Summary
Это видео демонстрирует процедур для характеристики человека панкреатических островков использованием гематоксилином и эозином (H & E) и иммуногистохимии (IHC). Поджелудочной разделы с головы, тела и хвоста регионов окрашиваются как H & E и IHC, чтобы определить островок состав эндокринной (инсулин, глюкагон и панкреатический полипептид), ячейка репликации (Ki67), воспалительные инфильтраты (H & E, CD3). Крючковатыми области локализован использованием IHC для панкреатический полипептид.
Abstract
Оценки островок области и цифры и эндокринной клеточного состава в поджелудочной железе взрослого человека варьируют от нескольких сотен тысяч до нескольких миллионов и бета масса колеблется от 500 до 1500 мг 1-3. С этой известной неоднородности, стандартной обработки и окрашивания процедура была разработана таким образом, что поджелудочной регионов были четко определены и островков характеризуются использованием строгих гистопатология и immunolocalization экзаменов.
Стандартизированных процедур обработки поджелудочной железы человека оправился от доноров органов описаны в части 1 этой серии. Поджелудочная железа перерабатывается в 3-х основных регионов (голова, тело, хвост), а затем поперечные срезы. Поперечные сечения из головки поджелудочной железы делятся, как указано в зависимости от размера, и пронумерованы в алфавитном порядке для обозначения подразделов. Такая стандартизация позволяет для полного сечения анализ главы региона, включая крючковатыми область, которая содержит островки состоятв первую очередь панкреатический полипептид клеток хвоста региона.
Нынешний доклад включает в себя части 2 этой серии, и описываются процедуры, используемые для серийных срезов и гистопатологические характеристики поджелудочной парафиновых срезах с акцентом на островковых клеток эндокринной, репликации и Т-клеточные инфильтраты. Патология поджелудочной железы разделы предназначены для характеристики как экзокринной, дуктулярных и эндокринные компоненты. Экзокринной купе оценивается на наличие панкреатита (активный или хронические заболевания), атрофия, фиброз и жир, а также системы воздуховодов, особенно в связи с наличием сахарного внутрипротокового неоплазии 4. Островки оцениваются по морфологии, размеров и плотности, эндокринных клеток, воспаление, фиброз, амилоида, а также наличие тиражирование и апоптоза клеток с использованием H & E и IHC пятна.
Последний компонент описаны в части 2 является предоставление окрашенных слайдовкак с цифровых изображений слайд целом. Оцифрованных слайдов организованы случае и поджелудочной железы в области онлайн-базы данных патологий создания виртуального Биобанк. Доступ к этому онлайн-коллекции в настоящее время обеспечивается в более чем 200 врачей и ученых, участвующих в сахарный диабет 1 типа исследований. Интернет-база данных предоставляет средства для быстрого и полного обмена данными и для исследователей, чтобы выбрать блоки для парафиновых или замороженных серийных срезов.
Protocol
1. Приготовление гистологических срезов для Неокрашенные Разделы
- Установите водяной бане и микротома как для стандартных приготовление гистологических срезов парафином. Используйте положительно заряженные слайдов и предварительно этикетка с номер дела, поджелудочной железы области (образца) и номер слайда. Место парафиновых блоков в микротома патрон с кассетной этикетке на левой стороне.
- Следуйте обычной процедуры, приготовление гистологических срезов, раздел в блоке, пока ткань равномерно встречаются. Подготовить ленту серийных срезов (4 мкм, 3-6 в зависимости от количества необходимых начальных пятна (см. пример заполненной формы, Приложение 1)). Отдельные разделы в ленте, возьмите каждый по порядку, и место на слайдах с целью пронумерованы карандашом. Обозначим, если раздел не используется по нумерации разделов в точном порядке. Поддерживать ту же ориентацию на слайде, которые содержатся в кассету с этикеткой слайд ориентированные влево. Высушите на ночь при комнатной температуре, после чего приступить к появлению пятен или распределения следователей.
- ResEAL поверхности парафинового блока с тонким слоем парафина, чтобы сохранить ткани и архива при комнатной температуре или при -20 ° C.
- Для последующих приготовление гистологических срезов, поддерживать нумерации серийные срезы на каждом уровне, что и выше. Получите 1 дополнительный слайд и пятно на слайд H & E для каждого ~ 100 мкм уровне в рамках каждого блока.
2. H & E Окрашивание
- Поместите первый серийный секционного слайд из каждого блока в режиме слайд-стойки, то в первом лотке на autostainer.
- Выберите стандартный H & E пятно программу и перейти в обычном режиме.
- По окончании окрашивания, удалить слайды из autostainer и место в капоте для coverslipping.
- Покровное использованием стандартной техники. Высохнуть и этикетки с маркировкой (см. раздел 12).
3. IHC Настройка
- Выберите программу, Dako двойного пятна и ввод номеров слайдов. Подготовить TBST и цитрат буферов, антител и других КГНродителей в соответствии с указанными объемами (табл. 1). Загрузите лоток реагентов и слайды. Вращение чистых и сточных линии программируются в соответствии с рекомендациями производителя.
- При выполнении этих тестов вручную, подготовить около томов. Инкубируйте слайды во влажной камере, чтобы избежать высыхания слайды на любом этапе. Выполните ту же процедуру для каждого реагенты, когда она используется для autostainer.
4. IHC депарафинизации и антигена поиска
- Положите слайды в ксилоле в течение 5 минут. Повторите еще раз. Не допускать понижения высохнуть в любой последующий момент, пока обозначены как это приведет к чрезмерному фон и бедными окрашивания.
- Передача слайдов до 100% этилового спирта в течение 2 минут. Повторите еще раз.
- Положите слайды в свежеприготовленного 3% H 2 O 2 в метаноле в течение 10 минут.
- Dip слайдов в 90% этанола, а затем поместить в 90% этаноле в течение 3 минут.
- Передача слайды70% этанола в течение 1 минуты.
- Промыть слайдов в деионизированной воде.
- Разогреть пароход и цитрат в буфер пароход в течение 5 минут.
- Добавить слайды цитрат буфера в пароход и пара в течение 30 минут.
- Немедленно передать слайды к воде и удерживайте ее, пока скользит остыть до комнатной температуры (~ 20 минут).
- Передача слайдов Dako autostainer стойки в соответствии с последовательностью пятна (рис. 1) и запустить программу двойным окрашиванием. Основные этапы программы autostainer перечислены так, что руководство трассы можно дублировать.
5. Первый первичных антител (Ki-67, CD3, панкреатический полипептид)
- Блок слайды с Снайпер решение в течение 15 минут. Мыть два раза TBST.
- Инкубируйте слайды в первичных антител в течение 30 минут. Мыть два раза TBST.
- Инкубируйте с Mach2 антимышиного (Ki-67) или анти-кролик (CD3, панкреатический полипептид) пероксидазой хрена (HRP) полимера на 30 мinutes. Мыть два раза TBST.
- Применение 3,3-диаминобензидина tetrahydrochloride (DAB) в слайды в течение 4 минут. Мыть два раза водой.
- Слайды инкубировали с панкреатический полипептид проводятся на Dako когда его анализировали одновременно и TBST использоваться для всех последующих шагов в то время как остальные слайды инкубируют со вторым набором первичных антител. Кроме того, для ручного анализы, перейдите к разделу 6.
6. Второй первичных антител (инсулин, глюкагон)
- Инкубируйте слайды в Диб в течение 20 минут. Мыть два раза TBST.
- Блок с 10% нормальной козьей сывороткой в 20% окон в авидин TBST (инсулин) или Снайпер (глюкагон) в TBST в течение 20 минут. Мыть два раза TBST.
- Инкубируйте инсулина или глюкагона первичных антител в течение 15 минут. Мыть два раза TBST.
- Инсулин: Инкубируйте слайды в биотинилированного козьего анти-морских свинок в разведении 1:300 в течение 30 минут. Мыть два раза TBST. Инкубируйте со стандартным веКонструктор по ABC-AP реагента в течение 30 минут. Мыть два раза TBST.
- Глюкагон: Инкубируйте слайды в буфере в течение 30 минут с последующим антимышиного щелочной фосфатазы (AP) полимера в течение 30 минут. Мыть два раза TBST.
- В то время как слайды инкубировали в конъюгатов, согреть буфер LPR до комнатной температуры. Добавьте 1 каплю жидкости постоянный красный (LPR) в 3 мл буфера немедленно перед использованием и места в стойке реагент Dako. Инкубируйте слайды в LPC в течение 4 минут. Мыть два раза водой.
- Инкубируйте слайды в гематоксилин в течение 1 минуты. Промыть два раза водой.
- Инкубируйте слайды в TBS рН 7,6 в течение 1 минуты. Промыть два раза водой.
- Выгрузка слайды из DAKO Autostainer.
- Сразу обезвоживают слайды окрашивали панкреатический полипептид. Для всех слайдов двойного окрашенных, сухих, по крайней мере 1 часа, затем обезвоживают.
7. Обезвоживание
- Место скользит в 80% этаноле в течение 1 минуты.
- Опустите слайдов в 95% этанола. Держите слайдов в 95% этаноле в течение 30 секунд.
- Передача слайдов на 100% этанола и удерживайте нажатой клавишу 1 минуту. Повторите.
- Dip слайдов в ксилол.
- Держите слайды в ксилоле в течение 1 минуты. Повторите.
- Сразу установить покровные на слайды, используя cytoseal.
8. Слайд маркировки
- Введите информацию случае выявления в том числе органов и номер блока, пятна, а также дату и печать. Серийный номер раздела не является обязательным для первых пятен слайд каждого блока. Последующие уровни обозначены нумерации.
- Поместите этикетки на слайдах.
9. Сканирование слайдов
- Поместите окрашенных слайдов в лоток сканера и сканировать по приборов.
- Организация слайдов донора и типа ткани (поджелудочной железы, головы, туловища, хвоста, селезенка).
- Архив окрашенных слайды при комнатной температуре и оставшиеся неокрашенными слайды при температуре -20 ° C до использования.
10. RepreseРезультаты ntative
Это окрашивание процедуры были разработаны для сети JDRF для поджелудочной органов доноров с сахарным диабетом (nPOD), чтобы обеспечить базовые характеристики парафина и свежезамороженной блоков. Каждый донор имеет базовые характеристики осуществляется в составе окрашивание в 2 кварталах от каждой области поджелудочной железы (голова, тело и хвост) и селезенки (рис. 1, см. также случай отправки формы, Приложение 1). H & E окрашивание проводится с использованием autostainer запрограммированы как на медицинское учреждение с клиническими класса решений, используемых во всем. В качестве дополнительных блоков доноры подразделяются, у каждого есть слайд приняты для H & E, чтобы показать ткани морфологии. Когда блоки подразделяются вновь, как и для распространения среди исследователей, более глубоких уровнях будут также приняты на слайдах представитель H & E слайды документировать ткани морфология весь блок, а также нумерация серийных срезов на каждом уровне. Витражи слайды помеченыслучае идентификации, поджелудочной железы региона, номер блока, пятна и даты (рис. 2) и сканирования в онлайн патологии системы управления информацией. Представитель изображения с контролем доноров показано на рисунке 3 при низких и высоких увеличениях, чтобы показать ожидаемые результаты после этой процедуры. Слайд окрашенных панкреатический полипептид (D, H) была проверена на другой день с анализа выполняется вручную и показывает уменьшить интенсивность окрашивания гематоксилин контрастирующая окраска. Различия в интенсивности окрашивания первичных антител или контрастирующая окраска между анализов следует избегать, особенно если, используя анализ изображения в противном случае скользит, требуют индивидуальной коррекции цвета для достижения тех же областях ячейки или на счету.
Каждая лаборатория должна рассчитывать на оптимизацию концентрации антител, как много к много вариаций и других реагентов и условия могут повлиять на интенсивность окраски и специфичностью. С приобретением новых REAгоспода, окрашивание процедуры проверки с известными положительные и отрицательные контрольные образцы для достижения той же степени интенсивности окраски, как и бывший реагентов. Дополнительная антител оптимизированы основные nPOD патологии приведены в таблице 2 в качестве справочного источника и были использованы для multilabeling иммунофлюоресценции анализы для конфокальной микроскопии.
Рисунок 1. Dako окрашивания сетки. Эта схема изображена рутинного анализа с nPOD поджелудочной железы донора осуществляется на autostainer Dako. NPOD доноров кодируются с 4-значный идентификационный номер. Два лотка слайде показаны слайды с организованной пятно. Альтернативная конфигурация слайд ожидается в зависимости от количества доноров слайдов. Положительный контроль включает включение известного положительного донора для двух двойных пятен и селезенки донора для Ki-67 и CD3. Отрицательные элементы управления в два раза и включает два SLIде от одного донора поджелудочной железы блок инкубировали с иммуноглобулинов (Ig) от принимающей видов первичных антител и двух слайдов доноров селезенки для инсулина и глюкагона.
Рисунок 2. Представитель двойные окрашенные слайдов. Типичный слайд готовой показан слайд с параметрами маркировки и тканей размещение до цифрового сканирования выполняется.
Рисунок 3. Представитель H & E и IHC пятна в поджелудочной разделов. Разделы из поджелудочной железы взрослой женщины донорского органа (6096-04 Panhead) были окрашены и цифровое сканирование проводили, как описано в протоколе. Изображения были получены с использованием ImageScope программой просмотра всего раздела (AD) и от одного островка (ГБ). Ожидается островок пятна интенсивности на инсулин, глюкагон, панкреатический полипептид и являютсянаблюдается на участках, как BD разделе разъясняются D, что этот блок головки поджелудочной железы содержит небольшую часть крючковатыми региона или вентральной доли поджелудочной железы, как и все островки содержат в основном панкреатический полипептид-положительных клеток. Обратите внимание, что гематоксилин контрастирующая окраска в панели D слишком светлое время гематоксилин контрастирующая окраска интенсивности в В и С являются оптимальными. Панели EH показать островок из спинной доли с ожидаемым распределением β-клеток и α-клеток. Несколько панкреатический полипептид клетки находятся в нижней левой части островка (H). А, Е-Н &E; B, F-Ki67 + инсулин, C, G-CD3 + глюкагон, D, H-панкреатический полипептид. Н.э., 0,2 x, EH-12.8x.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Стандартизация процедур IHC имеет решающее значение для анализа изображений, особенно при использовании компьютерных алгоритмов через большое количество слайдов с течением времени. Процедура IHC окрашивания, описанные в этом докладе, позволит партии анализ образцов данного донора, используя autostainer в течение 8-часового рабочего дня и изменение от предыдущего доклада 5. Оцифрованные целом изображений слайд каждого слайда окрашенных предоставляется nPOD аффилированных следователи через веб-сайте патологии системы. Следователи могут просматривать доноров демографии, лабораторных данных, а также других соответствующих клинических истории наряду с горками и имеют возможность выбирать блоки наиболее подходящим для их исследований (см. http://www.jdrfnpod.org/online-pathology.php для получения дополнительной информации) . Такая система онлайн патологии является "виртуальным Биобанк". Дальнейшее совершенствование этой системы будет осуществляться Wheэтикетки Рэбы слайд включать штрих-код для отслеживания серийных срезов и уровней для каждого блока с конечной целью 3-D реконструкция поджелудочной железы.
Две двойные процедуры окрашивания в основном были выбраны, чтобы определить островок β-клеточного состава (инсулин) совместно с сотовыми репликации (Ki-67), учитывая важность понимания механизмов для взрослых β-клеток в регенерации сахарным диабетом 1 типа 5,6. В качестве второй двойной тест IHC проводится на серийных срезов к первому, каждый островок характеризуется как β-клеток (инсулин) и α-клеточный состав (глюкагон). Кроме того, наличие Т-лимфоцитов (CD3) определяется в сочетании с α-клеток окрашивание по двум основным причинам. В основе T-клеточный аутоиммунных прогрессирования диабета 1 типа, было ясно еще оценил характер инициирующего вещества (вирусные, бактериальные, воспалительных клеток) или состав хронический инфильтрат с Resulважные β-клеток дисфункции и смерти еще не определены (см. обзор в 7,8). Во-вторых, доноры с сахарным диабетом 1 типа имеют также характеризуется дефицитом β-клеток, так что сочетание CD3 и глюкагон пятна обеспечивает идентификацию островков даже тогда, когда β-клеток тяжелые потери 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Авторы благодарят доноров, семей и органов заготовительных организаций, участвующих в этом исследовании и Эмили Монтгомери, Роберт Петрас, Энн-фу, Mitali Agarwal, и Roshan Agarwal за экспертную помощь. Эта работа финансировалась по делам несовершеннолетних исследований диабета Foundation (MC-T.) в поддержку сети поджелудочной доноров органов с диабетом.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30% Hydrogen Peroxide (H2O2) | Fisher Scientific | H325-500 | Endogenous peroxidase blocking |
| ABC-Alkaline Phosphatase (AP) | Vector Laboratories | AK-5000 | AP conjugate |
| Antibody Diluent | Invitrogen | 003218 | Primary antibody |
| Avidin blocker | Vector Laboratories | SP-2001 | Block endogenous biotin |
| Biotinylated Goat anti-guinea pig | Vector Laboratories | BA-7000 | Secondary antibody |
| Bluing Reagent | Fisher Scientific | 7301 | Leica autostainer |
| Citrate buffer, pH 6.0 | BioGenex | HK086-9K | Antigen retrieval |
| Clarifier 1 | Fisher Scientific | 7401 | Leica autostainer |
| Cytoseal XYL | Fisher Scientific | 8312-4 | Coverslip mountant |
| DAB | Vector Laboratories | SK-4100 | HRP chromogen |
| DEEB | Dako | S2003 | Endogenous AP blocking reagent |
| Eosin Y Alcoholic | Fisher Scientific | 71204 | Leica autostainer |
| Ethanols- 100%, 95%, 90%, 70% | Fisher Scientific | Various | Deparaffinization and coverslipping |
| Hematoxylin | Dako | S3301 | Dako autostainer |
| Hematoxylin 7211 | Fisher Scientific | 7211 | Leica autostainer |
| IgG (all host species for primary antibodies) | Various | Various | Negative controls for primaries |
| Liquid Permanent Red (LPR) | Dako | K0640 | AP chromogen |
| Mach2 AP | Biocare Medical | MALP521L | Goat anti-Mouse AP conjugate |
| Mach2 HRP | Biocare Medical | MHRP520L | Goat anti-Mouse HRP conjugate |
| Mach2 HRP | Biocare Medical | RHRP520L | Goat anti-Mouse HRP conjugate |
| Methanol | Fisher Scientific | Various | H2O2 diluent |
| Normal goat serum | Vector Laboratories | S-1000 | IHC blocking reagent |
| Sniper | Biocare Medical | BS966M | IHC blocking reagent |
| TBST 20X | Thermo Fisher Scientific, Inc. | TA-999-TT | IHC buffer |
| Triology 20x | Cell Marque | 920P-06 | Antigen Retrieval |
| Xylene | Fisher Scientific | Various | Deparaffinization and coverslipping |
| Table 1. Specific reagents. | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraffin | |||
| Amylase | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-46657 | Mouse |
| Amylin | Serotec | MCA11267 | Mouse |
| Carbonic anhydrase 19.9 | Abcam | ab15146 | Mouse |
| Caspase-3, cleaved | Cell Signaling Technology | 9961 | Rabbit |
| CD20 | Dako | M0755 | Mouse |
| CD3 | Dako | A0452 | Rabbit |
| CD34 | Cell Signaling Technology | 3569 | Mouse |
| CD4 | Dako | M7310 | Mouse |
| CD45 | Dako | M0754 | Mouse |
| CD68 | Dako | M0876 | Mouse |
| CD8 | Dako | M7103 | Mouse |
| Chromogranin A | Dako | A0430 | Rabbit |
| CK17 | Dako | M7046 | Mouse |
| CK19 | Dako | M0772 | Mouse |
| CK7 | Dako | M7018 | Mouse |
| C-peptide | Cell Signaling Technology | 4593 | Rabbit |
| Foxp3 | e Bioscience | 14-4776-80 | Rat |
| Ghrelin | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-10386 | Goat |
| Ghrelin | Abcam | ab85104 | Rabbit |
| Glucagon | Dako | A0565 | Rabbit |
| Glucagon | Abcam | ab10988 | Mouse |
| Glucagon | Bachem | T-5037 | Guinea Pig |
| Glut-1 | Abcam | ab40084 | Mouse |
| Glut-2 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-9117 | Rabbit |
| Insulin | Dako | A0564 | Guinea Pig |
| Ki-67 | Dako | M7240 | Mouse |
| Mafa | Novus Biological | NB400-137A | Rabbit |
| Pancreatic polypeptide | Invitrogen | 18-0043 | Rabbit |
| Pdx-1 | Abcam | ab47308 | Guinea Pig |
| Proinsulin | Novocastra | NCL-proin-1G4 | Mouse |
| Proinsulin | Developmental Studies Hybridoma Bank | GS-9A8 | Mouse |
| Secretagogin | Sigma-Aldrich | HPA 006641 | Rabbit |
| Smooth muscle actin | Abcam | ab5694 | Rabbit |
| Somatostatin | Dako | A0566 | Rabbit |
| Synaptophysin | Dako | M0776 | Mouse |
| Fresh Frozen | |||
| CD11b | Abcam | ab6332 | Rat |
| CD11c | Serotec | AHP1226 | Rabbit |
| CD25 | Novus Biological | NB 600-564 | Mouse |
| CD94 | Abcam | ab61874 | Mouse |
| GAD65 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-130569 | Mouse |
| HLA-ABC | Dako | M0736 | Mouse |
| Table 2. Primary antibodies. | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aperio Scanscope CS | Aperio Technologies | Digital slide scanner | |
| DAKO Autostainer Plus | Dako | IHC stains | |
| Label Matrix printing software | BioCarta | LM7UP57 | Slide label software |
| Leica XL Autostainer | Leica Microsystems | H&E stains | |
| Premium Coverglass | Fisher Scientific | 12-548-5J | Coverslip |
| Spectrum Information Manager | Aperio Technologies | Scanner software | |
| Superfrost Plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | Positively charged slides |
| Vegetable steamer | Black and Decker | Various | Antigen retrieval |
| Zebra TLP 3742 | CDWG | TLP3742 | Slide label printer |
| Table 3. Specific supplies and equipment. | |||
References
- In't Veld, P., Marichal, M. Microscopic anatomy of the human islet of Langerhans. Adv. Exp. Med. Biol. 654, 1-19 (2010).
- Matveyenko, A. V., Butler, P. C. Relationship between beta-cell mass and diabetes onset. Diabetes Obes. Metab. 10, Suppl . 4. 23-31 (2008).
- Saisho, Y. Pancreas volumes in humans from birth to age one hundred taking into account sex, obesity, and presence of type-2 diabetes. Clin. Anat. 20, 933-942 (2007).
- Hruban, R. H. Pancreatic intraepithelial neoplasia: a new nomenclature and classification system for pancreatic duct lesions. Am. J. Surg. Pathol. 25, 579-586 (2001).
- Campbell-Thompson, M. Pancreatic adenocarcinoma patients with localised chronic severe pancreatitis show an increased number of single beta cells, without alterations in fractional insulin area. Diabetologia. 52, 262-270 (2009).
- Meier, J. Beta-cell replication is the primary mechanism subserving the postnatal expansion of beta-cell mass in humans. Diabetes. 57, 1584-1594 (2008).
- Rowe, P. A., Campbell-Thompson, M. L., Schatz, D. A., Atkinson, M. A. The pancreas in human type 1 diabetes. Semin. Immunopathol. 33, 29-43 (2011).
- Veld, I. n't, P, Insulitis in human type 1 diabetes: The quest for an elusive lesion. Islets. 3, 131-138 (2011).
- van Belle, T. L., Coppieters, K. T., von Herrath, M. G. Type 1 diabetes: etiology, immunology, and therapeutic strategies. Physiol Rev. 91, 79-118 (2011).
