Summary
本视频演示了人体胰腺胰岛细胞用苏木精伊红（H＆E）和免疫组化法（IHC）的鉴定程序。从头部，身体，和尾区域胰腺部分是染色都Ĥ＆é和免疫组化确定胰岛内分泌（胰岛素，胰高血糖素，和胰多肽）组成，细胞复制（Ki67的）和（H＆E，CD3）炎性浸润。钩突地区的本地化使用胰多肽免疫组化。
Abstract
胰岛面积和数字，在成人胰腺内分泌细胞组成的估计各不相同，从几十万到几百万和β的质量范围从500至1500毫克1-3。这个著名的异质性，开发一个标准的加工和染色过程，使胰腺地区进行了明确规定和胰岛细胞的特点，用严格的组织病理学和免疫组化检查。
本系列第1部分中描述的标准化程序处理人体器官捐赠者的胰腺恢复。胰腺被加工成横截面的3个主要地区（头，身，尾）。横截面从胰头进一步划分，如根据大小，按字母顺序和编号表示小节。这种标准化允许的头部区域的一个完整的交叉截面分析包括钩突的区域，其中包含小岛组成主要的胰多肽细胞的尾部区域。
目前的报告，包括本系列的第2部分，介绍了用于强调胰岛内分泌细胞，复制，和T细胞的浸润胰腺石蜡切片连续切片和病理特征的程序。病理学胰腺节的目的是表征两个外分泌腺，胆管，内分泌组件。在的外分泌腺车厢被评为存在胰腺炎（主动或慢性），萎缩，纤维化，脂肪，以及管道系统，特别是在关系到存在的胰腺导管内肿瘤4。评估胰岛形态，大小，密度，内分泌细胞，炎症，纤维化，淀粉样蛋白，并使用H＆E和免疫组化污渍复制或凋亡细胞的存在。
第2部分中描述的最后一个组件是提供彩色幻灯片作为数字化整体幻灯片图像。数字化幻灯片的情况下，在网上创建一个虚拟的生物资料库的病理数据库胰腺地区举办。访问这个网上收集目前提供超过200名医生和1型糖尿病的研究中科学家参与。联机数据库提供了一个快速和完整的数据共享和调查选择石蜡或冰冻连续切片块的手段。
Protocol
1。为不染节的切片
- 成立水浴和标准的石蜡切片切片。正电的幻灯片和前标签使用数量的情况下，胰腺区域（样品）和幻灯片编号。广场左侧的磁带标签的切片机夹头的石蜡块。
- 按照正常切片程序，节成块，直到组织均匀遇到。产生一个连续切片（4μm厚3-6（见案例提交表格， 附录1）根据初期所需的污渍）剪彩。色带单独的章节，以便拿起，和幻灯片的地方用铅笔编号顺序。表示，如果一节是由确切顺序编号部分闲置。保持相同的方向，面向左侧的幻灯片标签的录像带中发现，在幻灯片上。干燥，在室温下过夜，然后进行染色或分配给调查人员。
- RESEAL表面一层薄薄的石蜡组织和归档保存在室温或-20°C的石蜡块
- 对于后续的切片，连续切片保持在上述的每个级别编号。获得1个额外的幻灯片和染色H＆E的幻灯片，每块内每个〜100μM的水平。
2。 H＆E染色
- 然后在第一个托盘上Autostainer自动将第一个串行从每块切片幻灯片在幻灯片机架。
- 选择标准的H＆E染色方案，并像往常一样进行。
- 当完成染色，Autostainer自动删除和地方在引擎盖盖片，幻灯片。
- 盖玻片使用的标准技术。彻底干燥和标签印刷标签（见第12条）。
3。免疫组化设置
- 选择双污渍和幻灯片输入号码Dako公司计划。准备的TBST和柠檬酸缓冲，抗体和其他REAG根据已废除指定的卷（ 见表1）。装入试剂托盘和幻灯片。根据制造商的建议，清洁和废物线旋转编程。
- 如果手动执行这些实验，准备估计量。在湿盒中孵育幻灯片，以避免任何一步干燥的幻灯片。 Autostainer自动时，每个试剂按照相同的程序。
4。免疫组化Deparaffinization和抗原检索
- 在二甲苯5分钟的幻灯片。再重复一次。不要让幻灯片干任何后续点，直到表示，因为这会导致过度的背景和贫困染色。
- 将幻灯片转让100％的乙醇为2分钟。再重复一次。
- 把新鲜配制的3％的H 2 O 2的甲醇在10分钟的幻灯片。
- 在90％的乙醇，然后浸幻灯片放置在90％乙醇为3分钟。
- 转让滑动到70％的乙醇为1分钟。
- 在去离子水冲洗幻灯片。
- 在蒸笼5分钟预热蒸锅和柠檬酸缓冲。
- 添加幻灯片柠檬酸蒸锅中蒸30分钟的缓冲。
- 立即转移幻灯片水，直到滑入冷却至室温（约20分钟）。
- 根据染色序列（ 图1）Dako公司Autostainer自动衣架转让幻灯片和运行双重染色程序。列出Autostainer自动程序的主要步骤，以便手动运行可重复。
5。第一（Ki-67的CD3，胰多肽）抗体
- 阻止狙击手的解决方案为15分钟的幻灯片。用TBST洗两次。
- 初级抗体孵育30分钟的幻灯片。用TBST洗两次。
- MACH2羊抗鼠（Ki-67的）或抗兔（CD3 +，胰多肽）辣根过氧化物酶（HRP）聚合物孵育30中号inutes。用TBST洗两次。
- 3,3 - 二氨基tetrahydrochloride（民建联），4分钟的幻灯片。用清水洗两次。
- 胰多肽孵育的幻灯片举行时，同时测定Dako公司和TBST所有后续步骤使用，而其余的幻灯片与第二组的主要抗体孵育。另外，手动检测，进行到第6条。
6。第二次（胰岛素，胰高血糖素）抗体
- Deeb医师幻灯片孵育20分钟。用TBST洗两次。
- 座与10％，20％的抗生物素蛋白受体阻滞剂在TBST（胰岛素）或狙击手在TBST（胰高血糖素）的正常山羊血清20分钟。用TBST洗两次。
- 孵育15分钟的胰岛素或胰高血糖素抗体。用TBST洗两次。
- 胰岛素：孵育30分钟，在1:300稀释生物素标记的羊抗豚鼠猪的幻灯片。用TBST洗两次。与标准VE孵育构造函数ABC - AP试剂为30分钟。用TBST洗两次。
- 胰高血糖素：孵育缓冲液中的幻灯片，在30分钟，30分钟羊抗鼠碱性磷酸酶（AP）聚合物。用TBST洗两次。
- 虽然幻灯片标记培养，温暖的的LPR缓冲区室温。加入1滴液体永久红（LPR），每3毫升缓冲立即使用前和Dako公司试剂架的地方。在LPC孵育4分钟的幻灯片。用清水洗两次。
- 孵育1分钟的在苏木幻灯片。用清水冲洗两次。
- 在TBS的pH值7.6孵育1分钟的幻灯片。用清水冲洗两次。
- DAKO公司Autostainer自动卸载的幻灯片。
- 立即脱水胰多肽染色的幻灯片。对于所有的双彩色幻灯片，至少1小时，然后干燥脱水。
7。脱水
- 地方滑出80％乙醇1分钟。
- 浸在95％乙醇的幻灯片。 保持在95％乙醇，30秒的幻灯片。
- 幻灯片转移到100％的乙醇，并保持1分钟。重复。
- 二甲苯浸幻灯片。
- 把握在1分钟二甲苯幻灯片。重复。
- 立即安装幻灯片使用cytoseal的盖玻片。
8。幻灯片标签
- 输入的情况下识别信息，包括机关和块数，染色，日期和打印。串行节号是可选的第一张幻灯片，每块污渍。随后水平表示编号。
- 放置在幻灯片上的标签。
9。幻灯片扫描
- 放置在扫描仪的托盘彩色幻灯片，根据仪器和扫描。
- 组织由捐助国和组织类型（胰腺头，身，尾，脾）的幻灯片。
- 在-20°C在室温和任何剩余的未染色幻灯片存档的彩色幻灯片。
10。 representative结果
这些染色程序开发与糖尿病（nPOD）胰腺器官捐赠者提供基线表征石蜡和鲜冻块JDRF网络。每个捐赠者有一个基线特征进行染色从每个胰腺地区的2块（头，身，尾）和脾脏（ 图1中 ，也看到案件提交表格， 附录1）组成。 H＆E染色为临床与临床级的解决方案，用于整个工厂编程Autostainer自动进行。作为额外的捐助块切片，每个人都有为H＆E公司的幻灯片，以显示组织形态。当块切片再次，分配给调查，更深的层次也将有代表性的H＆E幻灯片记录了整个块的组织形态以及编号在每个级别的串行部分幻灯片。彩色幻灯片标记鉴定的情况下，胰腺区域，块数，染色和日期（ 图2）和扫描到网上的病理信息管理系统。从控制捐助国的代表图像显示在低和高放大倍率显示预期的结果，此过程如图3。胰多肽（D，H）的幻灯片染色检测，检测手动执行，并显示减少染色苏木染液强度在不同的日子。初级抗体染色强度或检测染液之间的差异是要避免，特别是如果使用图像分析，否则滑与需要个人色彩校正，以达到同样的细胞领域或计数。
每个实验室应优化很多，很多的变化和其他试剂和条件可能会影响染色强度和特异性抗体的浓度。随着新的收购原因男装，染色程序验证与已知阳性和阴性对照样本，以实现前试剂染色强度相同程度。在nPOD病理核心优化的额外抗体提供作为参考表2中，并已用于免疫荧光共聚焦显微镜检测multilabeling。
图1。 DAKO染色电网。本图描绘了一个从nPOD捐助胰腺上Dako公司Autostainer自动执行常规分析。 nPOD捐助者编码与一个4位数的识别号码。两个滑动托盘显示染色组织的幻灯片。替代幻灯片配置预计取决于捐助幻灯片的数字。阳性对照包括列入已知两个双污渍和捐助者的Ki-67的和CD3脾的积极捐助。阴性对照是双重的，包括两个SLIDES从一个捐助国的胰腺块从捐助者对胰岛素和胰高血糖素脾的主要抗体和两个幻灯片的宿主物种的免疫球蛋白（Ig）的培养。
图2。前进行数字扫描， 代表双彩色幻灯片。一个典型的成品幻灯片显示幻灯片标签参数和组织安排。
图3。代表的H＆E和免疫组化在胰腺癌中的部分污渍。成年女性器官捐赠者的胰腺（6096-04云台）的部分染色和数字扫描在协议执行。图像得到使用的ImageScope观看整个节（AD）和一个小岛（EH）的方案。预计胰岛胰岛素，胰高血糖素和胰多肽，染色强度D节描绘观察部分屋宇署胰头块包含所有胰岛包含主要胰多肽阳性细胞的钩突地区或腹胰叶一小部分。请注意，面板D苏木染液是太轻，而苏木染液强度B和C是最佳的。面板高血压表明，与预期的β细胞和α细胞分布背叶胰岛。一些胰多肽细胞被发现在较低的胰岛（高）的左半部分。 ，E-H &E; B，F - Ki67的胰岛素，C，G - CD3 +胰高血糖素，D，H - 胰多肽。 AD，0.2X的EH-12.8x。
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Discussion
免疫组化标准化程序是图像分析的关键，特别是当使用大量的幻灯片之间随着时间的推移以计算机为基础的算法。在本报告所述的免疫组化染色过程将使一批在8小时工作制Autostainer自动给定的捐赠者的样品的分析和修改是从以 前的报告5。每个彩色幻灯片的全数字化的幻灯片图像可通过基于web的在线病理系统nPOD附属调查。研究人员可以审查与幻灯片一起捐助者的人口统计资料，实验数据，以及其他相关的临床病史，并能够选择块最适合他们的研究（见http://www.jdrfnpod.org/online-pathology.php更多信息） 。这样一个网上的病理系统作为一个“虚拟生物资料库”。进一步改善该系统将实施WHEreby幻灯片标签采用条形码追踪每块连续切片和水平与胰腺的3-D重建的最终目标。
两个双染色程序的主要选择，以确定在演唱会与细胞复制理解成人1型糖尿病5,6β细胞再生机制的重要性（Ki-67的）胰岛β细胞组成（胰岛素）。作为连续切片进行到第一，第二的双重免疫组化法的特点是每个胰岛β细胞（胰岛素）和α-细胞组成（胰高血糖素）。此外，T淋巴细胞（CD3）的存在决定在与α细胞染色主要有两个原因。 T细胞介导的自身免疫性1型糖尿病的进展的基础上已明确表示赞赏尚未启动剂（病毒，细菌，炎症细胞）的性质或慢性的成分渗透与resulTANTβ细胞功能和消亡是尚未确定（7,8审查）。第二，捐助者与1型糖尿病患者的β细胞特征的不足，使CD3和胰高血糖素污渍的组合，确保鉴定胰岛甚至当β细胞的损失是严重的9。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
作者感谢捐助者的家庭和组织的专家协助参与这项研究和刘慧卿蒙哥马利罗伯特Pietras，安富，Mitali阿加瓦尔，罗山阿加瓦尔器官采购。这项工作是由青少年糖尿病研究基金会（MC-T.）对糖尿病患者的胰腺器官捐赠者的网络支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30% Hydrogen Peroxide (H2O2) | Fisher Scientific | H325-500 | Endogenous peroxidase blocking |
| ABC-Alkaline Phosphatase (AP) | Vector Laboratories | AK-5000 | AP conjugate |
| Antibody Diluent | Invitrogen | 003218 | Primary antibody |
| Avidin blocker | Vector Laboratories | SP-2001 | Block endogenous biotin |
| Biotinylated Goat anti-guinea pig | Vector Laboratories | BA-7000 | Secondary antibody |
| Bluing Reagent | Fisher Scientific | 7301 | Leica autostainer |
| Citrate buffer, pH 6.0 | BioGenex | HK086-9K | Antigen retrieval |
| Clarifier 1 | Fisher Scientific | 7401 | Leica autostainer |
| Cytoseal XYL | Fisher Scientific | 8312-4 | Coverslip mountant |
| DAB | Vector Laboratories | SK-4100 | HRP chromogen |
| DEEB | Dako | S2003 | Endogenous AP blocking reagent |
| Eosin Y Alcoholic | Fisher Scientific | 71204 | Leica autostainer |
| Ethanols- 100%, 95%, 90%, 70% | Fisher Scientific | Various | Deparaffinization and coverslipping |
| Hematoxylin | Dako | S3301 | Dako autostainer |
| Hematoxylin 7211 | Fisher Scientific | 7211 | Leica autostainer |
| IgG (all host species for primary antibodies) | Various | Various | Negative controls for primaries |
| Liquid Permanent Red (LPR) | Dako | K0640 | AP chromogen |
| Mach2 AP | Biocare Medical | MALP521L | Goat anti-Mouse AP conjugate |
| Mach2 HRP | Biocare Medical | MHRP520L | Goat anti-Mouse HRP conjugate |
| Mach2 HRP | Biocare Medical | RHRP520L | Goat anti-Mouse HRP conjugate |
| Methanol | Fisher Scientific | Various | H2O2 diluent |
| Normal goat serum | Vector Laboratories | S-1000 | IHC blocking reagent |
| Sniper | Biocare Medical | BS966M | IHC blocking reagent |
| TBST 20X | Thermo Fisher Scientific, Inc. | TA-999-TT | IHC buffer |
| Triology 20x | Cell Marque | 920P-06 | Antigen Retrieval |
| Xylene | Fisher Scientific | Various | Deparaffinization and coverslipping |
| Table 1. Specific reagents. | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraffin | |||
| Amylase | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-46657 | Mouse |
| Amylin | Serotec | MCA11267 | Mouse |
| Carbonic anhydrase 19.9 | Abcam | ab15146 | Mouse |
| Caspase-3, cleaved | Cell Signaling Technology | 9961 | Rabbit |
| CD20 | Dako | M0755 | Mouse |
| CD3 | Dako | A0452 | Rabbit |
| CD34 | Cell Signaling Technology | 3569 | Mouse |
| CD4 | Dako | M7310 | Mouse |
| CD45 | Dako | M0754 | Mouse |
| CD68 | Dako | M0876 | Mouse |
| CD8 | Dako | M7103 | Mouse |
| Chromogranin A | Dako | A0430 | Rabbit |
| CK17 | Dako | M7046 | Mouse |
| CK19 | Dako | M0772 | Mouse |
| CK7 | Dako | M7018 | Mouse |
| C-peptide | Cell Signaling Technology | 4593 | Rabbit |
| Foxp3 | e Bioscience | 14-4776-80 | Rat |
| Ghrelin | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-10386 | Goat |
| Ghrelin | Abcam | ab85104 | Rabbit |
| Glucagon | Dako | A0565 | Rabbit |
| Glucagon | Abcam | ab10988 | Mouse |
| Glucagon | Bachem | T-5037 | Guinea Pig |
| Glut-1 | Abcam | ab40084 | Mouse |
| Glut-2 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-9117 | Rabbit |
| Insulin | Dako | A0564 | Guinea Pig |
| Ki-67 | Dako | M7240 | Mouse |
| Mafa | Novus Biological | NB400-137A | Rabbit |
| Pancreatic polypeptide | Invitrogen | 18-0043 | Rabbit |
| Pdx-1 | Abcam | ab47308 | Guinea Pig |
| Proinsulin | Novocastra | NCL-proin-1G4 | Mouse |
| Proinsulin | Developmental Studies Hybridoma Bank | GS-9A8 | Mouse |
| Secretagogin | Sigma-Aldrich | HPA 006641 | Rabbit |
| Smooth muscle actin | Abcam | ab5694 | Rabbit |
| Somatostatin | Dako | A0566 | Rabbit |
| Synaptophysin | Dako | M0776 | Mouse |
| Fresh Frozen | |||
| CD11b | Abcam | ab6332 | Rat |
| CD11c | Serotec | AHP1226 | Rabbit |
| CD25 | Novus Biological | NB 600-564 | Mouse |
| CD94 | Abcam | ab61874 | Mouse |
| GAD65 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-130569 | Mouse |
| HLA-ABC | Dako | M0736 | Mouse |
| Table 2. Primary antibodies. | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aperio Scanscope CS | Aperio Technologies | Digital slide scanner | |
| DAKO Autostainer Plus | Dako | IHC stains | |
| Label Matrix printing software | BioCarta | LM7UP57 | Slide label software |
| Leica XL Autostainer | Leica Microsystems | H&E stains | |
| Premium Coverglass | Fisher Scientific | 12-548-5J | Coverslip |
| Spectrum Information Manager | Aperio Technologies | Scanner software | |
| Superfrost Plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | Positively charged slides |
| Vegetable steamer | Black and Decker | Various | Antigen retrieval |
| Zebra TLP 3742 | CDWG | TLP3742 | Slide label printer |
| Table 3. Specific supplies and equipment. | |||
References
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