH değeri bir göstergesi olarak kullanılmıştır.
Şekil 1. Solidworks (A) ve destek yapısı (B) gösterir yazdırma ekranı, hazırlandı microneedle dizi STL dosyası görüntüleri.
Şekil 2. Microneedle dizi (A) ve bu dizi içinde tek microneedle (B) elektron mikroskop fotoğrafları tarama.
Şekil 3. Düz esnek kablo takımı şematik. Söz adımları, düz esnek bir kablo (A) değiştirerek (B) desenli çevreler ablasyonu, karbon macun (C) ile doldurulur, ayrıca ikinci bir kesilip alınmış Melinex tabakası ekleyerek ve çiftleşme edilir başlangıçta ablazeydi Melinex tabakası, ilave içerir microneedle dizi (D). büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 4. 0.1 M fosfat tamponu (pH = 7.5) -0.15 V az 15 saniye chronoamperometric taramaları ile laktat duyarlı macun Kalibrasyonu. Laktat, bir 2 mM ek olarak mevcut tekabül her artış.
Şekil 5.
PH duyarlı karbon Şekil 6. Döngüsel voltamogram (CV) 1 pH birimi artışlarla (çamurcun = pH 8.0, yeşil pH = 7.0, mor pH = 6.0, kırmızı pH = 5.0), pH 5-8 üzerinde 0.1 M fosfat tamponunda yapıştırın. Beşinci CV Ag / AgCİ referans ve Pt tel karşı elektrotlar karşılık analizi için kullanıldı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu microneedle bazlı sensörünün tasarım birden fazla cihaz yönlerine üretim öncesi olarak kabul edildi. Gerçek zamanlı olarak saptanması için, bu sensor kullanmak için, algılayıcının tepki süresi düşük olmalıdır; Bu protokolde, her bir test sensörü beş saniyeden altında bir tepki süresi sergiledi. Bu protokolde kullanılan macunlar da elektrot cevabı etkileyebilir elektroaktif biyomoleküllerin içeren vivo ortamlarda içinde seçicilik için seçilmiştir. Bileşimi yapıştırmak için ek olarak, işletim potansiyelleri elektroaktif türler müdahale etkisini en aza indirmek için seçilmiştir. Microneedle dizi başarılı bir şekilde, uygun bir imalat microneedle tasarım ve microneedle materyalin seçimi kapsar. Microneedle ponksiyon cilt yapabiliyorsak bu iki yönünü belirleyecek, fiziksel hasarlardan korumak elektrotlar ve elektrot-doku teması engellemektedir. Bu, bir dış Ag / AgCI ve Pt bakınız not edilmelidirtermesi sayacı elektrotlar ölçümler sırasında kullanılan; insan veya hayvan konu olan bu aygıtın vivo kullanımda, bu elektrot aygıtı içinde birleştirilebilir olduğunu gerektirecektir.
Microneedle tabanlı sensör her bir bileşeni uygun işlevselliği sağlamak için onaylanmalıdır özelliklere sahiptir. Düz esnek bir kablo modifikasyonu sırasında kalite kontrol (Şekil 3 B) yalıtıcı tabaka tamamen lazer ile kesip alma sonra kalaylı bakır tel (Şekil 3) yüzeyine çıkarılır olmasını garanti eder. Lazer ile kesip alma sonra, bakır tel yüzeyinden yalıtkan katman kaldırmak için yetmezliği tamamlanmamış elektriksel temas sonucu düzensiz yanıtına neden olabilir. Lazer ablasyon Melinex bandı bu elektrodun çalışma alanını tanımlayan her açıklığın çapı tutarlı olmasını sağlamak için mikroskop ile incelenmesi gerekir. Lazer ablasyon Melinex teyp boşluklara yapıştırın karbon uygularken,hamur yüzey alanı farklılıklar nedeniyle sinyal değişimleri önlemek için hiçbir fazlalık olmadan tam delik çapına uygun olmalıdır. Mevcut kaydedilmeden önce modifiye karbon macunlar ile chronoamperometric ölçümler sırasında sinyal sınırlayıcı bir değere stabilize gerekir. Bu sonuçlar biraz karıştırma etkiler nedeniyle değişebilir. Microneedle dizilerin Mekanik test sensörü eklenmesi önce yapıldı; önceki bir çalışmada, bizim grup bu diziler insan derisi için bir analog olarak kullanıldığı, domuz deri delme kapasitesine sahip olduğunu göstermiştir 3 microneedle diziler sırasında deformasyon veya kırık yapılmamalıdır. Bu süreçlerin beri cilt penetrasyon elektrot hasara yol açabilir.
Bu protokol, elektro-kimyasal izlenmesi için yeni bir transdermal cihazın yapısı ayrıntılı sahiptir. Biz bireysel adreslenebilir microneedles bir hatta daha fazla sayıda ve tr büyük bir çeşitliliği ile microneedle sensörler içeren gelecekteki çabalar tasavvuransducers. Bu cihaz, insanlarda interstisyel sıvı analizi için dizayn edilmiştir; hayvanlar ile kullanımı da microneedle tasarımına uygun tür spesifik değişiklikler mümkündür. Bu teknoloji ile Future yönlerde bunlarla uzaktan hasta izleme gibi otomatik algılama-ilaçlar için, bir ilaç iletim cihazı ile akuplaj için sınırlı değildir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Sandia Birleşik Sözleşme DE-AC04-94AL85000 altında Enerji Ulusal Nükleer Güvenlik İdaresi Bölümü Belirtilen için Sandia Corporation, Lockheed Martin Şirketi tarafından işletilen MultiProgram laboratuvardır. Yazarlar Sandia Ulusal Laboratuvarı 'Laboratuar fon kabul Araştırma ve Geliştirme (LDRD) programı Directed.
References
- Henry, S., McAllister, D. V., Allen, M. G., Prausnitz, M. R. Microfabricated microneedles: a novel approach to transdermal drug delivery. J. Pharm. Sci. 87, 922-925 (1998).
- Prausnitz, M. R. Microneedles for transdermal drug delivery. Adv. Drug Deliv. Rev. 56, 581-587 (2004).
- Miller, P. R., Gittard, S. D., Edwards, T. L., Lopez, D. M., Xiao, X., Wheeler, D. R., Monteiro-Riviere, N. A., Brozik, S. M., Polsky, R., Narayan, R. J. Integrated carbon fiber electrodes within hollow polymer microneedles for transdermal electrochemical sensing. Biomicrofluidics. 5, 013415-013415 (2011).
- Windmiller, J. R., Zhou, N., Chuang, M. C., Valdés-Ramírez, G., Santhosh, P., Miller, P. R., Narayan, R., Wang, J. Microneedle array-based carbon paste amperometric sensors and biosensors. Analyst. 136, 1846-1851 (2011).
- Windmiller, J. R., Valdés-Ramírez, G., Zhou, N., Zhou, M., Miller, P. R., Jin, C., Brozik, S. M., Polsky, R., Katz, E., Narayan, R., Wang, J. Bicomponent microneedle array biosensor for minimally-invasive glutamate monitoring. Electroanal. 23, 2302-2309 (2011).
- Ricci, F., Moscone, D., Palleschi, G. Ex vivo continuous glucose monitoringwith microdalysis technique: The example of GlucoDay. IEEE Sensors J. 8, 63-70 (2008).
- Zimmermann, S., Fienbork, D., Flounders, A. W., Liepmann, D. In-device enzyme immobilization: Wafer-level fabrication of an integrated glucose. Sens. Actuat. B. 99, 163-173 (2004).
- Miller, P. R., Skoog, S. A., Edwards, T. L., Lopez, D. M., Wheeler, D. R., Arango, D. C., Xiao, X., Brozik, S. M., Wang, J., Polsky, R., Narayan, R. J. Multiplexed microneedle-based biosensor array for characterization of metabolic acidosis. Biomicrofluidics. 88, 739-742 (2012).
- Miller, P. R., Skoog, S. A., Edwards, T. L., Lopez, D. M., Wheeler, D. R., Arango, D. C., Xiao, X., Brozik, S. M., Wang, J., Polsky, R., Narayan, R. J. Multiplexed microneedle-based biosensor array for characterization of metabolic acidosis. Talanta. 88, 739-742 (2012).
- Rofstad, E. K. Microenvironment-induced cancer metastasis. Int. J. Radiat. Biol. 76, 589-605 (2000).
- Vander Heiden, M. G., Cantley, L. C., Thompson, C. B. Understanding the Warburg effect: the metabolic requirements of cell proliferation. Science. 324, 1029-1033 (2009).
- Warburg, O., Wind, F., Negelein, E. The metabolism of tumors in the body. J. Gen. Physiol. 8, 519-530 (1927).
- The Tumour Microenvironment: Causes and Consequences of Hypoxia and Acidity. Novartis Foundation Symposium 240. Goode, J. A., Chadwick, D. J. , John Wiley & Sons, Ltd. (2008).
- Cardone, R. A., Casavola, V., Reshkin, S. J. The role of disturbed pH dynamics and the Na+/H+ exchanger in metastasis. Nature Rev. Cancer. 5, 786-795 (2005).
- Robergs, R. A., Ghiasvand, F., Parker, D. Biochemistry of exercise-induced metabolic acidosis. Am. J. Phys. 287, R502-R516 (2004).
- Wang, J., Liu, J., Chen, L., Lu, F. Highly selective membrane-free, mediator-free glucose biosensor. Anal. Chem. 66, 3600-3603 (1994).
- Makos, M. A., Omiatek, D. M., Ewing, A. G., Heien, M. L. Development and characterization of a voltammetric carbon-fiber microelectrode pH sensor. Langmuir. 26, 10386-10391 (2010).
- Wang, J., Chen, Q., Pedrero, M. Highly selective biosensing of lactate at lactate oxidase containing rhodium-dispersed carbon paste electrodes. Anal. Chem. Acta. 304, 41-46 (1995).
