Summary
هذا الفيديو يشرح الإجراءات اللازمة لتوصيف البنكرياس الجزر الإنسان باستخدام الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) والمناعية (IHC). وملطخة أقسام البنكرياس من الرأس والجسم، ومنطقة الذيل من جانب كل من H & E وIHC لتحديد جزيرة تكوين الغدد الصماء (الأنسولين، الجلوكاجون، والبنكرياس ببتيد)، والنسخ الخلية (Ki67)، وتتسرب التهابات (H & E، CD3). يكون موضعيا في المنطقة الكلابي باستخدام IHC للببتيد البنكرياس.
Abstract
تقديرات لمنطقة جزيرة وأرقام والغدد الصماء في البنكرياس تكوين الخلية البشرية الكبار تختلف من مائة ألف إلى عدة نطاقات الشامل عدة ملايين وبيتا من 500 إلى 1-3 ملغ 1500. مع هذا التباين المعروفة، وقد وضعت لتجهيز قياسي، وتلطيخ الاجراء بحيث حددت بوضوح مناطق البنكرياس والجزر تتميز باستخدام التشريح المرضي الدقيق والفحص immunolocalization.
وصفت إجراءات موحدة لمعالجة البنكرياس الإنسان تعافى من المتبرعين في الجزء 1 من هذه السلسلة. تتم معالجة البنكرياس إلى 3 مناطق رئيسية (رأس والجسم، والذيل)، يليه قطاعات عرضية. وتنقسم مزيد من المقاطع العرضية من رأس البنكرياس، كما هو مبين على أساس الحجم، ومرقمة حسب الترتيب الأبجدي للدلالة على الفروع. هذا التوحيد القياسي يسمح للتحليل كامل المقطعية في المنطقة بما في ذلك منطقة رأس الكلابي الذي يحتوي على الجزر تتكونفي المقام الأول من خلايا البنكرياس ببتيد للمنطقة الذيل.
التقرير الحالي يضم الجزء 2 من هذه السلسلة، ويصف الإجراءات المستخدمة لباجتزاء مسلسل وتوصيف الأنسجة من المقاطع البارافين البنكرياس مع التركيز على خلايا الغدد الصماء جزيرة، والنسخ، وتتسرب تي خلية. ويهدف علم الأمراض من الأقسام البنكرياس لتوصيف كل من إفرازات، ductular، ومكونات الغدد الصماء. يتم تقييم مقصورة الاكسوكرين عن وجود التهاب البنكرياس (النشطة أو المزمنة)، وضمور، والتليف، والدهون، فضلا عن نظام لاصق، وخصوصا في العلاقة مع وجود ورم البنكرياس ينترادوكتال 4. يتم تقييم الجزر لمورفولوجيا والحجم والكثافة، وخلايا الغدد الصماء، والتهاب، والتليف، اميلويد، ووجود خلايا تكرار أو أفكارك باستخدام H & E والبقع IHC.
العنصر الأخير هو موضح في الجزء 2 هو توفير الشريحة الملونالصورة الرقمية والصور الشريحة بأكملها. ويتم تنظيم الشرائح الرقمية على حدة والمنطقة البنكرياس في قاعدة بيانات على الانترنت علم الأمراض إنشاء البنك الحيوي الظاهري. ويجري حاليا توفير إمكانية الوصول إلى هذه المجموعة على الانترنت لأكثر من 200 الأطباء والعلماء المشاركين في البحث السكري من النوع 1. قاعدة البيانات على الانترنت يوفر وسيلة لتبادل البيانات السريع والكامل، وعلى المحققين تحديد كتل لالبارافين أو مقاطع المسلسل المجمدة.
Protocol
1. Microtomy لأقسام غير ملوثين
- اقامة الحمام المائي ومشراح كما لmicrotomy البارافين العادي. استخدام الشرائح الموجبة وقبل التسمية مع رقم القضية، منطقة البنكرياس (عينة) ورقم الشريحة. مكان كتلة البارافين في تشاك مشراح مع التسمية كاسيت على الجانب الأيسر.
- اتباع الإجراءات microtomy طبيعي، المقطع إلى كتلة حتى مصادفة موحد النسيج. إنتاج الشريط من المقاطع مسلسل (4 ميكرون سميكة و 3-6 اعتمادا على عدد من البقع المطلوبة الأولي (انظر نموذج تقديم القضية، الملحق 1)). أقسام منفصلة في الشريط، والتقاط كل في النظام، ومكان على الشرائح مع النظام معدودة مع قلم رصاص. دلالة على ما إذا كان القسم غير المستخدمة من قبل ترقيم المقاطع في النظام الدقيق. الحفاظ على التوجه نفسه على الشريحة كما هو موجود في كاسيت مع التسمية الشريحة الموجهة إلى اليسار. تجف بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة ثم المضي قدما في تلطيخ أو توزيع للمحققين.
- الدقةEAL سطح كتلة البارافين مع طبقة رقيقة من البارافين للحفاظ على الأنسجة والأرشيف في درجة حرارة الغرفة أو -20 درجة مئوية.
- لmicrotomy لاحق، والحفاظ على ترقيم مقاطع المسلسل في كل مستوى على النحو الوارد أعلاه. الحصول على 1 شريحة إضافية وصمة عار من قبل شريحة H & E لكل مستوى ~ 100 ميكرومتر داخل كل كتلة.
2. H & E تلطيخ
- وضع أول شريحة مقطوع المسلسل من كل كتلة في رفوف الشريحة ثم في الدرج الأول على autostainer.
- تحديد معيار H & E برنامج وصمة عار والمضي قدما على النحو المعتاد.
- عند الانتهاء من التلوين، وإزالة الشرائح من autostainer ومكان في غطاء محرك السيارة لcoverslipping.
- ساترة باستخدام تقنية قياسية. يجف تماما والتسمية مع تسمية المطبوعة (انظر القسم 12).
3. IHC مجموعة المتابعة
- حدد البرنامج داكو عن البقع المزدوجة وأرقام المدخلات من الشرائح. إعداد TBST وسترات مخازن، والأجسام المضادة، وغيرها من reagالوالدان وفقا للكميات المحددة (الجدول 1). تحميل علبة الكاشف والشرائح. مبرمجة تناوب نظيفة وخطوط النفايات وفقا لتوصيات الشركة الصانعة.
- إذا أداء هذه المقايسات يدويا، وإعداد تقدير الأحجام. احتضان الشرائح في غرفة مرطب لتجنب تجفيف الشرائح في أي خطوة. اتبع نفس الإجراء لكل الكواشف كما هو الحال عندما تستخدم لautostainer.
4. IHC Deparaffinization واسترجاع مستضد
- وضع الشرائح في الزيلين لمدة 5 دقائق. أكرر مرة واحدة. لا تسمح الشرائح لتجف في أي مرحلة لاحقة حتى كما هو مبين هذا سيؤدي في الخلفية بشكل مفرط وتلطيخ الفقراء.
- نقل الشرائح إلى الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 2 دقيقة. أكرر مرة واحدة.
- وضع الشرائح في الطازجة 3٪ O 2 H 2 في الميثانول لمدة 10 دقائق.
- تراجع الشرائح في الايثانول 90٪ ومن ثم وضع في الايثانول 90٪ لمدة 3 دقائق.
- نقل الشرائح إلى70٪ الايثانول لمدة 1 دقيقة.
- شطف الشرائح في دي المتأينة المياه.
- سخن باخرة وسترات العازلة في باخرة لمدة 5 دقائق.
- إضافة شرائح إلى سيترات عازلة في باخرة والبخار لمدة 30 دقيقة.
- نقل على الفور إلى الشرائح المياه وعقد حتى تنزلق بارد إلى درجة حرارة الغرفة (~ 20 دقيقة).
- نقل الشرائح على رفوف autostainer داكو وفقا لتسلسل وصمة عار (الشكل 1) وتشغيل البرنامج تلطيخ مزدوجة. يتم سرد الخطوات الرئيسية لبرنامج autostainer بحيث يدير دليل يمكن تكرار.
5. الأجسام المضادة الأولية الأول (كي-67، CD3، البنكرياس ببتيد)
- منع الشرائح مع حل قناص لمدة 15 دقيقة. غسل مرتين مع TBST.
- احتضان الشرائح في الأجسام المضادة الأولية لمدة 30 دقيقة. غسل مرتين مع TBST.
- احتضان مع Mach2 الماعز المضادة للماوس (كي 67) أو المضادة أرنب-(CD3، البنكرياس ببتيد) حصان الفجل البيروكسيديز (HRP) البوليمر لمدة 30 ساعةinutes. غسل مرتين مع TBST.
- تطبق 3،3-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) على الشرائح لمدة 4 دقائق. تغسل بالماء مرتين.
- ويحتجز الشرائح المحتضنة مع ببتيد البنكرياس على داكو عندما يجري في وقت واحد يعاير وTBST تستخدم لجميع الخطوات اللاحقة في حين يتم تحضين الشرائح المتبقية مع المجموعة الثانية من الأجسام المضادة الأولية. بدلا من ذلك، لفحوصات دليل، انتقل إلى القسم 6.
6. الأجسام المضادة الابتدائية الثانية (الأنسولين، الجلوكاجون)
- احتضان الشرائح في ديب لمدة 20 دقيقة. غسل مرتين مع TBST.
- كتلة مع 10٪ مصل الماعز الطبيعي في مانع أفيدين 20٪ في TBST (الأنسولين) أو القناص (الجلوكاجون) في TBST لمدة 20 دقيقة. غسل مرتين مع TBST.
- احتضان مع الأنسولين أو الأجسام المضادة الجلوكاجون الأولية لمدة 15 دقيقة. غسل مرتين مع TBST.
- الأنسولين: الشرائح في احتضان المعقدة البيروكسيديز خنزير غينيا لمكافحة الماعز في 1:300 تخفيف لمدة 30 دقيقة. غسل مرتين مع TBST. لقد احتضان مع معيارctor ABC-AP كاشف لمدة 30 دقيقة. غسل مرتين مع TBST.
- الجلوكاجون: احتضان الشرائح العازلة في خلال مدة 30 دقيقة تليها الماعز الفوسفاتيز القلوية لمكافحة فأر (ا ف ب) البوليمر لمدة 30 دقيقة. غسل مرتين مع TBST.
- في حين يتم تحضين الشرائح في تقارن، تدفئة العازلة LPR إلى درجة حرارة الغرفة. إضافة 1 قطرة من السائل الأحمر دائم (LPR) لكل العازلة مل 3 فوري قبل الاستعمال ومكان في رف كاشف داكو. احتضان الشرائح في LPC لمدة 4 دقائق. تغسل بالماء مرتين.
- احتضان الشرائح في الهيماتوكسيلين لمدة 1 دقيقة. شطف بالماء مرتين.
- احتضان الشرائح في درجة الحموضة 7.6 TBS لمدة 1 دقيقة. شطف بالماء مرتين.
- تفريغ الشرائح من Autostainer DAKO.
- يذوى فورا الشرائح ملطخة للببتيد البنكرياس. للشرائح كافة ملون مزدوج، جاف لا يقل عن 1 ساعة ثم جفف.
7. جفاف
- مكان ينزلق في الايثانول 80٪ لمدة 1 دقيقة.
- تراجع الشرائح في الايثانول 95٪. عقد الشرائح في الايثانول 95٪ لمدة 30 ثانية.
- نقل الشرائح إلى الإيثانول بنسبة 100٪ والاستمرار على 1 دقيقة. كرر.
- تراجع الشرائح في الزايلين.
- عقد الشرائح في الزيلين لمدة 1 دقيقة. كرر.
- تحميل فورا coverslips على الشرائح باستخدام cytoseal.
8. شريحة وصفها
- أدخل المعلومات بما في ذلك تحديد حالة رقم الجهاز وكتلة، وصمة عار، وتاريخ والطباعة. المسلسل رقم القسم هو اختياري للبقع الشريحة الأولى من كل كتلة. وتدل المستويات لاحق من قبل الترقيم.
- وضع علامات على الشرائح.
9. الشريحة المسح الضوئي
- وضع الشرائح الملون في علبة الماسحة الضوئية وفقا لمسح الأجهزة.
- تنظيم الشرائح وفقا لنوع المانحة والنسيج (رأس البنكرياس، الجسم، والذيل، والطحال).
- الشرائح الأرشيف الملون في درجة حرارة الغرفة، وأية شرائح المتبقية غير ملوثين في -20 درجة مئوية حتى استخدامها.
10. Representative النتائج
وقد وضعت هذه الإجراءات تلطيخ لشبكة JDRF للمانحين الجهاز البنكرياس مع مرض السكري (nPOD) لتوفير توصيف خط الأساس من البارافين وكتل الطازجة والمجمدة. كل جهة مانحة لديها خصائص أساسية يؤديها تتألف من تلطيخ 2 قطعة من كل منطقة البنكرياس (رأس والجسم والذيل) والطحال (الشكل 1، وانظر أيضا قضية استمارة التقديم، الملحق 1). ويجري في تلطيخ H & E باستخدام autostainer المبرمجة بالنسبة للمنشأة الطبية السريرية مع الصف الحلول المستخدمة في جميع أنحاء. كما كتل إضافية من الجهات المانحة هي مقطوع، لكل منها شريحة المتخذة لH & E لاظهار مورفولوجيا الأنسجة. عندما كتل هي مقطوع مرة أخرى، كما لتوزيعها على المحققين، وسوف يكون أيضا مستويات أعمق الشرائح التي اتخذت لH ممثل والشرائح الإلكترونية لتوثيق مورفولوجيا كتلة بأكمله الأنسجة وكذلك ترقيم المقاطع المسلسل على كل مستوى. وصفت الشرائح ملطخةتحديد الحالة، منطقة البنكرياس، وعدد الكتلة، وصمة عار التاريخ (الشكل 2) وفحصها في علم الأمراض على الانترنت نظام إدارة المعلومات. وتظهر الصور ممثل من إحدى الجهات المانحة تحكم في الشكل (3) في كلا تكبير المنخفضة والعالية لإظهار النتائج المتوقعة بعد هذا الإجراء. وكان يعاير والملون الشريحة مع البنكرياس ببتيد (D، H) في يوم آخر مع فحص بشكل يدوي ويظهر انخفاض كثافة تلطيخ من ملون مباين الهيماتوكسيلين. الاختلافات في تلطيخ كثافة الأجسام المضادة الأولية أو ملون مباين بين المقايسات التي ينبغي تجنبها لا سيما إذا كان استخدام تحليل الصور الشرائح خلاف مع شخص تتطلب تصحيح الألوان لتحقيق مجالات نفس الخلية أو التهم الموجهة إليه.
يجب على كل مختبر نتوقع لتحسين تركيز الأجسام المضادة كما الكثير إلى الكثير اختلاف والكواشف وشروط أخرى يمكن أن تؤثر على شدة تلطيخ والتحديد. مع اكتساب الجرمية جديدأيها السادة، يتم التحقق من صحة إجراءات تلطيخ مع عينات معروفة السيطرة الإيجابية والسلبية لتحقيق نفس الدرجة من الحدة وصمة عار كما هو الحال مع الكواشف السابقة. وتقدم الأضداد إضافية الأمثل في صميم علم الأمراض nPOD في الجدول رقم 2 كمصدر مرجعي واستخدمت لmultilabeling المقايسات المناعي للمتحد البؤر المجهري.
الشكل 1. داكو شبكة تلطيخ. هذا تخطيطي يصور تحليل روتيني من البنكرياس المانحة nPOD يقوم على autostainer داكو. وتصنف الدول المانحة nPOD مع رقم الهوية المكون من 4 أرقام. وتظهر الشريحة اثنين من الصواني مع الشرائح التي نظمتها وصمة عار. ومن المتوقع أن تكوينات الشريحة بديلة اعتمادا على عدد من الشرائح المانحة. وتشمل الضوابط الإيجابية إدراج المانحة إيجابية معروفة للبقع 2 المزدوجة والطحال من الجهات المانحة لكي 67 و CD3. ضوابط السلبية هي ذات شقين وتشمل اثنين سليقصر من إحدى الجهات المانحة كتلة البنكرياس حضنت مع الغلوبولين المناعي (IG) من الأنواع المضيفة من الأجسام المضادة الأولية والشرائح اثنين من الطحال المانحة لالانسولين والجلوكاجون.
الشكل 2. ويرد ممثل الشريحة الملون المزدوج. شريحة النهائي نموذجي مع معلمات إنشاء العلامات الشريحة ووضع الأنسجة قبل تنفيذ المسح الضوئي الرقمي.
الشكل 3. وكان ممثل H & E والبقع IHC في الفروع البنكرياس. مقاطع من البنكرياس من متبرع البالغات (6096-04 PanHead) الملون وفحص بالاشعة الرقمية يؤديها كما هو موضح في البروتوكول. وقد تم الحصول على الصور باستخدام برنامج ImageScope عرض من الجزء كامل (AD) و من جزيرة (EH). شدة جزيرة المتوقع وصمة عار للأنسولين، الجلوكاجون، والبنكرياس وببتيدولاحظ لأقسام دينار بحريني كما فيصور الفرع دال أن هذه الكتلة رئيس البنكرياس يحتوي على جزء صغير من منطقة الكلابي أو بطني الفص البنكرياس كما تحتوي على جميع الجزر أساسا البنكرياس ببتيد إيجابية الخلايا. نلاحظ أن ملون مباين هيماتوكسيلين في D لوحة فاتح للغاية في حين أن الهيماتوكسيلين ملون مباين في شدة وباء وجيم هي الأمثل. لوحات EH تظهر جزيرة من الفص الظهرية مع التوزيع المتوقع من الخلايا والخلايا β α. يتم العثور على خلايا البنكرياس قليل ببتيد في الجزء السفلي الأيسر من جزيرة (H). A، E-H والتقييم؛ (ب)، F-Ki67 + الأنسولين، C، G-CD3 + الجلوكاجون، D، H-ببتيد البنكرياس. م، 0.2x، EH-12.8x.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
توحيد الإجراءات IHC أمر حاسم بالنسبة لتحليل الصور، وخاصة عندما تستخدم الكمبيوتر المستندة إلى خوارزميات عبر عدد كبير من الشرائح مع مرور الوقت. والإجراء تلطيخ IHC المبينة في هذا التقرير تسمح تحليل مجموعة من العينات للمانحين نظرا لاستخدام autostainer ضمن يوم العمل 8 ساعات ويتم تعديلها من تقرير سابق 5. جعل الصور الشريحة الرقمية كاملة من كل شريحة الملون المتوفرة لnPOD التابعة للمحققين من خلال نظام إلكتروني عبر الإنترنت علم الأمراض. ويمكن للمحققين مراجعة التركيبة السكانية المانحة، والبيانات المختبرية، وغيرها من التاريخ الطبي ذات الصلة جنبا إلى جنب مع شرائح وقادرون على اختيار القطع الأكثر ملائمة لدراستهم (انظر http://www.jdrfnpod.org/online-pathology.php لمزيد من المعلومات) . مثل هذا النظام علم الأمراض على الانترنت بمثابة "البنك الحيوي الظاهري". إنه سيتم تنفيذ مزيد من التحسين لهذا النظام عرجالتسميات الشريحة reby إدراج قانون نقابة المحامين لمتابعة مسلسل أقسام ومستويات كل لبنة مع الهدف النهائي للتعمير 3-D في البنكرياس.
وقد تم اختيار في المقام الأول على إجراءين تلطيخ مزدوج لتحديد جزيرة β خلايا التكوين (الأنسولين) بالتنسيق مع النسخ الخلوية (كي 67) نظرا لأهمية فهم آليات لتجديد خلايا β الكبار في مرض السكري نوع 1 5،6. كما يتم تنفيذ الثانية مقايسة IHC مرتين على أبواب المسلسل إلى أول، وتتميز كل جزيرة لكلا الخلايا β (الأنسولين) والخلايا α التكوين (الجلوكاجون). وبالإضافة إلى ذلك، يتم تحديد وجود الخلايا اللمفية تي (CD3) بالتزامن مع α خلايا تلطيخ لسببين رئيسيين. وقد تم على أساس تي خلية المناعة الذاتية بوساطة في تطور مرض السكري من النوع 1 تقدير بوضوح حتى الآن عن طبيعة وكلاء بدء (والجرثومية الفيروسية، وخلايا التهابية) أو تكوين مزمن التسلل مع بالنتيجهتانت β-الخلية اختلال وظيفي، وزوال ما زال يتعين تحديد (استعرضت في 7،8). الثانية، والجهات المانحة مع داء السكري نوع 1 لديها نقص اتسمت بكثير من خلايا β بحيث مزيج من CD3 والبقع الجلوكاجون يضمن التعرف على الجزر حتى عندما β خلايا فقدان شديد 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
المؤلفان بالشكر عائلات المانحين والمنظمات الحصول على الأعضاء المشاركين في هذا البحث ومونتغومري إيميلي، Pietras روبرت، فو آن، أغاروال ميتالى، وأغاروال روشان للحصول على مساعدة الخبراء التابعة لها. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة أبحاث السكري الأحداث (MC-T.) لدعم الشبكة للمتبرعين بالأعضاء البنكرياس مع مرض السكري.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
30% Hydrogen Peroxide (H2O2) | Fisher Scientific | H325-500 | Endogenous peroxidase blocking |
ABC-Alkaline Phosphatase (AP) | Vector Laboratories | AK-5000 | AP conjugate |
Antibody Diluent | Invitrogen | 003218 | Primary antibody |
Avidin blocker | Vector Laboratories | SP-2001 | Block endogenous biotin |
Biotinylated Goat anti-guinea pig | Vector Laboratories | BA-7000 | Secondary antibody |
Bluing Reagent | Fisher Scientific | 7301 | Leica autostainer |
Citrate buffer, pH 6.0 | BioGenex | HK086-9K | Antigen retrieval |
Clarifier 1 | Fisher Scientific | 7401 | Leica autostainer |
Cytoseal XYL | Fisher Scientific | 8312-4 | Coverslip mountant |
DAB | Vector Laboratories | SK-4100 | HRP chromogen |
DEEB | Dako | S2003 | Endogenous AP blocking reagent |
Eosin Y Alcoholic | Fisher Scientific | 71204 | Leica autostainer |
Ethanols- 100%, 95%, 90%, 70% | Fisher Scientific | Various | Deparaffinization and coverslipping |
Hematoxylin | Dako | S3301 | Dako autostainer |
Hematoxylin 7211 | Fisher Scientific | 7211 | Leica autostainer |
IgG (all host species for primary antibodies) | Various | Various | Negative controls for primaries |
Liquid Permanent Red (LPR) | Dako | K0640 | AP chromogen |
Mach2 AP | Biocare Medical | MALP521L | Goat anti-Mouse AP conjugate |
Mach2 HRP | Biocare Medical | MHRP520L | Goat anti-Mouse HRP conjugate |
Mach2 HRP | Biocare Medical | RHRP520L | Goat anti-Mouse HRP conjugate |
Methanol | Fisher Scientific | Various | H2O2 diluent |
Normal goat serum | Vector Laboratories | S-1000 | IHC blocking reagent |
Sniper | Biocare Medical | BS966M | IHC blocking reagent |
TBST 20X | Thermo Fisher Scientific, Inc. | TA-999-TT | IHC buffer |
Triology 20x | Cell Marque | 920P-06 | Antigen Retrieval |
Xylene | Fisher Scientific | Various | Deparaffinization and coverslipping |
Table 1. Specific reagents. |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Paraffin | |||
Amylase | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-46657 | Mouse |
Amylin | Serotec | MCA11267 | Mouse |
Carbonic anhydrase 19.9 | Abcam | ab15146 | Mouse |
Caspase-3, cleaved | Cell Signaling Technology | 9961 | Rabbit |
CD20 | Dako | M0755 | Mouse |
CD3 | Dako | A0452 | Rabbit |
CD34 | Cell Signaling Technology | 3569 | Mouse |
CD4 | Dako | M7310 | Mouse |
CD45 | Dako | M0754 | Mouse |
CD68 | Dako | M0876 | Mouse |
CD8 | Dako | M7103 | Mouse |
Chromogranin A | Dako | A0430 | Rabbit |
CK17 | Dako | M7046 | Mouse |
CK19 | Dako | M0772 | Mouse |
CK7 | Dako | M7018 | Mouse |
C-peptide | Cell Signaling Technology | 4593 | Rabbit |
Foxp3 | e Bioscience | 14-4776-80 | Rat |
Ghrelin | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-10386 | Goat |
Ghrelin | Abcam | ab85104 | Rabbit |
Glucagon | Dako | A0565 | Rabbit |
Glucagon | Abcam | ab10988 | Mouse |
Glucagon | Bachem | T-5037 | Guinea Pig |
Glut-1 | Abcam | ab40084 | Mouse |
Glut-2 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-9117 | Rabbit |
Insulin | Dako | A0564 | Guinea Pig |
Ki-67 | Dako | M7240 | Mouse |
Mafa | Novus Biological | NB400-137A | Rabbit |
Pancreatic polypeptide | Invitrogen | 18-0043 | Rabbit |
Pdx-1 | Abcam | ab47308 | Guinea Pig |
Proinsulin | Novocastra | NCL-proin-1G4 | Mouse |
Proinsulin | Developmental Studies Hybridoma Bank | GS-9A8 | Mouse |
Secretagogin | Sigma-Aldrich | HPA 006641 | Rabbit |
Smooth muscle actin | Abcam | ab5694 | Rabbit |
Somatostatin | Dako | A0566 | Rabbit |
Synaptophysin | Dako | M0776 | Mouse |
Fresh Frozen | |||
CD11b | Abcam | ab6332 | Rat |
CD11c | Serotec | AHP1226 | Rabbit |
CD25 | Novus Biological | NB 600-564 | Mouse |
CD94 | Abcam | ab61874 | Mouse |
GAD65 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-130569 | Mouse |
HLA-ABC | Dako | M0736 | Mouse |
Table 2. Primary antibodies. |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Aperio Scanscope CS | Aperio Technologies | Digital slide scanner | |
DAKO Autostainer Plus | Dako | IHC stains | |
Label Matrix printing software | BioCarta | LM7UP57 | Slide label software |
Leica XL Autostainer | Leica Microsystems | H&E stains | |
Premium Coverglass | Fisher Scientific | 12-548-5J | Coverslip |
Spectrum Information Manager | Aperio Technologies | Scanner software | |
Superfrost Plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | Positively charged slides |
Vegetable steamer | Black and Decker | Various | Antigen retrieval |
Zebra TLP 3742 | CDWG | TLP3742 | Slide label printer |
Table 3. Specific supplies and equipment. |
References
- In't Veld, P., Marichal, M. Microscopic anatomy of the human islet of Langerhans. Adv. Exp. Med. Biol. 654, 1-19 (2010).
- Matveyenko, A. V., Butler, P. C. Relationship between beta-cell mass and diabetes onset. Diabetes Obes. Metab. 10, Suppl . 4. 23-31 (2008).
- Saisho, Y. Pancreas volumes in humans from birth to age one hundred taking into account sex, obesity, and presence of type-2 diabetes. Clin. Anat. 20, 933-942 (2007).
- Hruban, R. H. Pancreatic intraepithelial neoplasia: a new nomenclature and classification system for pancreatic duct lesions. Am. J. Surg. Pathol. 25, 579-586 (2001).
- Campbell-Thompson, M. Pancreatic adenocarcinoma patients with localised chronic severe pancreatitis show an increased number of single beta cells, without alterations in fractional insulin area. Diabetologia. 52, 262-270 (2009).
- Meier, J. Beta-cell replication is the primary mechanism subserving the postnatal expansion of beta-cell mass in humans. Diabetes. 57, 1584-1594 (2008).
- Rowe, P. A., Campbell-Thompson, M. L., Schatz, D. A., Atkinson, M. A. The pancreas in human type 1 diabetes. Semin. Immunopathol. 33, 29-43 (2011).
- Veld, I. n't, P, Insulitis in human type 1 diabetes: The quest for an elusive lesion. Islets. 3, 131-138 (2011).
- van Belle, T. L., Coppieters, K. T., von Herrath, M. G. Type 1 diabetes: etiology, immunology, and therapeutic strategies. Physiol Rev. 91, 79-118 (2011).