Summary
このビデオでは、ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）と免疫組織化学（IHC）を用いたヒト膵島の特性評価のための手順を示しています。頭、体、尾領域から膵臓のセクションは膵島内分泌物（インスリン、グルカゴン、膵臓ポリペプチド）、細胞複製（Ki67）、および炎症性浸潤（H＆E、CD3）を決定するためにH＆EとIHCの両方で染色されています。鉤状領域は、膵ポリペプチドに対してIHCを使用してローカライズされています。
Abstract
膵島面積と数字および成人ヒト膵臓の内分泌細胞組成の推定値は数十万から500〜1500 mgの1-3に数百万とベータの質量範囲に異なります。この既知の不均一性と、標準処理と染色手順は、膵臓領域を明確に定義されており、島には厳格な組織病理学および免疫学的局在診断を用いて特徴づけたように開発されました。
臓器提供者から回収されたヒト膵臓を処理するための標準的な手順は、このシリーズのパート1で説明されています。膵臓は、横断に続いて3つの主要領域（頭、体、尾）に処理されます。膵臓の頭部からの横断は、サイズに基づいて示されているように、さらに分割し、サブセクションを示すためにアルファベット順に番号が付けられています。この標準化は、構成の小島が含まれている鉤状領域を含む頭部の完全な断面分析を可能にする主に尾部領域、膵ポリペプチドの細胞。
現在のレポートには、このシリーズのパート2を含み、シリアルセクショニングと膵島内分泌細胞、レプリケーション、およびT細胞の浸潤に重点を置いた膵のパラフィン切片の病理組織学的特性評価に使用する手順について説明します。膵臓切片の病理は、外分泌、ductular、内分泌の両方のコンポーネントを特徴づけることを意図しています。外分泌コンパートメントは、特に膵臓の膵管内腫瘍4の存在との関係では、膵炎（アクティブまたは慢性）、萎縮、線維症、脂肪の存在だけでなく、ダクトシステムに評価されます。膵島の形態、大きさ、密度、内分泌細胞、炎症、線維症、アミロイド、およびH＆EとIHC染色を使用して複製またはアポトーシス細胞の有無を評価されます。
パート2で説明した最後のコンポーネントは、染色されたスライドの提供です。デジタル化されたスライド全体のイメージとしての。デジタル化されたスライドは、仮想バイオバンクを作成するオンライン病理データベースの場合、膵臓領域によって構成されています。このオンラインコレクションへのアクセスは現在、1型糖尿病の研究に関与して200以上の臨床医と科学者に提供されています。オンラインデータベースは、迅速かつ完全なデータ共有のために、パラフィンまたは凍結連続切片のブロックを選択するための捜査手段を提供します。
Protocol
1。染色切片用ミクロトーム
- 標準的なパラフィンミクロトーム用として、水浴及びミクロトームを設定します。ケース番号、膵臓領域（サンプル）およびスライド番号を使用して正に荷電したスライドと事前にラベルを使用しています。左側にカセットのラベルを持つミクロトームチャックに配置し、パラフィンブロック。
- 組織が均一に検出されるまでブロックに通常のミクロトームの手順は、セクションに従ってください。連続切片（厚さ4μmの、初期の必要な汚れの数に応じて3-6（ケース提出フォームは、 付録1を参照））のリボンを生成します。リボン内の別のセクションでは、順番にそれぞれをピックアップし、鉛筆で番号順でスライド上の場所。セクションでは、正確な順序でセクション番号を付け、未使用である場合示す。左に向き、スライドラベル付きカセットに見られるように、スライド上の同じ方向を維持します。その後の研究に染色またはディストリビューションに進み、室温で一晩乾燥させます。
- 解像度室温または-20℃で組織し、アーカイブを維持するためにパラフィンの薄い層を有するパラフィンブロックのEAL表面
- その後のミクロトームの場合は、上記のように各レベルで連続切片の番号を維持。 1つの追加のスライドを取得し、各ブロック内の各〜100μMレベルのH＆E染色スライドで。
2。 H＆E染色
- autostainerの最初のトレイに、スライドラック内の各ブロックから最初のシリアル切片スライドを配置します。
- 標準H＆E染色プログラムを選択し、いつものように進みます。
- 染色が終了したら、封入用フードでautostainerと場所からスライドを削除します。
- 標準的な手法を用いてカバースリップ。印刷したラベル（セクション12を参照）で十分とラベル乾燥させます。
3。 IHCセットアップ
- ダブル汚れやスライドの入力番号のダコプログラムを選択します。 TBSTとクエン酸緩衝液、抗体、および他のreagを準備します。指定されたボリューム（ 表1）に従ってエント。試薬トレイとスライドをロードします。清潔で廃棄物の線の回転は、製造元の推奨に従ってプログラムされています。
- 手動でこれらのアッセイを実行する場合は、推定されたボリュームを準備します。任意のステップで乾燥スライドを避けるために、加湿チャンバー内でスライドをインキュベートします。 autostainerに使用する場合は、各試薬は、同じ手順に従ってください。
4。 IHCの脱パラフィンおよび抗原検索
- 5分間、キシレンにスライドを入れてください。一回繰り返します。これは過度の背景と貧しい染色になりますように表示されるまでスライドは、後続の時点で乾燥することはできません。
- 2分間100％エタノールにスライドを移します。一回繰り返します。
- 10分間、メタノールで作りたての3％H 2 O 2のスライドを入れてください。
- ディップ90％エタノールでスライドし、3分間90％エタノールで開催。
- にスライドを転送1分間70％エタノール。
- 脱イオン水でスライドを洗浄します。
- 5分間蒸し器で予熱汽船とクエン酸緩衝液。
- 30分間蒸し器及びスチームのバッファをクエン酸にスライドを追加します。
- すぐに水にスライドを移し、室温（〜20分）にクールにスライドするまで保持します。
- シーケンス（ 図1）染色によるダコautostainerラックにスライドを移し、二重染色プログラムを実行します。 autostainerプログラムの主な手順は、手動実行が複製できるように記載されています。
5。最初の一次抗体（Ki-67の、CD3、膵臓ポリペプチド）
- 15分間スナイパー液でスライドをブロックします。 TBSTで2回洗浄。
- 30分間一次抗体のスライドをインキュベートします。 TBSTで2回洗浄。
- MACH2ヤギ抗マウス（Ki-67の場合）または抗ウサギ（CD3、膵臓ポリペプチド）ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）30ポリマーmでインキュベートinutes。 TBSTで2回洗浄。
- 4分間のスライドに3,3 - ジアミノベンジジン四塩酸塩を（DAB）を適用します。水で2回洗浄する。
- 膵ポリペプチドとインキュベートしたスライドを同時にアッセイされると残りのスライドは、一次抗体の2番目のセットとインキュベートされている間、後続のすべてのステップで使用TBSTダコに開催されています。また、マニュアルアッセイのために、セクション6に進みます。
6。二次抗体（インスリン、グルカゴン）
- 20分間DEEBのスライドをインキュベートします。 TBSTで2回洗浄。
- 20分間TBST（インスリン）またはTBSTでスナイパー（グルカゴン）の20％のアビジンブロッカーで10％正常ヤギ血清でブロックします。 TBSTで2回洗浄。
- 15分間インスリンまたはグルカゴン一次抗体とインキュベートします。 TBSTで2回洗浄。
- インスリンで30分間1:300希釈、ビオチン化ヤギ抗モルモットでインキュベートするスライド。 TBSTで2回洗浄。標準VEでインキュベート30分間のctorのABC-AP試薬。 TBSTで2回洗浄。
- グルカゴン：30分間ヤギ抗マウスアルカリホスファターゼ（AP）ポリマーに続く30分間の間にバッファーでインキュベートするスライド。 TBSTで2回洗浄。
- スライドが抱合体でインキュベートされているが、室温にLPRバッファーを温める。ダコ試薬ラックでの使用および場所の前に即座に3 mLのバッファー当たりの液体の恒久的な赤の1滴（LPR）を追加します。 4分のLPCのスライドをインキュベートします。水で2回洗浄する。
- 1分間ヘマトキシリンでスライドをインキュベートします。水で二回リンスします。
- 1分間TBS pHは7.6でスライドをインキュベートします。水で二回リンスします。
- DAKO Autostainerからスライドをアンロードします。
- すぐに膵ポリペプチドのために染色したスライドを脱水する。少なくとも1時間乾燥したすべての二重染色したスライドについては、その後脱水する。
7。脱水
- 場所は1分間80％エタノールでスライドします。
- 95％エタノールでスライドを浸します。 30秒間95％エタノールでスライドを保持します。
- 100％エタノールにスライドを移し、1分間保持します。繰り返します。
- キシレンのディップスライド。
- 1分間キシレンにスライドを保持します。繰り返します。
- すぐにcytosealを使用してスライドにカバースリップをマウントします。
8。スライドラベル
- 臓器およびブロック番号、染色、および日付プリントなどの場合の識別情報を入力します。シリアルセクション番号は、各ブロックの最初のスライドの汚れはオプションです。それ以降のレベルは番号で表されます。
- スライド上のラベルを配置します。
9。スライドのスキャニング
- スキャナのトレイに染色されたスライドを配置し、計装に従ってスキャンします。
- ドナーと組織型（膵臓の頭部、胴体、尾部、脾臓）でスライドを整理します。
- 室温および-20°Cで、残りの未染色スライドでアーカイブステンドスライド使用するまで。
10。 Representative結果
これらの染色手順は、パラフィンと新鮮凍結ブロックのベースライン特性を提供するために、糖尿病（nPOD）と膵臓の臓器提供者のためのJDRFネットワーク用に開発された。各ドナーは、それぞれの膵臓領域（頭、体、尾）と脾臓（ 図1、ケース提出フォーム、 付録1参照）から2ブロックの染色のベースライン特性で構成行ってきました。 H＆E染色で使用されて、臨床グレードのソリューションを用いた臨床施設のようにプログラムautostainerを使用して行われます。追加のドナーブロックは切片であるので、それぞれの組織形態を表示するにはH＆Eにかかるスライドを持っています。ブロックは、研究者に配布するために、再び区画されている場合は、より深いレベルでは、各レベルで連続切片を番号だけでなく、ブロック全体の組織形態を文書化する代表的なH＆Eのスライドにかかるスライドがあります。染色されたスライドがが付いていますケースの識別、膵臓領域、ブロック番号、染色と日付（ 図2）とオンライン病理情報管理システムにスキャンされます。コントロールのドナーからの代表的なイメージは、この手順は、次の期待される結果を表示するために低域と高倍率の両方で、 図3に示されています。膵ポリペプチド（D、H）で染色したスライドは手動で行い、ヘマトキシリン対比の減少染色強度を示すアッセイを用いて別の日に測定した。一次抗体の染色性の違いか、アッセイの間で対比染色は、個々の色補正が同じセル領域またはカウントを達成するために必要とすると画像解析を使用すると、そうでなければスライドしている場合は、特に避けなければならない。
各研究室では、ロット間の変動やその他の試薬および条件は染色強度と特異性に影響を与える可能性として、抗体濃度を最適化するために想定する必要があります。新しいREAの買収紳士は、染色の手順は、旧試薬と同様に染色強度と同程度を達成するために、既知の正および負の対照サンプルで検証されています。 nPOD病理コアに最適化された追加の抗体は、リファレンス·ソースとして表2に提供されており、共焦点顕微鏡のために免疫蛍光アッセイをmultilabelingために使用されている。
図1。 Dako社は、グリッドを染色する。この回路では、ダコのautostainer上で実行さnPODドナーの膵臓からルーチン分析を示しています。 nPODドナーは、4桁の識別番号でコード化されています。 2つのスライドトレイが染色主催のスライドで表示されます。別のスライドの構成は、ドナーのスライドの番号に応じて期待されています。ポジティブコントロールは、Ki-67とCD3の2つの二重染色およびドナーの脾臓の既知の陽性のドナーの包含が含まれています。ネガティブコントロールは二重で、2枚のSLIを含むDESインスリンとグルカゴンのドナーの脾臓からの一次抗体と2スライドのホスト種からの免疫グロブリン（Ig）とともにインキュベートした一人のドナーの膵臓ブロックから。
図2。デジタルスキャンが実行される前に、 代表的な二重染色したスライド。典型的な完成したスライドは、スライドのラベルパラメータと組織の配置で示されています。
図3。膵臓のセクションの代表的なH＆EとIHC染色。大人の女性の臓器提供者（6096から04頭）の膵臓からのセクションは、プロトコルで説明されて行われ染色し、デジタルスキャンしました。画像は、セクション全体（AD）の一小島（EH）からImageScope表示プログラムを使用して得られた。インスリン、グルカゴン、及び膵ポリペプチドの予想される膵島染色強度はこの膵頭部ブロックはすべての島は、主に膵ポリペプチド陽性細胞が含まれているように鉤状の地域や腹側膵葉の小さな部分が含まれているセクションDの輪郭を描くようにセクションBDを観察した。 BとCのヘマトキシリン対比強度が最適である間、パネルDのヘマトキシリン対比が軽すぎることに注意してください。 EHパネルはβ細胞とα細胞の予想される分布と背葉から膵島を示しています。いくつかの膵ポリペプチド細胞は膵島（H）の左下部分に記載されています。 、E-H &E; B、F-Ki67 +インスリン、C、G-CD3 +グルカゴン、D、H-膵ポリペプチド。 AD、0.2×、EH-12.8x。
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Discussion
IHC手順の標準化は、時間をかけてスライドの多数を越えて、コンピュータベースのアルゴリズムを使用する場合は特に、画像解析のために重要です。このレポートに記載されIHC染色の手順は、8時間の作業日以内にautostainerを使用して、特定のドナーのサンプルのバッチ分析をできるようになり、以前の報告書5から変更されます。各染色されたスライドのデジタル化されたスライド全体のイメージは、Webベースのオンライン病理システムを介してnPOD系の研究者に利用できるようになります。調べでは、（参照スライドと一緒にドナーの人口統計、実験データ、および他の適切な病歴を確認し、彼らの研究に最も適したブロックを選択することができますすることができますhttp://www.jdrfnpod.org/online-pathology.php詳細については、）を。このようなオンラインの病理システムは、 "仮想バイオバンク"としての役割を果たします。このシステムへの更なる改善が実装されますWHErebyスライドラベルは、膵臓の3次元再構築の最終的な目標とし、各ブロックの連続切片とレベルを追跡するためにバーコードが組み込まれています。
2つの二重染色の手順は、主に1型糖尿病5,6の成人β細胞の再生のためのメカニズムを理解することの重要性与えられた細胞複製（Ki-67の）とのコンサートで膵島β-細胞組成物（インスリン）を決定するために選ばれました。第二ダブルIHCアッセイは、最初にシリアルセクションで実行されるように、各膵島のβ細胞（インスリン）とα-細胞組成（グルカゴン）の両方の特徴がある。さらに、T-リンパ球（CD3）の存在は、主に2つの理由α-細胞染色と組み合わせて決定されます。 1型糖尿病の進行におけるT細胞媒介性自己免疫の基礎を明確にresulに潜入まだ開始剤の性質（ウイルス、細菌、炎症性細胞）または慢性の組成を高く評価されている重要β細胞機能不全と死亡は、（7,8日で）まだ定義されています。 β細胞の損失は9重篤な場合でも、CD3およびグルカゴンの汚れ、その組み合わせは、膵島の識別を確実にできるように第二に、1型糖尿病を持つドナーがβ細胞のよく特徴付け欠乏を持っています。
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Disclosures
利害の衝突が宣言されません。
Acknowledgments
著者らは、ドナーの家族や専門家の支援のため、本研究とエミリー·モンゴメリー、ロバートPietras、アンフー、Mitali Agarwalさんと、ロシャンAgarwalさんに関与する臓器調達機関に感謝します。この作品は、糖尿病患者の膵臓の臓器提供者のネットワークをサポートするために青少年糖尿病研究財団（MC-T.）によって資金を供給された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30% Hydrogen Peroxide (H2O2) | Fisher Scientific | H325-500 | Endogenous peroxidase blocking |
| ABC-Alkaline Phosphatase (AP) | Vector Laboratories | AK-5000 | AP conjugate |
| Antibody Diluent | Invitrogen | 003218 | Primary antibody |
| Avidin blocker | Vector Laboratories | SP-2001 | Block endogenous biotin |
| Biotinylated Goat anti-guinea pig | Vector Laboratories | BA-7000 | Secondary antibody |
| Bluing Reagent | Fisher Scientific | 7301 | Leica autostainer |
| Citrate buffer, pH 6.0 | BioGenex | HK086-9K | Antigen retrieval |
| Clarifier 1 | Fisher Scientific | 7401 | Leica autostainer |
| Cytoseal XYL | Fisher Scientific | 8312-4 | Coverslip mountant |
| DAB | Vector Laboratories | SK-4100 | HRP chromogen |
| DEEB | Dako | S2003 | Endogenous AP blocking reagent |
| Eosin Y Alcoholic | Fisher Scientific | 71204 | Leica autostainer |
| Ethanols- 100%, 95%, 90%, 70% | Fisher Scientific | Various | Deparaffinization and coverslipping |
| Hematoxylin | Dako | S3301 | Dako autostainer |
| Hematoxylin 7211 | Fisher Scientific | 7211 | Leica autostainer |
| IgG (all host species for primary antibodies) | Various | Various | Negative controls for primaries |
| Liquid Permanent Red (LPR) | Dako | K0640 | AP chromogen |
| Mach2 AP | Biocare Medical | MALP521L | Goat anti-Mouse AP conjugate |
| Mach2 HRP | Biocare Medical | MHRP520L | Goat anti-Mouse HRP conjugate |
| Mach2 HRP | Biocare Medical | RHRP520L | Goat anti-Mouse HRP conjugate |
| Methanol | Fisher Scientific | Various | H2O2 diluent |
| Normal goat serum | Vector Laboratories | S-1000 | IHC blocking reagent |
| Sniper | Biocare Medical | BS966M | IHC blocking reagent |
| TBST 20X | Thermo Fisher Scientific, Inc. | TA-999-TT | IHC buffer |
| Triology 20x | Cell Marque | 920P-06 | Antigen Retrieval |
| Xylene | Fisher Scientific | Various | Deparaffinization and coverslipping |
| Table 1. Specific reagents. | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraffin | |||
| Amylase | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-46657 | Mouse |
| Amylin | Serotec | MCA11267 | Mouse |
| Carbonic anhydrase 19.9 | Abcam | ab15146 | Mouse |
| Caspase-3, cleaved | Cell Signaling Technology | 9961 | Rabbit |
| CD20 | Dako | M0755 | Mouse |
| CD3 | Dako | A0452 | Rabbit |
| CD34 | Cell Signaling Technology | 3569 | Mouse |
| CD4 | Dako | M7310 | Mouse |
| CD45 | Dako | M0754 | Mouse |
| CD68 | Dako | M0876 | Mouse |
| CD8 | Dako | M7103 | Mouse |
| Chromogranin A | Dako | A0430 | Rabbit |
| CK17 | Dako | M7046 | Mouse |
| CK19 | Dako | M0772 | Mouse |
| CK7 | Dako | M7018 | Mouse |
| C-peptide | Cell Signaling Technology | 4593 | Rabbit |
| Foxp3 | e Bioscience | 14-4776-80 | Rat |
| Ghrelin | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-10386 | Goat |
| Ghrelin | Abcam | ab85104 | Rabbit |
| Glucagon | Dako | A0565 | Rabbit |
| Glucagon | Abcam | ab10988 | Mouse |
| Glucagon | Bachem | T-5037 | Guinea Pig |
| Glut-1 | Abcam | ab40084 | Mouse |
| Glut-2 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-9117 | Rabbit |
| Insulin | Dako | A0564 | Guinea Pig |
| Ki-67 | Dako | M7240 | Mouse |
| Mafa | Novus Biological | NB400-137A | Rabbit |
| Pancreatic polypeptide | Invitrogen | 18-0043 | Rabbit |
| Pdx-1 | Abcam | ab47308 | Guinea Pig |
| Proinsulin | Novocastra | NCL-proin-1G4 | Mouse |
| Proinsulin | Developmental Studies Hybridoma Bank | GS-9A8 | Mouse |
| Secretagogin | Sigma-Aldrich | HPA 006641 | Rabbit |
| Smooth muscle actin | Abcam | ab5694 | Rabbit |
| Somatostatin | Dako | A0566 | Rabbit |
| Synaptophysin | Dako | M0776 | Mouse |
| Fresh Frozen | |||
| CD11b | Abcam | ab6332 | Rat |
| CD11c | Serotec | AHP1226 | Rabbit |
| CD25 | Novus Biological | NB 600-564 | Mouse |
| CD94 | Abcam | ab61874 | Mouse |
| GAD65 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-130569 | Mouse |
| HLA-ABC | Dako | M0736 | Mouse |
| Table 2. Primary antibodies. | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aperio Scanscope CS | Aperio Technologies | Digital slide scanner | |
| DAKO Autostainer Plus | Dako | IHC stains | |
| Label Matrix printing software | BioCarta | LM7UP57 | Slide label software |
| Leica XL Autostainer | Leica Microsystems | H&E stains | |
| Premium Coverglass | Fisher Scientific | 12-548-5J | Coverslip |
| Spectrum Information Manager | Aperio Technologies | Scanner software | |
| Superfrost Plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | Positively charged slides |
| Vegetable steamer | Black and Decker | Various | Antigen retrieval |
| Zebra TLP 3742 | CDWG | TLP3742 | Slide label printer |
| Table 3. Specific supplies and equipment. | |||
References
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- Matveyenko, A. V., Butler, P. C. Relationship between beta-cell mass and diabetes onset. Diabetes Obes. Metab. 10, Suppl . 4. 23-31 (2008).
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